thông qua chất chuẩn và mẫu củng cố chất chuẩn
để ựánh giá khả năng phát hiện của phương pháp hai ựĩa mới, phương pháp sẽ ựược thử ựối chứng ựối với chất chuẩn và mẫu củng cố chất chuẩn, tiếp tục ựược xác ựịnh ngưỡng phát hiện và xác ựịnh ựộ tham số ựộ mạnh của phương pháp.
4.1.1.Thử ựối chứng
Cũng như các phương pháp vi sinh vật cùng nguyên lý, ựể kiểm tra chất lượng môi trường và khẳng ựịnh khả năng mẫn cảm của chủng vi sinh vật với kháng sinh ựược thử, khuyến cáo phương pháp hai ựĩa mới cũng khuyến cáo trước mỗi ựợt chuẩn bị môi trường hay một lô ựĩa nên thử ựối chứng. 50 ộl dung dịch kháng sinh chuẩn ựại diện có nồng ựộ 20 ộg/ml ựược nhỏ lên ựĩa giấy ựược ựặt trên mặt thạch (1 ộg kháng sinh/ựĩa). Sau khi ủ ở 300C trong 24 giờ, các ựĩa Petri ựược ựưa ra ựể ựo ựường kắnh vòng vô khuẩn bằng thước ựiện tử có ựộ chắnh xác 10-2 mm.
Hình 4.1. đo vòng vô khuẩn của test ựối chứng
Tetra
Chlo
S.azin
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 41
Trong khuôn khổ một nghiên cứu thử nghiệm trong ựiều kiện khác so với ựiều kiện phát triển phương pháp, mỗi nhóm chọn bốn loại kháng sinh ựại diện ựể thử (kháng sinh ựại diện là các kháng sinh ựược dùng nhiều trong chăn nuôi lợn tại Việt Nam). Mỗi loại kháng sinh ựược Test ựối chứng trên 3 lô ựĩa của 3 ựợt chuẩn bị ở 3 thời ựiểm khác nhau. Mỗi lô một kháng sinh ựược lặp lại 2 lần ở 3 ựĩa khác nhau. Kết quả cho thấy ở môi trường pH 6 tất cả 8 loại kháng sinh hai nhóm Tetracylines và Quinolones ựược thử ựều tạo vòng vô khuẩn rất rõ. Giá trị trung bình ựường kắnh vòng vô khuẩn của ựa số kháng sinh ựược thử ựều lớn hơn hoặc bằng 32 mm với hệ số biến ựộng từ 2,75% ựến 5,0% (bảng 4.1).
Bảng 4.1. Kết quả thử ựối chứng ở môi trường pH 6,0
đường kắnh vòng vô khuẩn (mm) (n=6) Nhóm kháng sinh Kháng sinh Xa ổ sa Nhỏ nhất Ờ Lớn nhất CV % Tetracyline 37ổ 1,0 33-39 4,52 Chlotetrecycline 46 ổ 1,2 45-48 2,75 Oxytetracyline 40 ổ 0,5 39-42 2,93 Tetracylines Doxyxycline 44ổ 1,0 42-46 3,21 Ciprofloxacin 37 ổ 1,0 35-39 4,00 Enrofloxacin 38 ổ 1,0 36-40 3,89 Difloxacin 38 ổ 1,3 35-39 4,00 Quinolones Flumequin 32ổ1,5 29-33 5,02 a
X , sa: Giá trị trung bình ựường kắnh vòng vô khuẩn và ựộ lệch chuẩn của từng kháng sinh
Giá trị trung bình ựường kắnh vòng vô khuẩn của các Quinolones ựều lớn hơn 37 mm, trừ Flumequine (ựường kắnh vòng vô khuẩn là 32 ổ 1,5 mm với hệ số biến ựộng 5,02%). Trong ựó, Enrofloxacine và difloxacine có khả năng tạo vòng vô khuẩn lớn nhất (tương ứng 38 ổ 1,0 mm, với Cv = 3,89% và
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 42
38 ổ 1,3 mm, với Cv = 4%). Còn Ciprofloxacine tạo vòng vô khuẩn có ựường kắnh trung bình là 37,6 ổ 1,0 mm, với hệ số biến ựộng là 4%.
Trong khi ựó, giá trị trung bình ựường kắnh vòng vô khuẩn do các kháng sinh nhóm Tetracyclines tạo ra là 37 ổ 1,0 mm (ựối với Tetracycline); 40 ổ 0,5 mm (Oxytetracycline); 44 ổ 1,0 mm (Doxycyline) và 46 ổ 1,2 mm (Chlotetracyline) với hệ số biến ựộng tương ứng là 4,25%; 2,93%, 3,21% và 2,75%.
Kết quả nghiên cứu hoàn toàn phù hợp với kết quả của Phạm Kim đăng và cộng sự (2008) khi thực hiện thắch ứng phương pháp vi sinh vật ựể phát hiện kháng sinh trong tôm [2].
Kết quả nghiên cứu này cho thấy, các kháng sinh nhóm Quinolones có khả năng tạo vòng vô khuẩn kém hơn kháng sinh nhóm Tetracyclines trên môi trường pH 6. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của các tác giả khác như Okerman và cs.,(2001), Myllyniemi và cs.,(2000) và Phạm Kim đăng.,(2011) [43][41][27]. Tuy nhiên, so với các nghiên cứu của các tác giả khác, ựường kắnh vòng vô khuẩn do nhóm Tetracyclines tạo ra ựều rộng hơn so với các nghiên cứu trước ựây. Sai khác này theo giải thắch của Phạm Kim đăng và cs (2010) [26] là do phương pháp hai ựĩa mới ựã tăng lượng ựường dextrose bổ sung vào môi trường từ 0,4 lên 0,6%. đường kắnh vòng vô khuẩn của tất cả các kháng sinh thuộc nhóm Tetracycline ựược thử trong Test ựối chứng (1 ộg/ựĩa giấy) ựều lớn hơn hoặc bằng 33 mm (tetracycline). Các kết quả này có thể chấp nhận ựược trong phương pháp bốn ựĩa của Châu Âu.
Theo Quy ựịnh về các kỹ thuật sử dụng trong phòng thắ nghiệm ựể phân tắch các lượng chất có tác dụng ức chế vi khuẩn của Bộ môi trường và sức khỏe cộng ựồng Vương quốc Bỉ 1995 [2] và theo khuyến cáo của test ỘthậnỢ Bỉ [37], ựường kắnh vòng vô khuẩn của Test ựối chứng (1ộg/ựĩa giấy) ắt nhất là 18 mm ựối với Oxytetracyline thì có thể coi ựộ nhạy phương pháp của chúng tôi có khả năng ựáp ứng ựể phát hiện hai nhóm kháng sinh ựã ựược thử.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 43
Như vậy, chủng Bacillus subtilis và thành phần môi trường ựược chọn hoàn toàn ựáp ứng cho việc phát hiện hai nhóm kháng sinh quan tâm. để tiếp tục ựánh giá khả năng phát hiện của phương pháp hai ựĩa mới ta xác ựịnh ngưỡng phát hiện của phương pháp.
4.1.2.Xác ựịnh ngưỡng phát hiện
Các phương pháp sàng lọc tồn dư thường ựược chuẩn hoá dựa vào việc phân tắch các mẫu củng cố với một hoặc nhiều kháng sinh ở một nồng ựộ quan tâm nào ựó. Trên thực tế không thể tạo mẫu thực chứa kháng sinh ở một nồng ựộ theo ý muốn từ các loài ựộng vật khác nhau ựược. Hơn nữa không thể ựặt lên mặt thạch trong ựĩa petri một mẩu cơ có cùng khối lượng như yêu cầu của phương pháp 4 ựĩa ựược [38]. Vì thế, một số tác giả ựã dùng dung dịch chiết từ mẫu trắng ựể củng cố kháng sinh. Vì lý do khó khăn thực tế, người ta ựã giả thiết rằng nồng ựộ kháng sinh trong dịch chiết tương ựương với nồng ựộ kháng sinh có trong bản thân mẫu ban ựầu [44].
Trong bước thắch ứng ựầu tiên, phương pháp này ựã ựược chuẩn hoá từ các mẫu trắng ựược nghiền và củng cố với kháng sinh chuẩn thuộc 2 nhóm quan tâm. Sau khi ựược củng cố, mẫu ựược ựể qua ựêm ở 40C trước lúc tách chiết.
Ngưỡng phát hiện của tất cả 8 kháng sinh thuộc 2 nhóm quan tâm ựã ựược xác ựịnh. Ngưỡng phát hiện là nồng ựộ củng cố mà tại ựó có nhiều nhất 5% số mẫu không ựược phát hiện. Cụ thể trong nghiên cứu này, mỗi kháng sinh thử phân tắch 20 mẫu ở một nồng ựộ củng cố thì chỉ có nhiều nhất một mẫu có kết quả âm tắnh. Giá trị 5% ựã ựược chọn từ giá trị nồng ựộ tới hạn beta (CCβ hoặc khả năng phát hiện) ựã ựược mô tả trong Quyết ựịnh của Uỷ ban Châu Âu số 2002/657/CE. Giá trị mà tại ựó sai số beta (tỷ lệ Ộdương tắnh giảỢ là 5% ựối với các hợp chất có quy ựịnh giới hạn dư lượng tối ựa và 1% ựối với các hợp chất cấm hoàn toàn [23]. Trên cơ sở giá trị MIQ của mỗi kháng sinh ựạt ựược và giá trị MRL của chúng, một nghiên cứu thăm dò ựã ựược thực hiện. Kết quả nghiên cứu thăm dò là cơ sở ựể chọn nồng ựộ thử cho từng kháng sinh.
Trên quan ựiểm ựó, mỗi kháng sinh tiến hành phân tắch 20 mẫu củng cố ở các nồng ựộ khác nhau. Nếu tất cả 20 mẫu ựều tạo vòng vô khuẩn lớn hơn
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 44
hoặc bằng 1,5 mm có thể tiến hành thử ở nồng ựộ thấp hơn. Nếu có trên 2 mẫu có vòng vô khuẩn bé hơn 1,5 mm thì sẽ tiến hành thử ở nồng ựộ cao hơn.
Bảng 4.2. Ngưỡng phát hiện của phương pháp
Nhóm kháng sinh Kháng sinh MRL* (ppb) Nồng ựộ củng cố (ppb) Số mẫu dương tắnh (ựộ rộng vòng vô khuẩn ≥ 1,5 mm) Khả năng phát hiện CCβ (ppb) Tetracyline 100 57 19/20 <75 Chlortetracyline 100 20 20/20 <50 Oxytetracyline 100 53 20/20 <75 Tetracyclines Doxycyline 100 23 20/20 <50 Ciprofloxacin 100 53 19/20 <75 Enrofloxacin 100 33 20/20 <75 Difloxacin 400 47 20/20 <50 Quinolones Flumequin 200 90 19/20 <100
(*): Giới hạn tồn dư tối ựa theo quy ựịnh 37/2010/CE
Bảng 4.2 thể hiện kết quả của lần thử cuối mà tại ựó có ắt nhất 19 mẫu tạo vòng vô khuẩn có ựộ rộng lớn hơn hoặc bằng 1,5mm. Kết quả cho thấy cả 8 loại kháng sinh thuộc hai nhóm Tetracyclines và Quinolones ựược thử ựều ựược phương pháp hai ựĩa mới phát hiện ở nồng ựộ thấp hơn giá trị MRL theo qui ựịnh, cụ thể:
- Chlotetracyline và Doxycycline ựược phương pháp phát hiện ở nồng ựộ thấp hơn 0,5 x MRL (thấp hơn 50 ppb). Trong khắ ựó, Ciprofloxacin, Enrofloxacine, Tetracycline và Oxytetracycline ựược phương pháp phát hiện ở nồng ựộ xung quanh giá trị 0,75 x MRL (tương ựương 75ppb).
- đối với Difloxacine ựược phương pháp phát hiện ở nồng ựộ bé hơn 0,25 x MRL (bé hơn 50 ppb). Còn flumequine ựược phương pháp phát hiện ở nồng ựộ bé hơn 0,5 x MRL (bé hơn 100 ppb).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 45
Như vậy, ngưỡng phát hiện của tất cả các kháng sinh ở cả hai nhóm Tetracylines và Quinolones ựược thử ựều ựược xác ựịnh ở nồng ựộ thấp hơn nhiều so với giới hạn tồn dư tối ựa theo Quy ựịnh 37/2010/CE [31] và Quyết ựịnh ựịnh 46/2007/Qđ-BYT của Bộ Y Tế.
4.1.3.Các tham số ựộ mạnh của phương pháp
Theo khuyến cáo trong tài liệu hướng dẫn chuẩn hoá các phương pháp sàng lọc của Hiệp hội phòng thắ nghiệm chuẩn Cộng Hoà Pháp, ựể giảm bớt chi phắ và công việc khi ựánh giá các tham số liên quan ựến hiệu năng của phương pháp có thể chỉ chọn một vài kháng sinh ựại diện cho nhóm [33]. Các kháng sinh ựại diện ựược chọn là những kháng sinh có tác dụng kháng khuẩn tương tự và là các kháng sinh ựược sử dụng phổ biến trong chăn nuôi lợn. Trong khuôn khổ nghiên cứu này, các kháng sinh ựại diện ựã ựược chọn ựể thử từ Test ựối chứng (bảng 4.3).
Bảng 4.3. Các tham số về ựộ mạnh của phương pháp ựối với hai nhóm kháng sinh ựược thử Ngưỡng thử Tham số về ựộ mạnh của phương pháp Nhóm kháng sinh Kháng sinh ựại diện MRL (ng/g) (∗) (ng/g) (MRL) độ xác thực (%) độ nhạy (%) độ ựặc hiệu (%) Tetracycline 100 75 0,75 97,5 95,0 100 Chlotetracycline 100 50 0,50 100 100 100 Oxytetracyline 100 75 0,75 100 100 100 Tetracyclines Doxycyline 100 50 0,50 100 100 100 Ciprofloxacin 100 75 0,75 97,5 95,0 100 Enrofloxacin 100 75 0,75 100 100 100 Difloxacin 400 50 0,125 97,5 95,0 100 Quinolones Flumequine 200 100 0,5 97,5 95,0 100
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 46
Mỗi nhóm kháng sinh có 4 kháng sinh chuẩn ựại diện ựã ựược chọn ựể thử. Với nhóm Tetracyclines (các kháng sinh Tetracycline, Oxytetracycline, Doxycicline và Chlotetracycline) và với nhóm quinolone (Ciprofloxacin, Enrofloxacine, Flumequin và Difloxacine) ựã ựược chọn ựể thử. Mỗi kháng sinh chuẩn ựại diện, tiến hành phân tắch 20 mẫu trắng (ựược coi như mẫu Ộâm tắnh thậtỢ) và 20 mẫu trắng củng cố ở nồng ựộ bằng ngưỡng phát hiện của phương pháp (ựược coi như mẫu Ộdương tắnh thậtỢ). Các số liệu thu ựược trình bày trong bảng 4.3 và các tham số của phương pháp ựược tắnh dựa vào các công thức ựược mô tả ở phần 3.3.
Kết quả Bảng 4.3 cho thấy, phương pháp có thể phát hiện 2 nhóm kháng sinh ựược thử ở nồng ựộ rất gần nồng ựộ MRL của chúng với một ựộ xác thực, ựộ nhạy có thể chấp nhận ựược (tất cả ựều lơn hơn hoặc bằng 95%). độ xác thực, ựộ nhạy của phương pháp là 100% ựối với Chlotetracycline (ở nồng ựộ 0,5 x MRL), Oxytetracycline (ở nồng ựộ 0,75 x MRL), Doxycycline (ở nồng ựộ 0,5 x MRL) và Enrofloxacine (ở nồng ựộ 0,75 x MRL).
Với các kháng sinh còn lại, phương pháp có thể phát hiện ở nồng ựộ bằng 0,75 x MRL (ựối với Tetracycline và Ciprofloxacine), ở 0,125 x MRL (ựối với Difloxacine) và ở 0,125 x MRL (ựối với Flumequine) với ựộ xác thực và ựộ nhạy tương ứng là 97,5% và 95,0%. độ ựặc hiệu của phương pháp (ựược ựánh giá bằng phần trăm mẫu thực sự âm tắnh sau khi sáng lọc cho kết quả âm tắnh) của tất cả các kháng sinh ựược thử ở nồng ựộ nêu trên ựều ựạt 100%.
Như vậy, thông qua việc phân tắch các mẫu trắng và mẫu ựược củng cố với 8 loại kháng sinh ựại diện cho 2 nhóm, ựộ xác thực, ựộ nhạy của phương pháp ựã tắnh toán và khẳng ựịnh thêm phương pháp có khả năng phát hiện cả 2 nhóm kháng sinh ở những nồng ựộ (bằng giới hạn phát hiện (LOD) của chúng) với một ựộ xác thực và ựộ nhạy chấp nhận ựược. độ xác thực của phương pháp cao hơn hoặc bằng 95% ựối với tất cả 8 kháng sinh ựại diện tại nồng ựộ bằng LOD của chúng. Các kết quả này thoả mãn và ựáp ứng những yêu cầu tối thiểu của Quyết ựịnh số 2002/657/CE.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 47