thị trường Hà Nội
Với mục tiêu ựánh giá khả năng sàng lọc của phương pháp hai ựĩa mới và bước ựầu ựánh giá mức ựộ tồn dư kháng sinh trong Bảng 4.6., 92 mẫu thịt lợn ựược lấy trên các chợ thuộc ba quận huyện Gia Lâm, Hà đông, Hoàn Kiếm ựã ựược lấy và phân tắch theo chiến lược phân tắch ba bước (sàng lọc, hậu sàng lọc và khẳng ựịnh) như hình 3.5. Kết quả sau khi sàng lọc ựồng thời bằng hai phương pháp Hai ựĩa mới và Premi-Test phát hiện 24 mẫu nghi ngờ chứa kháng sinh (chiếm khoảng 26%), trong số ựó có 12 mẫu ựược phát hiện bởi cả hai phương pháp phương pháp hai ựĩa mới và phương pháp premi-test, 10 mẫu khác chỉ ựược phát hiện bởi phương pháp hai ựĩa và 2 mẫu chỉ ựược phát hiện bởi Premi-Test (hay nói cách khác, trong 14 mẫu ựược phát hiện bởi premi-test có 2 mẫu không ựược phương pháp hai ựĩa mới phát hiện).
Kết quả sàng lọc mẫu trong nghiên cứu này thấp hơn kết quả nghiên cứu tồn dư kháng sinh trong thịt lợn vùng ựồng bằng sông Hồng thực hiện vào năm 2009-2010, tỷ lệ mẫu thịt lợn nghi ngờ chứa kháng sinh sau bước sàng lọc là 39% (Dang và cs., 2013) [28].
Bảng 4.6. Kết quả sàng lọc tồn dư kháng sinh trong thịt lợn ựược lấy tại một số chợ trên ựịa bàn thành phố Hà Nội
Phương pháp hai
ựĩa mới Premi-Test Tắnh chung* Quận/huyện Số mẫu sàng lọc (mẫu) Số mẫu nghi ngờ (mẫu) Tỷ lệ nghi ngờ (%) Số mẫu nghi ngờ (mẫu) Tỷ lệ nghi ngờ (%) Số mẫu nghi ngờ (mẫu) Tỷ lệ nghi ngờ (%) Gia Lâm 34 9 26,47 6 17,65 10 29,41 Hà đông 28 6 21,43 5 17,86 7 25,00 Hoàn Kiếm 30 7 23,33 3 10,00 7 23,33 Tắnh chung 92 22 23,91 14 15,22 24 26,09
* Mẫu nghi ngờ là mẫu ựược phát hiện bởi ắt nhất một trong hai phương pháp Kết quả sàng lọc tồn dư kháng sinh trong thịt lợn trong bảng 4.6 cũng cho thấy tỷ lệ nghi ngờ các mẫu có chứa kháng sinh hai nhóm Tetracylines và
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 51
Quinolones ựối với tất cả các mẫu sàng lọc của phương pháp hai ựĩa mới là 23,91% cao hơn hẳn so với tỷ lệ nghi ngờ của các mẫu chứa hai nhóm kháng sinh trên là 15,22%. điều này một lần nữa khẳng ựịnh tắnh ưu việt của phương pháp hai ựĩa mới trong phát hiện kháng sinh hai nhóm Tetracylines và Quinolones so với phương pháp Premi-Test.
4.4.2. Kết quả ựịnh nhóm và ựịnh lượng tồn dư Tetracycline và Quinolones trong mẫu thịt lợn ựược lấy trên thị trường Hà Nội
để có ựịnh hướng cho phân tắch khẳng ựịnh, các mẫu nghi ngờ có chứa kháng sinh sau bước sàng lọc ựược phân tắch ựịnh nhóm bằng phương pháp Tetrasensor (phát hiện các kháng sinh nhóm Tetracyclines) và ELISA (phát hiện các kháng sinh nhóm Quinolones).
Bảng 4.7. Kết quả phân tắch ựịnh nhóm Tetracyclines
TT Ký hiệu mẫu Kết quả ựịnh nhóm tetracycline LC-MS khẳng ựịnh Tetracyclines Kết luận 1 GL-6 +
Chlortetracycline & 4 epi-
Chlortetracycline <LOQ Oxytetracycline (812) 4 epi-
Oxytetracycline (165)
Không ựạt yêu cầu
2 GL-13 + Vết đạt yêu cầu
3 HK-36 + Chlortetracycline & 4 epi-
Chlortetracycline <LOQ đạt yêu cầu
4 HK-47 +
Tetracycline & epi-tetracycline < LOQ Chlortetracycline (180) 4epi-
Chlortetracycline (113)
Không ựạt yêu cầu
5 Hđ-77 + Vết đạt yêu cầu
6 GL-22 + Chlortetracycline & 4 epi-
Chlortetracycline <LOQ đạt yêu cầu
7 Hđ-82 + Chlortetracycline (150) 4epi-
Chlortetracycline ( 83) Không ựạt yêu cầu
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 52
Kết quả ựịnh nhóm cho thấy, trong số 24 mẫu thịt lợn nghi ngờ có chứa kháng sinh, phát hiện 8 mẫu chứa Tetracycline (Bảng 4.7) và 6 mẫu chứa (fluoro)quinolone (Bảng 4.8).
Các mẫu sau khi ựịnh nhóm ựược phân tắch khẳng ựịnh bằng phương pháp phân tắch khối phổ cho thấy trong số 8 mẫu chứa Tetracycline có 3 mẫu chứa Tetracycline và dẫn xuất của nó cao hơn giới hạn tồn dư cho phép theo qui ựịnh của EU cũng như Bộ y Tế Việt Nam. Cụ thể ba mẫu GL-6, HK-47 và Hđ-82 ựược khẳng ựịnh không ựạt yêu cầu.
GL-6 chứa cả Chlortetracycline và Oxytetracycline, trong ựó riêng Oxytetracycline và dẫn xuất của nó ựã vượt quá ngưỡng tồn dư tối ựa cho phép (812 ppb Oxytetracycline và 165 ppb 4 epi-Oxytetracycline).
Mẫu HK-47 chứa cả Tetracycline và Cholotetracycline, trong ựó chỉ riêng Chlortetracycline ựã vượt quá giới hạn cho phép (180 ppb chlortetracycline và 113 ppb dẫn xuất 4 epi-Chlortetracycline).
Mẫu HD-82 chứa Chlortetracycline và dẫn xuất 4 epi-Chlortetracycline ở nồng ựộ lần lượt là 150 và 83ppb.
Trong khi ựó, ựối với nhóm Quinolones, trong số 6 mẫu bị phát hiện bởi phương pháp ELISA, chỉ có một mẫu ựược khẳng ựịnh có chứa Quinolone ở nồng ựộ cao hơn trên 10 lần so với qui ựịnh (mẫu GL-3 chứa 573 ppb Enrofloxacine và 642 ppb Ciprofloxacin) (bảng 4.8).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 53
Bảng 4.8. Kết quả phân tắch ựịnh nhóm Quinolones
TT Ký hiệu mẫu ELISA ựịnh nhóm (fluoro) Quinolones LC-MS khẳng ựịnh (fluoro)quinolone Kết luận
1 GL-17 0.4 <LOD đạt yêu cầu
2 HK-48 0.4 <LOD đạt yêu cầu
3 GL-3 147.5 enrofloxacine (573)
ciprofloxacine (642) Không ựạt yêu cầu
4 HK_60 0.7 Enrofloxacin (vết, < LOQ) đạt yêu cầu
5 Hđ-88 0.6 Enrofloxacin (vết, < LOQ) đạt yêu cầu
6 Hđ-78 0.8 Enrofloxacin & nalidixic acid
(vết, < LOQ) đạt yêu cầu
LOQ=12,5ppb ựối với Enrofloxacine và Ciprofloxacine
để khẳng ựịnh khả năng sàng lọc của phương pháp hai ựĩa mới ngoài khẳng ựịnh các mẫu nghi ngờ, trong nghiên cứu này còn kiểm tra lại các mẫu ựạt yêu cầu sau khi qua bước sàng lọc. Trong số 70 mẫu ựạt yêu cầu ở bước sàng lọc, 15 mẫu ựược chọn ngẫu nhiên ựể phân tắch kiểm tra kháng sinh hai nhóm tetracycline và quionolones trực tiếp bằng phương pháp khối phổ. Kết quả cho thấy chỉ có 3 mẫu phát hiện chứa kháng sinh nhóm Tetracycline và Quinolones, tuy nhiên cả ba mẫu ựều ựược khẳng ựịnh tồn dư ở nồng ựộ rất thấp. Cụ thể, 1 mẫu phát hiện tồn dư kháng sinh Oxytetracycline và dẫn xuất của nó với hàm lượng 15,56 ppb Oxytetracycline và vết 4 epi-Oxytetracycline). Hai mẫu khác phát hiện chứa Enrofloxacine, Ciprofloxacine ở nồng ựộ nhỏ hơn giới hạn ựịnh lượng của phương pháp khối phổ (LOQ =12,5 ppb).
Như vậy, kết quả ựánh giá khả năng sàng lọc các mẫu củng cố, các mẫu thực và so sánh với các phương pháp khác ựã khẳng ựịnh khả năng sàng lọc của phương pháp hai ựĩa mới ựối với hai nhóm kháng sinh này là tương ựối tốt, ựáp ứng yêu cầu của một phương pháp sàng lọc.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 54
PHẦN THỨ NĂM: KẾT LUẬN VÀ đỀ NGHỊ 5.1 Kết luận
Kết quả của Test ựối chứng cho thấy chủng Bacillus subtilis ở môi trường pH6 hoàn toàn thắch hợp và có khả năng phát hiện tốt với hai nhóm kháng sinh Tetracylines và Quinolones.Ngưỡng phát hiện của phương pháp ựối với các kháng sinh thử ựều nhỏ hơn so với giá trị giới hạn tồn dư tối ựa theo Qui ựịnh 37/2010/CE và Quyết ựịnh số 46/2007/Qđ-BYT của Bộ Y Tế. Các thông số ựộ xác thực, ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu của phương pháp hai ựĩa mới ựáp ứng ựược tiêu chắ giới hạn phát hiện của một số phương pháp sàng lọc ựược quy ựịnh trong Quyết ựịnh 2002/657/EC của Ủy ban Châu Âu.
Phương pháp hai ựĩa mới có khả năng phát hiện kháng sinh trong các mẫu thịt ựược củng cố kháng sinh và các mẫu lấy trên thị trường cho kết quả tốt hơn phương pháp Premi-Test trong cả hai trường hợp mẫu qua tách chiết và không qua tách chiết.
Kết quả kiểm tra một số kháng sinh thuộc nhóm Tetracylines của phương pháp hai ựĩa mới và kit phân tắch ựặc hiệu Tetrasensor ở ngưỡng quan tâm cho thấy khả năng phát hiện của hai ựĩa mới tuy có thấp hơn so với kắt Tetrasesor nhưng ựều có khả năng phát hiện ở ngưỡng nhỏ hơn giới hạn tồn dư tối ựa cho phép theo qui ựịnh, kết quả này cũng một lần nữa khẳng ựịnh ngưỡng phát hiện của phương pháp hai ựĩa mới.
Kết quả thử nghiệm phương pháp hai ựĩa mới trên ựịa bàn Hà Nội cho thấy các mẫu sau khi ựược kiểm tra bằng phương pháp hai ựĩa mới ựều ựạt yêu cầu ở bước sàng lọc một lần nữa khẳng ựịnh khả năng phát hiện của phương pháp hai ựĩa mới có khả năng thực hiện trong ựiều kiện môi trường phòng thắ nghiệm ở Việt Nam.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 55
5.2 đề nghị
Như ựã trình bày ở nội dung trên, phương pháp hai ựĩa mới là một phương pháp có hiệu quả cao, ưu việt trong khả năng sàng lọc một số nhóm kháng sinh so với các phương pháp sàng lọc khác, vì vậy Nhà nước, các cơ quan có chức năng, nhiệm vụ trong kiểm dịch cũng như trong quản lý VSATTP, các Viện nghiên cứu và các phòng thắ nghiệm cần tiếp tục ựầu tư, nghiên cứu ựể ứng dụng rộng rãi trong thực tiễn.
Ngoài ra, do hạn chế về thời gian và kinh phắ nên nghiên cứu này mới chỉ khảo sát khả năng phát hiện hai nhóm kháng sinh (Tetracycline và Quinolones) trong thịt lợn nên cần khảo sát khả năng phát hiện tồn dư các nhóm kháng sinh khác, trong các loại mẫu khác (thịt gà, tôm, cá, Ầ.).
Thêm nữa, ựề tài này mới chỉ tập trung nghiên cứu trong phạm vi Hà Nội, vì vậy phương pháp hai ựĩa mới cần tiếp tục mở rộng nghiên cứu trên các vùng và ựịa phương khác nhau ựặc biệt là các vùng, ựịa phương có ngành chăn nuôi phát triển như ựồng bằng sông Cửu Long, vùng đông Nam Bộ, thành phố Hồ Chắ Minh và các tỉnh như Bình Dương, Bình Phước, đồng NaiẦ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Võ Trà An, Nguyễn Ngọc Tuân, Nguyễn Như Pho (2001). Tình hình sử dụng kháng sinh và dư lượng kháng sinh trong thịt gà tại Thành phố Hồ Chắ Minh. Tạp chắ Khoa học Kỹ thuật Thú y, tập IX (số 2), tr53-57
2. Phạm Kim đăng, Guy Degand, Guy Maghuin Ờ Rogister, Marie - Louise Scippo (2008). Ứng dụng phương pháp ELISA ựể phân tắch tồn dư kháng sinh nhóm Quinolones trong tôm tại một số tỉnh ven biển phắa Bắc, Tạp chắ Khoa học và Kỹ thuật, đHNN HN, Tập VI, Số 3; Tr 261 Ờ 267.
3. Phạm Kim đăng, Guy Degand, Guy Maghuin Ờ Rogister, Marie - Louise Scippo (2009). Thắch ứng phương pháp vi sinh vật ựể phát hiện tồn dư kháng sinh trong tôm ở Việt Nam, kết quả nghiên cứu khoa học chương trình hợp tác liên ựại học (1997 - 2007). Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, tr.93 Ờ 106.
4. Phạm Kim đăng, Marie-Louise Scippo, Guy Degand, Caroline Douny, Guy Maghuin- Rogister (2007), Chuẩn hóa phương pháp sàng lọc ựịnh tắnh kiểm soát tồn dư kháng sinh trong thực phẩm có nguồn gốc ựộng vật theo quy ựịnh 2002/657/EC, Tạp chắ Khoa học và Kỹ thuật, đHNN HN, Tập V, số 1, 24-30.
5. Lê Thị Ngọc Diệp (2003). Một số kết quả khảo sát tình hình sử dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi gà và tồn dư kháng sinh trong thịt trứng gà trên ựịa bàn Hà Nội.
6. đậu Ngọc Hào, Chử Văn Tuất, Trần Thị Mai Thảo (2008). Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi lợn thịt, gà thịt ở một số trang trại chăn nuôi tập trung trên ựịa bàn tỉnh Hưng Yên và Hà Tây. Tạp chắ Khoa học công nghệ số 1.
7. Phạm Khắc Hiếu và Lê Thị Ngọc Diệp (1999). Dược lý thú y, NXB Nông Nghiệp, tr 297 Ờ 298.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 57
8. Phạm Thị Kim (2005). Báo cáo kiểm tra 280 mẫu thịt ựược lấy tại các chợ lớn và các ựiểm giết mổ tập trung trên ựịa bàn Hà Nội, Nam định, thành phố Hồ Chắ Minh, Bình Dương và Cần Thơ.
9. Lã Văn Kắnh (2007). Nghiên cứu sản xuất thịt lợn an toàn chất lượng cao, Viện khoa học kỹ thuật nông nghiệp Miền Nam, thành phố Hồ Chắ Minh.
10. Nguyễn Tú Nam (2011). Thực trạng sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gà, bước ựầu ựánh giá tồn dư một số kháng sinh trong thịt gà ựược bán trên thị trường Hải Phòng. Luận Văn Thạc Sỹ Nông Nghiệp. Khoa Thú Y Ờ đại Học Nông nghiệp Hà Nội.
11. Bùi Thị Tho (2003). Giáo trình thuốc kháng sinh và nguyên tắc sử dụng trong chăn nuôi.
12. Bùi Thị Tho (2006). Giáo trình dược lý học thú y. Nhà xuất bản nông nghiệp.
13. đinh Thiện Thuật, Nguyễn Ngọc Tuân, Võ Thị Trà An, Lê Thanh Hiền, Võ Bá Lâm, Khương Thị Ninh (2003). Bước ựầu khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi và dư lượng kháng sinh trong thịt và thịt thương phẩm trên ựịa bàn tỉnh Bình Dương. Tạp chắ KHKT Thú y, Số 1 (Tập X(1)), tr.50-57.
14.Vi Thị Thanh Thủy, Hoàng Khải Lập, Nguyễn Duy Hoan, Trần Văn Phùng (2010). Tồn dư kháng sinh trên thịt lợn và kiến thức, thái ựộ, thực hành về an toàn sinh học của người chăn nuôi lợn tại tỉnh Thái Nguyên. Tạp chắ Dinh dương & Thực phẩm (3+4).
15. Nguyễn Quang Tuyên, Nguyễn Văn Thăng, Trần Thị Hạnh, Phạm Thị Ngọc (2008). Kết quả xác ựịnh tồn dư một số loại kháng sinh trong sữa bò tại TP Hà Nội và vùng phụ cận. Tạp chắ Khoa học kỹ thuật thú y, Tập XV số 5.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 58
II.TÀI LIỆU TIẾNG ANH
16. Aarestrup F.M. (1999). Association between the consumption of antimicrobial agents in animal husbandry and the occurrence of resistant bacteria among food animals. International of antimicrobial agents, 12, p297-285
17. Barton D.Mary (2000). Antibiotic use in animal feed and its impact on human health, Nutrition Research Reviews 13: pp279 Ờ 299
18. Bevill, R. F (1984). Factors influencing the occurrence of drug residues in animal tissues after the use of antimicrobial agents in animal feeds, J. Am. Vet. Med. Assoc., 185, 1124-1126.
19. Black W.D., Gentry R.D. (1984), The distribution of oxytetracyline in the tissues of swine following a single oral dose, Canadian Veterian Journal, p158-161
20. Bogaard A.E.V.D., E.E. Stobberingh (2000). Epidemiology of resistance to antibiotics links between animal and humans. International Journal of Antimicrobial agents, số 14:327-335.
21. Bogaerts, R. & Wolf, F. (1980). A standardized method for the detection of residues of antibacterial substances in fresh meat. A report of the working group of the Scientific Veterinary Commission of the European Communities concerning a proposal for a common microbiological method, the so-called EEC four-plate method. Fleischwirtschaft 60(4), 667-669.
22. Calderon, V. Gonzalez, J. Diez, P. & Berenguer, J. A. (1996). Evaluation of a multiple bioassay technique for determination of antibiotic residues in meat with standard solutions of antimicrobials. Food Additives and Contaminants 13(1), 13-19.
23. Commission Decision 2002/657/EC of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC establishes criteria and procedures for the validation of analytical methods to ensure the quality and comparability of analytical results generated by official labolatories
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 59
25. Van Dresser, W. R., Wilcke, J. R (1989). Drug residues in food animals, J. Am. Vet. Med. Assoc., 194, 1700-1710
26. Dang Pham Kim, Guy Degand, Sophie Danyi, Gilles Pierret, Philippe Delahaut, Ton Vu Dinh, Guy Maghuin-Rogister, Marie-Louise Scippo (2010). Validation of a two-plate microbiological method for screening antibiotic residues in shrimp tissue. Analytica Chimica Acta, 672, p30-39
27. Dang Pham Kim, Guy Degand, Caroline Douny, Ton Vu Dinh, Guy Maghuin-Rogister, Marie-Louise Scippo (2011). Optimization of a new two- plate screening method for the detection of antibiotic residues in meat. International Journal of Food Science and Technology, 46 (10), p2070-2076.
28. Dang Pham Kim, Guy Degand, Sophie Danyi, Gilles Pierret, Philippe Delahaut, Ton Vu Dinh, Guy Maghuin-Rogister, Marie-Louise Scippo (2013). Preliminary evaluation of antimicrobial residue levels in marketed pork and chicken meat in the Red river delta region of Vietnam, Food and Public Health, 3(6); 267-276.
29. Dang Pham Kim, Claude Saegerman, Caroline Douny, Ton Vu Dinh, Bo Ha Xuan, Binh Dang Vu, Ngan Pham Hong, Marie- Louise Scippo (2013).