ựĩa mới
Khả năng phát hiện của phương pháp ựược ựánh giá thông qua việc sử dụng các dung dịch kháng sinh chuẩn, phân tắch thử các mẫu trắng và các mẫu trắng ựược củng cố kháng sinh ở các nồng ựộ quan tâm, riêng các mẫu ựược củng cố kháng sinh ở các nồng ựộ quan tâm ựược phân tắch ựồng thời bằng phương pháp Premi Ờ test, Terasensor và phương pháp hai ựĩa mới (NTPT).
Trong khuôn khổ nghiên cứu này, khả năng phát hiện ựược ựánh giá trên cơ sở kết quả của việc thử ựối chứng bằng dung dịch chuẩn, ựánh giá khả năng phát hiện của phương pháp ựối với hai nhóm quan tâm là Tetracyclines và Quinolones nên chỉ quan tâm ựến ựĩa Petri I (pH 6).
3.3.4.1. Thử ựối chứng
Cũng như các phương pháp vi sinh vật khác và khuyến cáo của tác giả chất lượng môi trường và tắnh mẫn cảm của chủng vi sinh vật với kháng sinh cần kiểm tra thường dùng Test ựối chứng dương ựối với một số kháng sinh ựại diện. Riêng ựối với phương pháp hai ựĩa mới (NTPT) trong giai ựoạn thử nghiệm và nghiên cứu này chú trọng hai nhóm kháng sinh ựược dùng phổ biên trong chăn nuôi lợn [27] nên khi xem xét khả năng phát hiện nghiên cứu này thử ựối với tất cả các kháng sinh quan tâm (Oxytetracycline, Doxyxycline, Tetracycline và Chloteracycline ựối với nhóm Tetracyclines và Ciprofloxacin, Enrofloxacin, Difloxacin và Flumequin ựối với nhóm Quinolones):
Thử ựối chứng bằng cách lấy 50ộl dung dịch chuẩn ở nồng ựộ 20ộg/ml nhỏ lên ựĩa giấy ựặt trên mặt thạch ựĩa Petri. Sau khi ủ từ 18 giờ ở 300C tiến hành ựo ựường kắnh của vòng vô khuẩn bằng thước kẹp palme, ựộ chắnh xác 10-2mm. Mỗi kháng sinh chuẩn ựược Test lặp lại 6 lần trên ba lần chuẩn bị môi trường vào ba ngày khác nhau. Mỗi kháng sinh thử trên ba ựĩa Petri cùng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 37
môi trường cùng lần chuẩn bị. Kết quả sẽ so sánh với khuyến cáo của các nghiên cứu trước ựây và khuyến cáo của các test cùng nguyên lý.
3.3.4.2. Xác ựịnh ngưỡng phát hiện
Ngưỡng phát hiện là nồng ựộ nhỏ nhất của một kháng sinh có trong mẫu mà phương pháp có thể phát hiện ựược. Hay nồng ựộ mà tại ựó có nhiều nhất 5% số mẫu mà phương pháp không phát hiện ựược. Giá trị 5% ựã ựược chọn từ giá trị nồng ựộ giới hạn Beta (CCβ hoặc khả năng phát hiện) ựã ựược mô tả trong Quyết ựịnh của Ủy Ban Châu Âu số 2002/657/CE. Giá trị mà tại ựó Beta (tỷ lệ Ộdương tắnh giảỢ là 5% ựối với các hợp chất có quy ựịnh giới hạn dư lượng tối ựa và 1% ựối với các hợp chất cấm hoàn toàn). Theo khuyến cáo, ựể xác ựịnh ngưỡng phát hiện cần phân tắch 20 mẫu ở một nồng ựộ củng cố, tại ựó chỉ có nhiều nhất một mẫu có kết quả âm tắnh [2].
3.3.4.3. Xác ựịnh tham số và ựộ mạnh của phương pháp
Theo hướng dẫn chuẩn hóa phương pháp sàng lọc của Hiệp hội phòng thắ nghiệm chuẩn Cộng hòa Pháp và Qui ựịnh 2002/657/EC, việc chuẩn hoá phương pháp còn ựược thông qua ựánh giá các tham số liên quan ựến khả năng phát hiện và ựộ mạnh của phương pháp trên cơ sở phân tắch các mẫu trắng (ựược coi như mẫu âm tắnh thật) và mẫu trắng ựược củng cố kháng sinh chuẩn (ựược coi như mẫu dương tắnh thật). Lượng kháng sinh chuẩn củng cố vào mẫu trắng phụ thuộc vào sự mẫn cảm của vi khuẩn Bacillus subtilis với các kháng sinh và lượng kháng sinh tối thiểu có khả năng tạo vòng vô khuẩn xung quanh ựĩa giấy có ựộ rộng lớn hơn hoặc bằng 1,5 mm hay tại giá trị giới hạn phát hiện (LOD). Mẫu trắng và mẫu trắng ựược củng cố kháng sinh ựều ựược tách chiết theo quy trình như ựã nêu ở phần trên. Riêng với mẫu trắng ựược củng cố kháng sinh, trước khi tiến hành tách chiết, mẫu trắng ựược nghiền và củng cố kháng sinh, sau ựó mẫu ựược ựể qua ựêm ở 4oC.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 38
Bảng 3.2. Công thức ựược dùng ựể xác ựịnh ựộ xác thực, ựộ ựặc hiệu và ựộ nhạy của phương pháp
Kết quả test Mẫu thực sự dương tắnh (N
+) (mẫu trắng củng cố kháng sinh)
Mẫu thực sự âm tắnh (N-) (mẫu trắng)
Dương tắnh PA (Dương tắnh theo quy ựịnh) FP (Dương tắnh giả)
Âm tắnh FN (Âm tắnh giả) NA (Âm tắnh theo quy ựịnh)
độ xác thực (%) = 100% N NA PA ừ + với N = N+ + N- độ nhạy (%) = 100% N PA ừ + độ ựặc hiệu (%) = 100% N NA ừ −
Mẫu dương tắnh là mẫu có khả năng tạo vòng vô khuẩn ở ắt nhất 1 trong 4 ựĩa giấy với ựộ rộng tối thiểu là 1,5 mm.