tetracycline của phương pháp hai ựĩa mới với kit Tetrasensor
3.2.3. Thử nghiệm phương pháp hai ựĩa mới ựể phân tắch các mẫu thịt ựược lấy trên thị trường ba quận huyện ựại diện của thành phố Hà Nội.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 31
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu
Mẫu ựược lấy theo TCVN 4833 Ờ 2002 với nguyên tắc lấy mẫu ựơn lẻ, ngẫu nhiên vào các ựợt ựộc lập mang tắnh ựại diện trên ựịa bàn ba quận huyện (Gia Lâm, Hoàn Kiếm và Hà đông) - Hà Nội. Việc chọn 3 ựịa ựiểm ựại diện trong nghiên cứu này chỉ nhằm mục ựắch tránh sự trùng lặp mẫu cùng nguồn cung cấp, nên mỗi ựợt lấy mẫu tại mỗi quận huyện lấy 3 mẫu ba ựiểm phân phối thuộc 3 xã (phường) thuộc ba phắa của quận huyện ựó (ba ựiểm lấy xa nhất có thể). Khoảng cách giữa hai ựợt lây mẫu là 1 tuần, từ tuần thứ nhất tháng 4 ựến hết tháng 8 năm 2012. Mẫu ựược lấy ở phần cơ, tại mỗi quầy lấy 200g thịt, gói trong túi polyetylen, ựược bảo quản lạnh rồi vận chuyển về phòng thắ nghiệm. Mỗi mẫu thịt ựược nghiền nhỏ. Lấy ra 12g ựể tiến hành phân tắch theo phương pháp NTPT, 2g ựể tiến hành phân tắch theo phương pháp Premi Ờ Test và phần còn lại ựược bảo quản lạnh ở - 200C ựể làm các phân tắch tiếp theo.
3.3.2. Quy trình tách chiết kháng sinh trong thịt lợn
Quy trình tách chiết ựược thắch ứng từ phương pháp Premi Ờ Test và qui trình tách chiết mẫu ựược mô tả bởi Dang et al., [40][41]. Quy trình tách chiết ựược hiệu chỉnh và thắch ứng ựể ựảm bảo chất sử dụng trong quy trình tách chiết và chất có tác dụng tương tự kháng sinh có thể có trong mẫu không ảnh hưởng ựến kết quả phân tắch. Mười hai gam mẫu ựược tách chiết trong Acetonitril/Aceton (70/30) và trải qua các bước tách chiết như sơ ựồ 1. Phần cặn sau khi bay hơi trong ống 1 và 2 ựược thu hồi tương ứng trong 115 ộL nước và 285 ộL methanol. Nếu áp dụng qui trình tách chiết này, lượng mẫu có trong 50 ộL dịch chiết mẫu sẽ là 1,5 g trong cả hai trường hợp của hai ống sau khi thu hồi.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 32
3.3.3. Sơ ựồ bố trắ và cách ựọc kết quả phương pháp hai ựĩa
Hình 3.3. Quy trình tách chiết kháng sinh
Lắc ựảo ựầu trong 10 phút Ly tâm 3000 vòng/phút trong 15 phút Ống nghiệm 2 Thêm 12 ml acetonitril/acetone (70/30, v/v) Ống nghiệm 1 Lấy phần dung dịch phắa trên Ly tâm 3000 vòng/phút trong 15 phút Dùng cho hai ựĩa giấy
trên ựĩa Petri I (pH6)
Cặn thu hồi trong 115 ộl nước
Lấy 12g mẫu ựã ựồng nhất vào ống nghiệm
3,45 ml 8,55 ml
Làm bay hơi ựến khô bằng cách thổi khắ N2, ở 40ồC
Cặn thu hồi trong 285 ộl methanol
Dùng cho 5 ựĩa giấy còn lại trên cả 2 ựĩa Petri I (pH6) và II (pH7,5)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
Bốn ựĩa giấy ựánh số từ 1 ựến 4 (đĩa 1, đĩa 2, đĩa 3 và đĩa 4) và ba ựĩa giấy ựánh số từ 5 ựến 7 ựược ựặt lần lượt trên hai ựĩa Petri ( I và II) (Sơ ựồ 2). Trên ựĩa Petri I (pH6), ựĩa giấy 1 và 2 ựược nhỏ 50 ộL mẫu tách chiết thu hồi trong nước (ống nghiệm 1), và ựĩa 3 và ựĩa 4 ựược nhỏ 50 ộL mẫu tách chiết thu hồi trong methanol (ống nghiệm 2). Hai ựĩa 2 và 4 ựược bổ sung 20 ộL NaOH 1%. Trên ựĩa Petri II (pH7,5), cả ba ựĩa giấy ựều ựược nhỏ 50 ộL mẫu tách chiết thu hồi trong methanol. đĩa 5 cũng ựược bổ sung thêm 20 ộL NaOH 1%, ựĩa 6 thêm 10 ộL TMP (10 ộg mL-1) và ựĩa 7 với hai dung dịch 10 ộL TMP (10 ộg mL-1) và 10 ộL PABA (100 ộg mL-1).
Hình 3.4. Sơ ựồ bố trắ phương pháp hai ựĩa Đĩa 1 đĩa 2 Đĩa 6 đĩa 7 đĩa 4 đĩa 5 Đĩa Petri II pH 7.5) Đĩa petri I (pH 6.0) Đĩa 3 TMP: 10 ộL Trimethoprim 10ộg mL PABA:10 ộL PABA 100 ộg mL Sw Sw+Na S S+Na S+TMP S+Na S+TMP +PABA
S và Sw là 50 mẫu tách chiết lần lượt thu hồi trong Methanol và nước
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 34
Việc sử dụng hai dung môi khác nhau, bổ sung các chất như NaOH, TMP và PABA nhằm mục ựắch ựịnh hướng cho các phân tắch tiếp theo (xem cách ựọc kết quả bảng 3.1).
Cách ựọc kết quả
Trên cơ sở ựộ rộng vòng vô khuẩn và sự khác nhau của các ựĩa khi bổ sung các dung dịch khác ựể ựọc kết quả và ựịnh hướng cho các phân tắch tiếp theo (Bảng 3.1.). Trong khuôn khổ nghiên cứu này, chỉ tập trung vào hai nhóm kháng sinh Tetracycline và (fluoro)Quinolones nên chỉ khảo sát và quan tâm ựến ựĩa petri I (pH 6,0). Chỉ cần một trong 4 ựĩa giấy (1, 2, 3 hoặc 4) xuất hiện vòng vô khuẩn có ựộ rộng lớn hơn hoặc bằng 1,5 mm ựược nghi ngờ có chứa một trong các kháng sinh thuộc hai nhóm trên.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 35
Bảng 3.1. Cách ựọc kết quả phương pháp hai ựĩa mới (Dang el al, 2011)
đĩa Petri I (pH 6) đĩa Petri II (pH 7,5)
đĩa1 đĩa 2 đĩa 3 đĩa 4 đĩa 5 đĩa 6 đĩa 7 Kết luận
50 ộL mẫu tách chiết thu hồi trong nước 50 ộL mẫu tách chiết thu hồi trong nước +20 ộL NaOH 1% 50 ộL mẫu tách chiết thu hồi trong methanol 50 ộL mẫu tách chiết thu hồi trong methanol + 20 ộL NaOH 1% 50 ộL mẫu tách chiết thu hồi trong methanol +20 ộL NaOH 1% 50 ộL mẫu tách chiết thu hồi trong methanol +10 ộL TMP 10 ộg mL-1 50 ộL of mẫu tách chiết thu hồi trong methanol +10 ộL
TMP 10 ộg mL-1+
10 ộL of PABA 100
ộg mL-1
- - - Mẫu ựạt yêu cầu
+ . + . . .+ hoặc ổ
hoặc Ờ .+ hoặc ổ hoặc Ờ
Cần phân tắch kiểm tra tetracyclines hoặc oxolinic
acid hoặc flumequine
+ + Cần kiểm tra beta-lactams
.+ hoặc ổ
hoặc Ờ .+ ()
.+ hoặc ổ
hoặc - .+ (với ) .+ (với )
.+ hoặc ổ
hoặc Ờ + hoặc ổ hoặc Ờ
Cần kiểm tra các nhóm khác (fluoro)Quinolones hoặc
macrolides hoặc aminoglycosides hoặc
florfenicol
- - - - - + .- Cần kiểm tra sulfonamides
.-: không có vòng vô khuẩn +: ựộ rộng vòng vô khuẩn ≥ 1.5 mm ổ: ựộ rộng vòng vô khuẩn 1 và 1.5 mm
và : ựộ rộng vòng vô khuẩn tương ứng giảm hoặc tăng so với ựiă giấy bên cạnh (ựĩa 1 hoặc 3)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 36
3.3.4. Phương pháp ựánh giá khả năng phát hiện của phương pháp hai ựĩa mới ựĩa mới
Khả năng phát hiện của phương pháp ựược ựánh giá thông qua việc sử dụng các dung dịch kháng sinh chuẩn, phân tắch thử các mẫu trắng và các mẫu trắng ựược củng cố kháng sinh ở các nồng ựộ quan tâm, riêng các mẫu ựược củng cố kháng sinh ở các nồng ựộ quan tâm ựược phân tắch ựồng thời bằng phương pháp Premi Ờ test, Terasensor và phương pháp hai ựĩa mới (NTPT).
Trong khuôn khổ nghiên cứu này, khả năng phát hiện ựược ựánh giá trên cơ sở kết quả của việc thử ựối chứng bằng dung dịch chuẩn, ựánh giá khả năng phát hiện của phương pháp ựối với hai nhóm quan tâm là Tetracyclines và Quinolones nên chỉ quan tâm ựến ựĩa Petri I (pH 6).
3.3.4.1. Thử ựối chứng
Cũng như các phương pháp vi sinh vật khác và khuyến cáo của tác giả chất lượng môi trường và tắnh mẫn cảm của chủng vi sinh vật với kháng sinh cần kiểm tra thường dùng Test ựối chứng dương ựối với một số kháng sinh ựại diện. Riêng ựối với phương pháp hai ựĩa mới (NTPT) trong giai ựoạn thử nghiệm và nghiên cứu này chú trọng hai nhóm kháng sinh ựược dùng phổ biên trong chăn nuôi lợn [27] nên khi xem xét khả năng phát hiện nghiên cứu này thử ựối với tất cả các kháng sinh quan tâm (Oxytetracycline, Doxyxycline, Tetracycline và Chloteracycline ựối với nhóm Tetracyclines và Ciprofloxacin, Enrofloxacin, Difloxacin và Flumequin ựối với nhóm Quinolones):
Thử ựối chứng bằng cách lấy 50ộl dung dịch chuẩn ở nồng ựộ 20ộg/ml nhỏ lên ựĩa giấy ựặt trên mặt thạch ựĩa Petri. Sau khi ủ từ 18 giờ ở 300C tiến hành ựo ựường kắnh của vòng vô khuẩn bằng thước kẹp palme, ựộ chắnh xác 10-2mm. Mỗi kháng sinh chuẩn ựược Test lặp lại 6 lần trên ba lần chuẩn bị môi trường vào ba ngày khác nhau. Mỗi kháng sinh thử trên ba ựĩa Petri cùng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 37
môi trường cùng lần chuẩn bị. Kết quả sẽ so sánh với khuyến cáo của các nghiên cứu trước ựây và khuyến cáo của các test cùng nguyên lý.
3.3.4.2. Xác ựịnh ngưỡng phát hiện
Ngưỡng phát hiện là nồng ựộ nhỏ nhất của một kháng sinh có trong mẫu mà phương pháp có thể phát hiện ựược. Hay nồng ựộ mà tại ựó có nhiều nhất 5% số mẫu mà phương pháp không phát hiện ựược. Giá trị 5% ựã ựược chọn từ giá trị nồng ựộ giới hạn Beta (CCβ hoặc khả năng phát hiện) ựã ựược mô tả trong Quyết ựịnh của Ủy Ban Châu Âu số 2002/657/CE. Giá trị mà tại ựó Beta (tỷ lệ Ộdương tắnh giảỢ là 5% ựối với các hợp chất có quy ựịnh giới hạn dư lượng tối ựa và 1% ựối với các hợp chất cấm hoàn toàn). Theo khuyến cáo, ựể xác ựịnh ngưỡng phát hiện cần phân tắch 20 mẫu ở một nồng ựộ củng cố, tại ựó chỉ có nhiều nhất một mẫu có kết quả âm tắnh [2].
3.3.4.3. Xác ựịnh tham số và ựộ mạnh của phương pháp
Theo hướng dẫn chuẩn hóa phương pháp sàng lọc của Hiệp hội phòng thắ nghiệm chuẩn Cộng hòa Pháp và Qui ựịnh 2002/657/EC, việc chuẩn hoá phương pháp còn ựược thông qua ựánh giá các tham số liên quan ựến khả năng phát hiện và ựộ mạnh của phương pháp trên cơ sở phân tắch các mẫu trắng (ựược coi như mẫu âm tắnh thật) và mẫu trắng ựược củng cố kháng sinh chuẩn (ựược coi như mẫu dương tắnh thật). Lượng kháng sinh chuẩn củng cố vào mẫu trắng phụ thuộc vào sự mẫn cảm của vi khuẩn Bacillus subtilis với các kháng sinh và lượng kháng sinh tối thiểu có khả năng tạo vòng vô khuẩn xung quanh ựĩa giấy có ựộ rộng lớn hơn hoặc bằng 1,5 mm hay tại giá trị giới hạn phát hiện (LOD). Mẫu trắng và mẫu trắng ựược củng cố kháng sinh ựều ựược tách chiết theo quy trình như ựã nêu ở phần trên. Riêng với mẫu trắng ựược củng cố kháng sinh, trước khi tiến hành tách chiết, mẫu trắng ựược nghiền và củng cố kháng sinh, sau ựó mẫu ựược ựể qua ựêm ở 4oC.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 38
Bảng 3.2. Công thức ựược dùng ựể xác ựịnh ựộ xác thực, ựộ ựặc hiệu và ựộ nhạy của phương pháp
Kết quả test Mẫu thực sự dương tắnh (N
+) (mẫu trắng củng cố kháng sinh)
Mẫu thực sự âm tắnh (N-) (mẫu trắng)
Dương tắnh PA (Dương tắnh theo quy ựịnh) FP (Dương tắnh giả)
Âm tắnh FN (Âm tắnh giả) NA (Âm tắnh theo quy ựịnh)
độ xác thực (%) = 100% N NA PA ừ + với N = N+ + N- độ nhạy (%) = 100% N PA ừ + độ ựặc hiệu (%) = 100% N NA ừ −
Mẫu dương tắnh là mẫu có khả năng tạo vòng vô khuẩn ở ắt nhất 1 trong 4 ựĩa giấy với ựộ rộng tối thiểu là 1,5 mm.
3.3.5. So sánh khả năng phát hiện một số kháng sinh của phương pháp hai ựĩa mới với các phương pháp sàng lọc khác ựĩa mới với các phương pháp sàng lọc khác
Sau khi xác ựịnh ngưỡng phát hiện và các tham số ựộ mạnh của phương pháp, ựể khẳng ựịnh khả năng áp dụng thắ nghiệm so sánh với các phương pháp khác ựã ựược nghiên cứu. Trong nghiên cứu này, phương pháp ựã so sánh với kết quả của phương pháp Premi Ờ Test theo hướng dẫn kèm theo kắt (dịch chiết trực tiếp từ mẫu) và theo hướng dẫn của Stead (2004) [48] (tách chiết trong hỗn hợp dung môi acetonitrile/acetone 70/30) với phương pháp hai ựĩa mới (NTPT) ở các mẫu củng cố kháng sinh và một số mẫu thực ựược lấy trên thị trường Hà Nội.
3.3.6. Thử nghiệm phương pháp hai ựĩa mới ựể phân tắch các mẫu thịt ựược lấy trên thị trường Gia Lâm Hà Nội
Mẫu sẽ ựược trải qua ba bước phân tắch: sàng lọc bằng phương pháp hai ựĩa mới NTPT, hậu sàng lọc (bằng Test receptor Tetrasensor ựối với
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 39
Tetracycline và ELISA (phương pháp thử miễn dịch hấp thụ enzyme) ựối với Quinolones). Các mẫu nghi ngờ sẽ ựược khẳng ựịnh bằng phương pháp sắc ký lỏng (sơ ựồ 3.3).
Hình 3.5. Chiến lược phân tắch dư lượng kháng sinh trong thịt lợn ựược bán tại các chợ ở Hà Nội
để khẳng ựịnh thêm khả năng sàng lọc của phương pháp hai ựĩa mới, bên cạnh các mẫu nghi ngờ ựược phát hiện sau bước sàng lọc, 15 mẫu ựạt yêu cầu cũng ựược tiến hành các bước hậu sàng lọc và khẳng ựịnh.
3.4. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu ựược tổng hợp trên Microsoft Excel.
LC-MS LC-MS
Phân tắch khẳng ựịnh tồn dư Tetracyclines
Mẫu nghi ngờ chứa Quinolones
(≥ LOD) Mẫu ựạt yêu cầu
(< LOD)
Tetrasensor
Mẫu nghi ngờ Mẫu ựạt yêu cầu
(-)
Mẫu thịt lợn
Hai ựĩa mới
(+)
ELISA
Mẫu nghi ngờ chứa Tetracyclines
(≥ LOD)
(+) (-) (+)
Phân tắch khẳng ựịnh tồn dư Quinolones
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 40
PHẦN THỨ TƯ: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả ựánh giá khả năng phát hiện của phương pháp hai ựĩa mới thông qua chất chuẩn và mẫu củng cố chất chuẩn thông qua chất chuẩn và mẫu củng cố chất chuẩn
để ựánh giá khả năng phát hiện của phương pháp hai ựĩa mới, phương pháp sẽ ựược thử ựối chứng ựối với chất chuẩn và mẫu củng cố chất chuẩn, tiếp tục ựược xác ựịnh ngưỡng phát hiện và xác ựịnh ựộ tham số ựộ mạnh của phương pháp.
4.1.1.Thử ựối chứng
Cũng như các phương pháp vi sinh vật cùng nguyên lý, ựể kiểm tra chất lượng môi trường và khẳng ựịnh khả năng mẫn cảm của chủng vi sinh vật với kháng sinh ựược thử, khuyến cáo phương pháp hai ựĩa mới cũng khuyến cáo trước mỗi ựợt chuẩn bị môi trường hay một lô ựĩa nên thử ựối chứng. 50 ộl dung dịch kháng sinh chuẩn ựại diện có nồng ựộ 20 ộg/ml ựược nhỏ lên ựĩa giấy ựược ựặt trên mặt thạch (1 ộg kháng sinh/ựĩa). Sau khi ủ ở 300C trong 24 giờ, các ựĩa Petri ựược ựưa ra ựể ựo ựường kắnh vòng vô khuẩn bằng thước ựiện tử có ựộ chắnh xác 10-2 mm.
Hình 4.1. đo vòng vô khuẩn của test ựối chứng
Tetra
Chlo
S.azin
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 41
Trong khuôn khổ một nghiên cứu thử nghiệm trong ựiều kiện khác so với ựiều kiện phát triển phương pháp, mỗi nhóm chọn bốn loại kháng sinh ựại diện ựể thử (kháng sinh ựại diện là các kháng sinh ựược dùng nhiều trong chăn nuôi lợn tại Việt Nam). Mỗi loại kháng sinh ựược Test ựối chứng trên 3 lô ựĩa của 3 ựợt chuẩn bị ở 3 thời ựiểm khác nhau. Mỗi lô một kháng sinh ựược lặp lại 2 lần ở 3 ựĩa khác nhau. Kết quả cho thấy ở môi trường pH 6 tất cả 8 loại kháng sinh hai nhóm Tetracylines và Quinolones ựược thử ựều tạo vòng vô khuẩn rất rõ. Giá trị trung bình ựường kắnh vòng vô khuẩn của ựa số kháng sinh ựược thử ựều lớn hơn hoặc bằng 32 mm với hệ số biến ựộng từ 2,75% ựến 5,0% (bảng 4.1).
Bảng 4.1. Kết quả thử ựối chứng ở môi trường pH 6,0
đường kắnh vòng vô khuẩn (mm) (n=6) Nhóm kháng sinh Kháng sinh Xa ổ sa Nhỏ nhất Ờ Lớn nhất CV % Tetracyline 37ổ 1,0 33-39 4,52 Chlotetrecycline 46 ổ 1,2 45-48 2,75 Oxytetracyline 40 ổ 0,5 39-42 2,93 Tetracylines Doxyxycline 44ổ 1,0 42-46 3,21 Ciprofloxacin 37 ổ 1,0 35-39 4,00 Enrofloxacin 38 ổ 1,0 36-40 3,89 Difloxacin 38 ổ 1,3 35-39 4,00 Quinolones Flumequin 32ổ1,5 29-33 5,02 a
X , sa: Giá trị trung bình ựường kắnh vòng vô khuẩn và ựộ lệch chuẩn của từng kháng sinh
Giá trị trung bình ựường kắnh vòng vô khuẩn của các Quinolones ựều lớn hơn 37 mm, trừ Flumequine (ựường kắnh vòng vô khuẩn là 32 ổ 1,5 mm với hệ số biến ựộng 5,02%). Trong ựó, Enrofloxacine và difloxacine có khả