Mục ựắch của phương pháp khẳng ựịnh là ựịnh lượng và ựịnh danh chắnh xác chất tồn dư. Với những kháng sinh cấm sử dụng, việc kiểm soát tồn dư không cần trải qua bước sàng lọc mà có thể tiến hành ngay bước khẳng ựịnh. Bước này chủ yếu sử dụng các phương pháp lý hóa ựể phân tắch gồm:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 26
-Phương pháp sắc ký với nguyên tắc phân tách các hợp chất dựa vào sự bố trắ khác nhau giữa hai pha tĩnh và pha ựộng. Pha tĩnh (rắn hoặc lỏng) ở trong cột, pha di ựộng ựi qua nhờ mao quản. Có hai loại sắc ký là sắc ký khắ (GC- Gas Chromatography) và sắc ký lỏng (LC- Liquid Chromatography). Hiện nay sắc ký khắ thường ựược gắn với ựầu lọc khối phổ (GC-MS) và sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS)
-Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC Ờ High Performance Thin Layer Chromatography);
-Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC Ờ High Performance Liquid Chromatography);
-Sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC Ờ Ultra Performance Liquid Chromatography).
Các phương pháp này có ưu ựiểm nhận diện ựược rõ ràng, ựịnh lượng ựược chắnh xác kháng sinh tồn dư và rất nhạy. Nhưng nhược ựiểm là ựòi hỏi quy trình rất phức tạp, thiết bị ựắt tiền, chi phắ phân tắch cao và kỹ thuật viên chuyên nghiệp.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 27
PHẦN THỨ BA
VẬT LIỆU Ờ NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nguyên vật liệu và hóa chất
3.1.1. Mẫu thịt lợn
-Mẫu trắng: ựược sử dụng trong nghiên cứu này là mẫu thịt lợn ựược nuôi hoàn toàn bằng rau, cám gạo và cám ngô tại trung tâm Nghiên cứu và ựào tạo nghề Chăn nuôi Ờ Khoa Chăn nuôi và Nuôi trồng thủy sản, Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội. Mẫu thịt ựược xay nhỏ bảo quản lạnh -200C, trước khi phân tắch mẫu ựược ựể ở nhiệt ựộ phòng 20 phút;
-Mẫu thử nghiệm: thịt lợn ựược lấy từ các chợ trên ựịa bàn ba quận huyện ựại diện ở Hà Nội (Gia Lâm, Hoàn Kiếm và Hà đông).
3.1.2. Dụng cụ và hóa chất
-Các dụng cụ, trang thiết bị cần thiết trong phân tắch và nuôi cấy vi sinh vật như: bình tam giác, bếp khuấy từ, nồi hấp tiệt trùng, nồi hấp cách thủy...
-Hệ thống làm bay hơi bằng khắ Nitơ, ựĩa Petri vô trùng ựường kắnh 9 cm, ựĩa giấy (Roth, Art, KA10.1) ựường kắnh 12,7 mm, thước kẹp palme ựiều chỉnh ựộ chắnh xác 10-2 mm.
-Hóa chất: đường Glucose, NH4OH 2M, HCL 1M, NaOH 1M, Methanol, Acetonitrile, Acetone, hỗn hợp Acetonitrile/Acetone (70/30), PAPA (para- aminobenzoic acid), TMP (trimethoprime) của hãng Sigma Aldrich (Steinheim, Germany), kắt Premi-test ựược cung cấp bởi hãng DSM Hà Lan.
-Các dung dịch kháng sinh chuẩn : Tetracyclines (Tetracycline, Oxytetracyline, Doxycycline, Chlotetracyline), Quinolones (Ciprofloxacin, Enrofloxacin, Difloxacin, Flumequin).
-Kắt sàng lọc dùng ựể so sánh với phương pháp hai ựĩa: kắt Premiệ Test là một phương pháp VSV do R-biopharm sản xuất, ựã ựược thương mại trên thị trường. Kắt sử dụng chủng VSV Bacillus stearothermophilus ựược cấy trong môi
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 28
trường có chứa chất chỉ thị axit hoặc bazơ. Nếu có mặt kháng sinh trong mẫu sẽ ức chế sự phát triển của VSV, chỉ thị màu môi trường không thay ựổi. Ngược lại, nếu không có kháng sinh, VSV phát triển làm thay ựổi pH, do ựó chỉ thị màu môi trường sẽ chuyển từ màu tắm sang vàng (sơ ựồ 3.1). Các mẫu phân tắch bằng Premi- Test ựược tiến hành ựồng thời theo hướng dẫn kèm theo kắt (dùng dịch chiết trực tiếp từ mẫu) và khuyến cáo của Stead và cs., (2004)[48].
Hình 3.1. Nguyên lý Premi-Test
- Kắt ựặc hiệu phát hiện tồn dư kháng sinh
* Kắt Tetrasensorệ
: Do Unisensor, S.A, Liège, Vương quốc Bỉ sản xuất là kắt dạng que thử nhanh, dễ thực hiện có ngưỡng phát hiện kháng sinh nhóm Tetracycline là 20 ppb.
Mẫu ựược tách chiết theo qui trình ựơn giản và thử theo hướng dẫn của nhà sản xuất kèm theo kắt (sơ ựồ 3.2).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 29
Hình 3.2. Quy trình tách chiết mẫu và ựọc kết quả phân tắch của kắt Tetrasensor
* Kắt (Fluoro)quinolones 2 hours (E.G.3): Là kắt ELISA dùng ựể phát hiện và bán ựịnh lượng các kháng sinh nhóm (Fluoro)quinolone do Phòng thắ nghiệm CER-Marloie, Vương quốc Bỉ cung cấp. Kắt có khả năng phát hiện tốt ựại ựa số các kháng sinh nhóm (Fluoro)quinolone trong các sản phẩm có nguồn gốc từ ựộng vật.
đường chuẩn ựược xây dựng trên cơ sở phân tắch dung dịch ở các nồng ựộ tương ứng là 0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5 và 1,0 ng/ml. Mẫu ựược chuẩn bị và tách chiết theo hướng dẫn kèm theo kắt. Sau khi ựọc giá trị OD (mật ựộ quang) của các giếng trên khay ở bước sóng 450nm, kết quả ựược tắnh toán theo file Excel kèm theo kắt [2].
Các mẫu thịt lợn lấy trên ựịa bàn thành phố Hà Nội sau khi ựược sàng lọc
Ly tâm Mẫu thịt + Dung dịch ựệm Nhỏ 200 ộl vào ống thử
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 30
bằng phương pháp hai ựĩa mới và phương pháp Premi-Test có nghi ngờ chứa Quinolones sẽ ựược phân tắch bằng kắt và tiếp tục ựược khẳng ựịnh lại bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ ựể xác ựịnh nồng ựộ và ựịnh danh chắnh xác các Quinolones.
3.1.3. Giống vi sinh vật, môi trường nuôi cấy
-Giống vi sinh vật : Bacillus subtilis BGA dạng huyền phù 107 tế bào/ml (Merck, 1.10649 Darmstadt,Germany);
-Môi trường nuôi cấy: Môi trường thạch agar thử kháng sinh pH 6 (Merck 1.10663) Môi trường ựược chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất, thêm ựường glucose với tỷ lệ 0,6%. Mỗi ựĩa Petri ựược láng 8 ml môi trường ựã ựược trộn Bacillus subtilis với tỷ lệ 0,1 %.
3.2. Nội dung nghiên cứu
3.2.1. đánh giá khả năng phát hiện của phương pháp hai ựĩa mới
- Thử ựối chứng;
- Xác ựịnh ngưỡng phát hiện;
- Xác ựịnh tham số và ựộ mạnh của phương pháp.
3.2.2. So sánh khả năng phát hiện một số kháng sinh dại diện hai nhóm Tetracyclines và quinolones của phương pháp hai ựĩa mới với phương pháp Tetracyclines và quinolones của phương pháp hai ựĩa mới với phương pháp Premi Ờ test
3.2.3. So sánh khả năng phát hiện một số kháng sinh thuộc nhóm tetracycline của phương pháp hai ựĩa mới với kit Tetrasensor tetracycline của phương pháp hai ựĩa mới với kit Tetrasensor
3.2.3. Thử nghiệm phương pháp hai ựĩa mới ựể phân tắch các mẫu thịt ựược lấy trên thị trường ba quận huyện ựại diện của thành phố Hà Nội.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 31
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu
Mẫu ựược lấy theo TCVN 4833 Ờ 2002 với nguyên tắc lấy mẫu ựơn lẻ, ngẫu nhiên vào các ựợt ựộc lập mang tắnh ựại diện trên ựịa bàn ba quận huyện (Gia Lâm, Hoàn Kiếm và Hà đông) - Hà Nội. Việc chọn 3 ựịa ựiểm ựại diện trong nghiên cứu này chỉ nhằm mục ựắch tránh sự trùng lặp mẫu cùng nguồn cung cấp, nên mỗi ựợt lấy mẫu tại mỗi quận huyện lấy 3 mẫu ba ựiểm phân phối thuộc 3 xã (phường) thuộc ba phắa của quận huyện ựó (ba ựiểm lấy xa nhất có thể). Khoảng cách giữa hai ựợt lây mẫu là 1 tuần, từ tuần thứ nhất tháng 4 ựến hết tháng 8 năm 2012. Mẫu ựược lấy ở phần cơ, tại mỗi quầy lấy 200g thịt, gói trong túi polyetylen, ựược bảo quản lạnh rồi vận chuyển về phòng thắ nghiệm. Mỗi mẫu thịt ựược nghiền nhỏ. Lấy ra 12g ựể tiến hành phân tắch theo phương pháp NTPT, 2g ựể tiến hành phân tắch theo phương pháp Premi Ờ Test và phần còn lại ựược bảo quản lạnh ở - 200C ựể làm các phân tắch tiếp theo.
3.3.2. Quy trình tách chiết kháng sinh trong thịt lợn
Quy trình tách chiết ựược thắch ứng từ phương pháp Premi Ờ Test và qui trình tách chiết mẫu ựược mô tả bởi Dang et al., [40][41]. Quy trình tách chiết ựược hiệu chỉnh và thắch ứng ựể ựảm bảo chất sử dụng trong quy trình tách chiết và chất có tác dụng tương tự kháng sinh có thể có trong mẫu không ảnh hưởng ựến kết quả phân tắch. Mười hai gam mẫu ựược tách chiết trong Acetonitril/Aceton (70/30) và trải qua các bước tách chiết như sơ ựồ 1. Phần cặn sau khi bay hơi trong ống 1 và 2 ựược thu hồi tương ứng trong 115 ộL nước và 285 ộL methanol. Nếu áp dụng qui trình tách chiết này, lượng mẫu có trong 50 ộL dịch chiết mẫu sẽ là 1,5 g trong cả hai trường hợp của hai ống sau khi thu hồi.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 32
3.3.3. Sơ ựồ bố trắ và cách ựọc kết quả phương pháp hai ựĩa
Hình 3.3. Quy trình tách chiết kháng sinh
Lắc ựảo ựầu trong 10 phút Ly tâm 3000 vòng/phút trong 15 phút Ống nghiệm 2 Thêm 12 ml acetonitril/acetone (70/30, v/v) Ống nghiệm 1 Lấy phần dung dịch phắa trên Ly tâm 3000 vòng/phút trong 15 phút Dùng cho hai ựĩa giấy
trên ựĩa Petri I (pH6)
Cặn thu hồi trong 115 ộl nước
Lấy 12g mẫu ựã ựồng nhất vào ống nghiệm
3,45 ml 8,55 ml
Làm bay hơi ựến khô bằng cách thổi khắ N2, ở 40ồC
Cặn thu hồi trong 285 ộl methanol
Dùng cho 5 ựĩa giấy còn lại trên cả 2 ựĩa Petri I (pH6) và II (pH7,5)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
Bốn ựĩa giấy ựánh số từ 1 ựến 4 (đĩa 1, đĩa 2, đĩa 3 và đĩa 4) và ba ựĩa giấy ựánh số từ 5 ựến 7 ựược ựặt lần lượt trên hai ựĩa Petri ( I và II) (Sơ ựồ 2). Trên ựĩa Petri I (pH6), ựĩa giấy 1 và 2 ựược nhỏ 50 ộL mẫu tách chiết thu hồi trong nước (ống nghiệm 1), và ựĩa 3 và ựĩa 4 ựược nhỏ 50 ộL mẫu tách chiết thu hồi trong methanol (ống nghiệm 2). Hai ựĩa 2 và 4 ựược bổ sung 20 ộL NaOH 1%. Trên ựĩa Petri II (pH7,5), cả ba ựĩa giấy ựều ựược nhỏ 50 ộL mẫu tách chiết thu hồi trong methanol. đĩa 5 cũng ựược bổ sung thêm 20 ộL NaOH 1%, ựĩa 6 thêm 10 ộL TMP (10 ộg mL-1) và ựĩa 7 với hai dung dịch 10 ộL TMP (10 ộg mL-1) và 10 ộL PABA (100 ộg mL-1).
Hình 3.4. Sơ ựồ bố trắ phương pháp hai ựĩa Đĩa 1 đĩa 2 Đĩa 6 đĩa 7 đĩa 4 đĩa 5 Đĩa Petri II pH 7.5) Đĩa petri I (pH 6.0) Đĩa 3 TMP: 10 ộL Trimethoprim 10ộg mL PABA:10 ộL PABA 100 ộg mL Sw Sw+Na S S+Na S+TMP S+Na S+TMP +PABA
S và Sw là 50 mẫu tách chiết lần lượt thu hồi trong Methanol và nước
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 34
Việc sử dụng hai dung môi khác nhau, bổ sung các chất như NaOH, TMP và PABA nhằm mục ựắch ựịnh hướng cho các phân tắch tiếp theo (xem cách ựọc kết quả bảng 3.1).
Cách ựọc kết quả
Trên cơ sở ựộ rộng vòng vô khuẩn và sự khác nhau của các ựĩa khi bổ sung các dung dịch khác ựể ựọc kết quả và ựịnh hướng cho các phân tắch tiếp theo (Bảng 3.1.). Trong khuôn khổ nghiên cứu này, chỉ tập trung vào hai nhóm kháng sinh Tetracycline và (fluoro)Quinolones nên chỉ khảo sát và quan tâm ựến ựĩa petri I (pH 6,0). Chỉ cần một trong 4 ựĩa giấy (1, 2, 3 hoặc 4) xuất hiện vòng vô khuẩn có ựộ rộng lớn hơn hoặc bằng 1,5 mm ựược nghi ngờ có chứa một trong các kháng sinh thuộc hai nhóm trên.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 35
Bảng 3.1. Cách ựọc kết quả phương pháp hai ựĩa mới (Dang el al, 2011)
đĩa Petri I (pH 6) đĩa Petri II (pH 7,5)
đĩa1 đĩa 2 đĩa 3 đĩa 4 đĩa 5 đĩa 6 đĩa 7 Kết luận
50 ộL mẫu tách chiết thu hồi trong nước 50 ộL mẫu tách chiết thu hồi trong nước +20 ộL NaOH 1% 50 ộL mẫu tách chiết thu hồi trong methanol 50 ộL mẫu tách chiết thu hồi trong methanol + 20 ộL NaOH 1% 50 ộL mẫu tách chiết thu hồi trong methanol +20 ộL NaOH 1% 50 ộL mẫu tách chiết thu hồi trong methanol +10 ộL TMP 10 ộg mL-1 50 ộL of mẫu tách chiết thu hồi trong methanol +10 ộL
TMP 10 ộg mL-1+
10 ộL of PABA 100
ộg mL-1
- - - Mẫu ựạt yêu cầu
+ . + . . .+ hoặc ổ
hoặc Ờ .+ hoặc ổ hoặc Ờ
Cần phân tắch kiểm tra tetracyclines hoặc oxolinic
acid hoặc flumequine
+ + Cần kiểm tra beta-lactams
.+ hoặc ổ
hoặc Ờ .+ ()
.+ hoặc ổ
hoặc - .+ (với ) .+ (với )
.+ hoặc ổ
hoặc Ờ + hoặc ổ hoặc Ờ
Cần kiểm tra các nhóm khác (fluoro)Quinolones hoặc
macrolides hoặc aminoglycosides hoặc
florfenicol
- - - - - + .- Cần kiểm tra sulfonamides
.-: không có vòng vô khuẩn +: ựộ rộng vòng vô khuẩn ≥ 1.5 mm ổ: ựộ rộng vòng vô khuẩn 1 và 1.5 mm
và : ựộ rộng vòng vô khuẩn tương ứng giảm hoặc tăng so với ựiă giấy bên cạnh (ựĩa 1 hoặc 3)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 36
3.3.4. Phương pháp ựánh giá khả năng phát hiện của phương pháp hai ựĩa mới ựĩa mới
Khả năng phát hiện của phương pháp ựược ựánh giá thông qua việc sử dụng các dung dịch kháng sinh chuẩn, phân tắch thử các mẫu trắng và các mẫu trắng ựược củng cố kháng sinh ở các nồng ựộ quan tâm, riêng các mẫu ựược củng cố kháng sinh ở các nồng ựộ quan tâm ựược phân tắch ựồng thời bằng phương pháp Premi Ờ test, Terasensor và phương pháp hai ựĩa mới (NTPT).
Trong khuôn khổ nghiên cứu này, khả năng phát hiện ựược ựánh giá trên cơ sở kết quả của việc thử ựối chứng bằng dung dịch chuẩn, ựánh giá khả năng phát hiện của phương pháp ựối với hai nhóm quan tâm là Tetracyclines và Quinolones nên chỉ quan tâm ựến ựĩa Petri I (pH 6).
3.3.4.1. Thử ựối chứng
Cũng như các phương pháp vi sinh vật khác và khuyến cáo của tác giả chất lượng môi trường và tắnh mẫn cảm của chủng vi sinh vật với kháng sinh cần kiểm tra thường dùng Test ựối chứng dương ựối với một số kháng sinh ựại diện. Riêng ựối với phương pháp hai ựĩa mới (NTPT) trong giai ựoạn thử nghiệm và nghiên cứu này chú trọng hai nhóm kháng sinh ựược dùng phổ biên trong chăn nuôi lợn [27] nên khi xem xét khả năng phát hiện nghiên cứu này thử ựối với tất cả các kháng sinh quan tâm (Oxytetracycline, Doxyxycline, Tetracycline và Chloteracycline ựối với nhóm Tetracyclines và Ciprofloxacin, Enrofloxacin, Difloxacin và Flumequin ựối với nhóm Quinolones):
Thử ựối chứng bằng cách lấy 50ộl dung dịch chuẩn ở nồng ựộ 20ộg/ml nhỏ lên ựĩa giấy ựặt trên mặt thạch ựĩa Petri. Sau khi ủ từ 18 giờ ở 300C tiến hành ựo ựường kắnh của vòng vô khuẩn bằng thước kẹp palme, ựộ chắnh xác 10-2mm. Mỗi kháng sinh chuẩn ựược Test lặp lại 6 lần trên ba lần chuẩn bị môi trường vào ba ngày khác nhau. Mỗi kháng sinh thử trên ba ựĩa Petri cùng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 37
môi trường cùng lần chuẩn bị. Kết quả sẽ so sánh với khuyến cáo của các nghiên cứu trước ựây và khuyến cáo của các test cùng nguyên lý.
3.3.4.2. Xác ựịnh ngưỡng phát hiện
Ngưỡng phát hiện là nồng ựộ nhỏ nhất của một kháng sinh có trong mẫu mà phương pháp có thể phát hiện ựược. Hay nồng ựộ mà tại ựó có nhiều nhất 5% số mẫu mà phương pháp không phát hiện ựược. Giá trị 5% ựã ựược chọn từ giá trị nồng ựộ giới hạn Beta (CCβ hoặc khả năng phát hiện) ựã ựược mô tả trong Quyết ựịnh của Ủy Ban Châu Âu số 2002/657/CE. Giá trị mà tại ựó Beta (tỷ lệ Ộdương tắnh giảỢ là 5% ựối với các hợp chất có quy ựịnh giới hạn dư lượng tối ựa và 1% ựối với các hợp chất cấm hoàn toàn). Theo khuyến cáo, ựể xác ựịnh ngưỡng phát hiện cần phân tắch 20 mẫu ở một nồng ựộ củng cố, tại ựó chỉ có nhiều nhất một mẫu có kết quả âm tắnh [2].
3.3.4.3. Xác ựịnh tham số và ựộ mạnh của phương pháp
Theo hướng dẫn chuẩn hóa phương pháp sàng lọc của Hiệp hội phòng thắ nghiệm chuẩn Cộng hòa Pháp và Qui ựịnh 2002/657/EC, việc chuẩn hoá