đánh giá khả năng phát hiện βagonists trong thịt lợn bằng kit elisa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM THỊ TRANG ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN β-AGONISTS TRONG THỊT LỢN BẰNG KIT ELISA LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI, NĂM 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM THỊ TRANG ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN β-AGONISTS TRONG THỊT LỢN BẰNG KIT ELISA CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS ĐỒNG HUY GIỚI TS BÙI THỊ PHƯƠNG HÒA HÀ NỘI, NĂM 2014 LỜI CAM ĐOAN - Tôi xin cam đoan rằng, số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị - Tôi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 25 tháng 09 năm 2014 Tác giả luận văn PHẠM THỊ TRANG Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với: TS Đồng Huy Giới TS Bùi Thị Phương Hòa tận tình giúp đỡ trình nghiên cứu đề tài hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô khoa Công nghệ sinh học, Bộ môn sinh học tận tình dạy dỗ đóng góp ý kiến quý báu để hoàn thành luận văn Tôi trân thành cảm ơn lãnh đạo Trung tâm Kiểm tra vệ sinh thú y trung ương I - Cục Thú y - Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn cho phép triển khai tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn bạn đồng nghiệp Trung tâm Kiểm tra vệ sinh thú y trung ương I gia đình động viên, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình thực đề tài Hà Nội, ngày 25 tháng 09 năm 2014 PHẠM THỊ TRANG Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii MỞ ĐẦU .viii Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một số hiểu biết nhóm β-agonists 1.1.1 Khái niệm nhóm β-agonists 1.1.2 Cấu trúc chế tác động thể β-agonists 1.2 Tình hình sử dụng β-agonists giới Việt Nam 1.2.1 Tình hình sử dụng β-agonists giới 1.2.2 Tình hình sử dụng β-agonists Việt Nam 11 1.3 Sự lạm dụng β-agonists chăn nuôi nguy tồn dư thịt lợn 14 1.3.1 Khái niệm tồn dư 14 1.3.2 Tồn dư β-agonists thịt ảnh hưởng chúng sức khỏe cộng đồng 18 1.4 Phương pháp phân tích yêu cầu phương pháp phân tích βagonist thịt lợn 21 1.4.1 Phương pháp phân tích β-agonist thịt lợn 21 1.4.2 Nghiên cứu tính phù hợp phương pháp phân tích 26 1.5 Kĩ thuật phân tích dư lượng β-agonist thịt lợn 27 1.5.1 Phương pháp định tính 27 1.5.2 Phương pháp định lượng 28 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii Chương VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Vật liệu nghiên cứu: 30 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 30 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 30 2.1.3 Thời gian nghiên cứu 30 2.1.4 Vật liệu, hóa chất thuốc thử 30 2.1.5 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 32 2.2 Nội dung nghiên cứu 33 2.3 Phương pháp nghiên cứu 33 2.3.1 Thí nghiệm 1: Thí nghiệm nghiên cứu tính phù hợp kit ELISA dùng cho phân tích định tính xác định β-agonists thịt lợn 33 2.3.2 Thí nghiệm 2: Thí nghiệm nghiên cứu phương pháp LC/MS/MS dùng cho phân tích định lượng xác định β-agonists thịt lợn 38 2.3.3 Ứng dụng kết nghiên cứu phương pháp để phân tích mẫu thực 40 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1 Kết nghiên cứu tính phù hợp kit ELISA dùng cho phân tích định tính xác định β-agonists thịt lợn 44 3.1.1 Kết nghiên cứu tính ổn định kit ELISA 44 3.1.2 Kết xác định giới hạn phát (LOD) kit ELISA 46 3.1.3 Kết nghiên cứu khả phát kit (ccβ) 49 3.1.4 Kết xác định độ xác (accuracy:AC), độ đặc hiệu (specificity:SP), độ nhạy (sensitivity:SE), độ lệch dương (positive deviation:PD) độ lệch âm (negative deviation:ND) 50 3.1.5 Kết nghiên cứu đảm bảo chất lượng kết thử nghiệm kit ELISA 52 3.2 Kết nghiên cứu phương pháp LC/MS/MS dùng cho phân tích định lượng xác định β-sgonists thịt lợn 53 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv 3.2.1 Kết nghiên cứu giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) phương pháp 53 3.2.2 Kết nghiên cứu độ thu hồi (R), độ chụm (CV) phương pháp 54 3.2.3 Kết nghiên cứu đảm bảo chất lượng kết thử nghiệm phương pháp 56 3.3 Kết phân tích dư lượng β-agonists mẫu thịt lợn kit ELISA kỹ thuật LC/MS/MS 59 3.3.1 Kết phân tích dư lượng β-agonists mẫu thịt lợn kit ELISA 59 3.3.2 Kết phân tích dư lượng β-agonists mẫu thịt lợn kỹ thuật LC/MS/MS 60 3.3.3 So sánh tương đồng kết phân tích ELISA LC/MS/MS 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 KẾT LUẬN 66 KIẾN NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 70 PHỤ LỤC 66 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1: Quy định Codex cập nhật hội nghị CAC lần 32 tháng 7/ 2009 15 Bảng 1.2: Giới hạn yêu cầu tối thiểu cho phép (MRPL) PTN tham chiếu CRL Đức 16 Bảng 1.3: Ngưỡng MRPL β-agonists loại mẫu việt Nam (Bộ NN PTNT, 2012) 18 Bảng 2.1: Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc 32 Bảng 3.1: Kết phân tích kiểm tra đường chuẩn 45 Bảng 3.2: Kết phân tích kết tính toán giới hạn phát (LOD) β-agonists thịt 48 Bảng 3.3: Kết xác định khả phát phương pháp nồng độ 0,1 µg/kg 49 Bảng 3.5: Kết đánh giá độ xác (AC), độ đặc hiệu (SP), độ nhạy (SE), độ lệch dương (PD) độ lệch âm (ND) kit 51 Bảng 3.6: Kết kiểm tra mẫu mù 52 Bảng 3.7: Kết độ thu hồi(R%), độ chụm (CV%) phương pháp xác định dư lượng salbutamol, clenbuterol mẫu thịt LC/MS/MS 55 Bảng 3.9: Biểu mẫu kiểm soát chất lượng kết thử nghiệm 58 Bảng 3.10: Kết phân tích dư lượng β-agonists mẫu thịt lợn kỹ thuật ELISA 59 Bảng 3.11: Kết phân tích dư lượng β-agonists (salbutamol, clenbuterol) mẫu thịt lợn kỹ thuật LC/MS/MS 61 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC HÌNH STT Hình 1.1 Tên hình Trang Bao chất tạo nạc Super Weight 02 phát Đồng Nai ngày 10/3/2011 12 Hình 1.2 Sơ đồ mô phương pháp ELISA sandwich ELISA cạnh tranh 24 Hình 3.1 Tỷ số tín hiệu so với nhiễu clenbuterol, salbutamol mẫu thịt 54 Hình 3.2 Tỷ lệ % mẫu thịt nhiễm Salbutamol Clenbuterol 62 Hình 3.3 Sự tương đồng kết phân tích salbutamol thịt lợn ELISA LC/MS/MS 63 Hình 3.4 Sự tương đồng kết phân tích clenbuterol thịt lợn ELISA LC/MS/MS 64 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AC: Độ xác (Accuracy) CCα: Giới hạn định CCβ: Khả phát Cty TNHH: Công ty trách nhiệm hữu hạn ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay EU: European Union FAO: Food Agricultural Organization FDA: Food and Drug Administration FSIS: Food Safety and Inspection Service HPLC: High-performance liquid chromatograph LC/MS/MS: Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid Chromatography/Mass Spectrometer) LOD: Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ: Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) MRL: Maximum Residue Limit MRPL: Minimum Required Performance Limit ND: Độ lệch âm (Negative deviation) NN&PTNT: Nông nghiệp Phát triển nông thôn PD: Độ lệch dương (Positive deviation) ppb: Phần tỷ (Parts per billion) SE: Độ nhạy (Sensitivity) SP: Độ đặc hiệu (Specificity) TĂCN: Thức ăn chăn nuôi TP.HCM: Thành phố Hồ Chí Minh WTO: World Trade Organization Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii Kết bảng cho thấy tổng số 140 mẫu thịt lợn qua phân tích sàng lọc ELISA có 14 mẫu nghi ngờ nhiễm β-agonists, chiếm tỷ lệ 10% tổng số mẫu phân tích ELISA kỹ thuật sàng lọc hiệu để loại bỏ mẫu âm tính Bằng phân tích sàng lọc, loại bỏ 130/140 mẫu âm tính với β-agonists Đây kỹ thuật áp dụng phổ biến phòng thử nghiệm phân tích dư lượng thực phẩm nhiều nước giới trở thành công cụ hữu hiệu quan thẩm quyền chấp thuận cho phép sử dụng với mục đích thử nghiệm sàng lọc (Screening method) Ở Việt Nam, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2012) quy định ELISA phương pháp phân tích sàng lọc chất thuộc nhóm β-agonists thức ăn chăn nuôi, sản phẩm chăn nuôi Tuy nhiên phương pháp áp dụng phòng thử nghiệm bao gồm phương pháp phân tích sàng lọc ELISA cần phải nghiên cứu phê duyệt phương pháp, có chứng để chứng minh phương pháp phù hợp cho mục đích phân tích Nội dung quy định chi tiết Thông tư 54/2011/TT-BNNPTNT ngày 03/08/2011 Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn yêu cầu lực cho phòng thử nghiệm có khả phân tích phép thử thuộc lĩnh vực sinh học, hóa học phục vụ công tác quản lý Nhà nước chất lượng an toàn thực phẩm Thông tư hoàn toàn tương đương với Quyết định 657/2002/EC cộng đồng chung châu Âu phê duyệt phương pháp thử 3.3.2 Kết phân tích dư lượng β-agonists mẫu thịt lợn kỹ thuật LC/MS/MS Các mẫu có kết dương tính với ELISA phân tích khẳng định định lượng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS/MS) theo quy trình xác định Kết trình bày bảng 3.11: Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 60 Bảng 3.11: Kết phân tích dư lượng β-agonists (salbutamol, clenbuterol) mẫu thịt lợn kỹ thuật LC/MS/MS Clenbuterol STT Kí hiệu Kết mẫu dương tính/ âm tính (+/-) Nồng độ nhiễm (µg/kg) Salbutamol Kết dương tính/ âm tính (+/-) Nồng độ nhiễm (µg/kg) GS84 - - GS604 - - GS622 - - GS644 - + 0,46 GS645 - + 0,34 GS646 - + 0,51 GS647 - - GS728 - - LS231 + 10 LS232 - 11 LS233 + 12 LS234 13 14 + 2,71 + 1,57 + 2,03 - + 1,17 LS235 - + 1,15 LS240 + 0,54 0,52 0,39 - Kết phân tích bảng 3.11 cho thấy: số 14 mẫu thịt lợn nghi ngờ nhiễm β-agonists kỹ thuật ELISA khẳng định định lượng kỹ thuật LC/MS/MS có 08 mẫu thịt nhiễm salbutamol, chiếm 5,7% tổng số mẫu phân tích; 03 mẫu thịt nhiễm clenbuterol, chiếm 2,1% tổng số mẫu phân tích Các mẫu bị nhiễm Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 61 salbutamol với hàm lượng từ 0,34 - 2,71µg/kg mẫu bị nhiễm clenbuterol hàm lượng mẫu từ 0,39 - 0,54 µg/kg Số mẫu bị nhiễm salbutamol nhiều số mẫu bị nhiễm clenbuterol Đặc biệt, mẫu LS231 LS233 bị nhiễm salbutamol clenbuterol Tỷ lệ % mẫu thịt nhiễm salbutamol clenbuterol tổng số mẫu phân tích thể hình 3.2: Hình 3.2 Tỷ lệ % mẫu thịt nhiễm Salbutamol Clenbuterol 3.3.3 So sánh tương đồng kết phân tích ELISA LC/MS/MS Kết phân tích mẫu thịt lợn nhiễm salbutamol clenbuterol kit ELISA kỹ thuật LC/MS/MS trình bày hình 3.3 3.4 Các giá trị hàm lượng salbutamol clenbuterol xác định kit ELISA kỹ thuật LC/MS/MS mẫu thể cột Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 62 Hình 3.3 Sự tương đồng kết phân tích salbutamol thịt lợn ELISA LC/MS/MS Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 63 Hình 3.4 Sự tương đồng kết phân tích clenbuterol thịt lợn ELISA LC/MS/MS Hình 3.3 3.4 cho thấy có tương đồng kết ELISA LC/MS/MS Kết cho thấy dư lượng salbutamol clenbuterol có mẫu thịt Phương pháp sàng lọc ELISA phát thấy 14/140 mẫu thịt lợn nhiễm βagonists khẳng định định lượng phương pháp LC/MS/MS có 11/14 mẫu phát thấy salbutamol và/hoặc clenbuterol thuộc nhóm β-agonists đó: số 14 mẫu thịt phát thấy có clenbuterol, mẫu số 14 mẫu thịt phát thấy có chứa salbutamol Điều mẫu thịt salbutamol clenbuterol số chất khác ractopamine, bitolterol, carbuterol, mà phương pháp phân tích định lượng LC/MS/MS áp dụng nghiên cứu chưa có điều kiện phân tích tất chất nhóm Kết chấp nhận theo protocol nhà sản xuất, salbutamol clenbuterol, kit có phản ứng đặc hiệu mức cao (≥70%) với nhiều chất khác nhóm β-agonists bitolterol, carbuterol, cimbuterol Trong số mẫu phân tích khẳng định định lượng phương pháp LC/MS/MS có kết dương tính với β-agonists, đáng lưu ý có số 14 mẫu phát thấy salbutamol clenbuterol Có thể phối hợp salbutamol clenbuterol người chăn nuôi lạm dụng chất cấm bất hợp pháp thị trường có bán sản phẩm hỗn hợp Nhóm β-agonists cấm sử dụng chăn nuôi động vật sản xuất thực phẩm (Bộ NN PTNN, 2012) Kết nghiên cứu cho thấy lạm dụng chất cấm β-agonists sản xuất thịt lợn Kết nghiên cứu phù hợp với nhận định Nguyễn Thị Thu Thủy (2011) nguy ô nhiễm chất cấm β-agonists sản xuất thịt lợn năm Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 64 Các phương pháp áp dụng phân tích mẫu, định tính định lượng hợp lệ theo quy định định 657/2002/EC Văn phòng công nhận chất lượng VILAS (2005) Tuy nhiên, phương pháp phân tích sàng lọc bỏ sót tỷ lệ nhỏ mẫu thịt ô nhiễm với β-agonists ngưỡng giới hạn chuẩn hóa nghiên cứu cao ngưỡng giới hạn protocol nhà sản xuất kit Hơn nữa, phương pháp phân tích khẳng định định lượng β-agonists nghiên cứu tập trung vào 02 chất nhóm salbutamol clenbuterol không phân tích tất chất có nhóm β-agonists bitolterol, carbuterol, ractopamine…Như thế, tỷ lệ mẫu phát thấy β-agonists mẫu thịt nghiên cứu tỷ lệ mẫu phát thấy salbutamol clenbuterol; tỷ lệ mẫu thịt lợn nhiễm nhiễm β-agonists nói chung cao Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 65 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Bộ kit ELISA dùng cho phân tích định tính dư lượng β-agonists thịt lợn hãng Biooscientific (MaxSignalTM β-agonist, mã 1009) có tính ổn định, khả phát hiện, hiệu lực kit điều kiện phòng thử nghiệm là: Giới hạn phát (LOD) 0,062 µg/kg Độ xác (AC): 95% (AC ≥ 90%) Độ đặc hiệu (SP): 95% (SP ≥ 90%) Độ nhạy (SE) : 95% (SE ≥ 90%) Độ lệch dương (PD) : 5% (PD ≤ 10%) Độ lệch âm (ND) : 5% (ND ≤ 10%) Kết đáp ứng yêu cầu phương pháp định tính quy định định 657/2002/EC Phương pháp LC/MS/MS phù hợp để phân tích dư lượng β-agonists (salbutamol, clenbuterol) thịt lợn ngưỡng giới hạn phát 0,1 µg/kg giới hạn định lượng 0,3 µg/kg Có tương đồng kết phân tích dư lượng β-agonists (salbutamol, clenbuterol) thịt lợn kit ELISA hãng Biooscientific (MaxSignalTM βagonist, mã 1009) phương pháp phân tích định lượng LC/MS/MS Trong 140 mẫu thịt lợn phân tích, có 3/140 mẫu có tồn dư clenbuterol (với hàm lượng 0,39 – 0,54 µg/kg), 8/140 mẫu có tồn dư salbutamol (với hàm lượng 0,34 – 2,71 µg/kg) KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu kit ELISA β-agonists hãng Biooscientific (MaxSignalTM β-agonist, mã 1009) mẫu thịt gia súc, gia cầm khác để nghiên cứu phù hợp kit cho mục đích sử dụng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Võ Thị Trà An (2001) Tình hình sử dụng kháng sinh dư lượng kháng sinh thịt gà sở chăn nuôi gà công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh, Luận Văn thạc sĩ Khoa Học Nông Nghiệp, Đại Học Nông Lâm, Thành phố Hồ Chí Minh Võ Thị Trà An (2007) Kháng sinh cho vật nuôi, Nhà xuất Đà Nẵng Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2002) Quyết định số 54/2002 QĐ-BNN ngày 20 tháng 06 năm 2002 việc cấm sản xuất, nhập khẩu, lưu thông sử dụng số loại kháng sinh hóa chất sản xuát kinh doanh thức ăn chăn nuôi Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2012) Thông tư số 57/2012/TT-BNNPTNT ngày 07 tháng 11 năm 2012 Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn quy định việc kiểm tra, giám sát chất thuộc nhóm β-agonists chăn nuôi Bộ Y tế (2002) Tin ngắn, Tạp chí thuốc sức khỏe, (210) ngày 15/4/2002 Bộ Y tế (2007) Quyết định số 46 /2007/QĐ-BYT ngày 19 tháng 12 năm 2007 Bộ trưởng Bộ Y tế việc quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học hóa học thực phẩm Đoàn Thị Khang, Phan Thanh Đạm, Dương Thị Thu Anh Đào Đức Hảo (2008) Ứng dụng kỹ thuật ELISA để xác định clenbuterol salbutamol thức ăn chăn nuôi, Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi số 13, tháng 8/2008 Ngọc Lê (2012) Đã kiểm soát chất tạo nạc, Truy cập ngày 28/5/2014 từ http://vietbao.vn/Kinh-te/Da-kiem-soat-duoc-chat-tao-nac/55447631/88/ Dương Thanh Liêm, Bùi Như Phúc Dương Duy Đồng (2002) Thức ăn dinh dưỡng vật nuôi, NXB Đại học Nông Lâm, TP HCM, tr 146-179 10 Phạm Thị Kiều Nga (2008) Bước đầu khảo sát dư lượng dexamethasone clenbuterol thịt bò, heo gà TP.HCM, Luận văn, Đại học Nông lâm TP.HCM 11 Phạm Nho Huỳnh Hồng Quang (2012) β-agonist: Ứng dụng nguy ảnh hưởng đến sức khỏe người, Truy cập ngày 3/3/2014 từ http://www.impe-qn.org.vn/impeqn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=1092&ID=5756 12 Nguyễn Tâm (2012) Ba tỉnh phát có mẫu thịt chứa chất tạo nạc, Truy cập ngày 28/5/2014 từ http://vtc.vn/321-328138/suc-khoe/ba-tinh-phat-hien-co-mau-thit-chuachat-tao-nac.htm 13 Nguyễn Thị Thu Thủy (2011) Đánh giá hàm lượng chất β-agonist (clenbuterol salbutamol) thức ăn gia súc dư lượng thịt gia súc kỹ thuật sắc ký lỏng 14 Phan Thị Nhã Tú (2007) Điều tra tình hình tồn dư dexamethasone nhóm β –agonists gan thịt heo phương pháp ELISA số tỉnh lân cận Tp HCM, Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Chăn Nuôi Thú Y Đại Học Nông Lâm Tp HCM Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 67 Tiếng Anh 15 Andrzej Posyniak, Jan Zmudzki and Jolanta Niedzielska (2003) Screening procedures for clenbuterol residue determination in bovine urine and liver matrices using enzyme – linked immunosorbent assay and liquid chromatography, Analytica Chimica Acta 483: 61–67 16 Baker P.K., Dalrymple R.H., Ingle D.L., Ricks C.A., (1984) Use of a β-adrenergic agonist to alter muscle and fat deposition in lambs, Journal of Animal Science, 59: 1256-1261 17 Barbosa, J., Cruz, C., Martin, J., Siva, J M., and Neves, C (2005) Food poisoning by clenbuterol in Portugal, Laboratorio Nacional de Investigacao Veterinaria, Lisboa, Portugal, 563: 18 Bucknall, S D., MacKenzie, A L., Sauer, M J., Everest, D J., Newman, R and Jackman, R (1993) Determination of clenbuterol in bovine liver by enzyme immunoassay, Analytica Chimica Acta, 275: 227-230 19 Crescenzi, C., Bayoudh, S., Cormack, P A G., Klein, T., and Ensing, K (2001) Determination of Clenbuterol in Bovine Liver by Combining Matrix Solid-Phase Dispersion and Molecularly Imprinted Solid-Phase Extraction Followed by Liquid Chromatography/Electrospray Ion Trap Multiple –Stage Mass Spectrometry, Anal, Chem, 73: 2171- 2177 20 Dalrymple, R H., Baker, P K., Gingher, P E., Ingle, D L., Pensack, J M & Ricks, C A (1984) A repartitioning agent to improve performance and carcass composition of broilers, Poultry Science, 63: 2376-2383 21 Dickson, L.C.; MacNeil, J.D.; Lee, S & Fesser, A.C (2005) Determination of betaagonist residues in bovine urine using liquid chromatography-tandem mass spectrometry, Journal of AOAC International, 88(1): 46-56 22 EC (1996) Council Directive 96/22/EC of 29 April 1996 concerning the prohibition on the use in stockfarming of certain substances having a hormonal or thyrostatic action and of ß-agonists, and repealing Directives 81/602/EEC, 88/146/EEC and 88/299/EEC, Official Journal of the European Communities, L125, 3-9 23 EU (2002): EU regulation, European commission decision 2002/657/EC 24 Gianfranco Brambilla, Maurizio Fiori, Barbara Rizzo,Vittorio Crescenzi, and Giancarlo Masci (2001) Use of molecularly imprinted polymers in the solid-phase extraction of clenbuterol from animal feeds and biological matrices, Journal of Chromatography B 759, pp 27–32 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 68 25 Guy Degand and Anne Bernes-Duyckaerts (1993) Determination of β-agonists in urine by an enzyme immunoassay based on the use of an anti-salbutamol antiserum, Analytica Chimica Acta, 275: 241-247 26 Jose Blanca, Patricia Mu noz, Miguel Morgado, Nely M endez, Angela Aranda, Thea Reuvers and Henny Hooghuis (2005) Determination of clenbuterol, ractopamine and zilpaterol in liver and urine by liquid chromatography tandem mass spectrometry, Analytica Chimica Acta 529: 199–205 31 Kootstra, P R., Kuijpers, C.J.P.F., Wubs, K.L, Doorn D.van, Sterk S.S., van Ginkel L.A and Stephany, R.W (2005) The analysis of β-agonists in bovine muscle using molecular imprinted polymers with ion trap LCMSs creening, Analytica Chimica Acta 529: 75–81 27 Kuiper, H A., Noordam, M.Y., Schlit, R (1998) Illegal use of β-adrenergic agonists: European community-State Institute for Quality Control of Agricultural Products, P.O Box 230, 6700 AE Wageningen, The Nethelands, pp195-207 28 Michael and O’Keeffe (1999) Methods for veterinary drug residue analysis in food, The National Food Centre, Dunsinea, Castle nock, Dublin, 15: – 25 29 Miller, M F., Garcia, D K., Coleman, M E., Ekeren, P A., Lunt, D K., Wagner, K A., Procknor, M., Welsh, T H Jr & Smith, S B (1988) Adipose tissue, longissimus muscle and anterior pituitary growth and function in clenbuterol-fed heifers, Journal of Animal Science, 66: 12-20 30 Ones R.W., Easter R.A., Mckeith F.K., Dalrymple R.H., Maddock H.M., Bechtel P.J (1985) Effect of the β-adrenergic agonist cimaterol on the growth and carcass characteristics of finishing swine, Journal of Animal Science, 61: 905-913 31 Pulce, C., Lamaison, D., Keck, G., Bostvironnois, C., Nicolas, J & Descotes, J (1991) Collective human food poisonings by clenbuterol residues in veal liver Veterinary Human Toxicology, pp 480-482 32 Ricks, C A., Dalrymple, R H., Baker, P K & Ingle, D L (1984) Use of a β-agonist to alter fat and muscle deposition in steers, Journal of Animal Science, 59: 1247-1255 33 Rose, M D., Shearer, G., Farrington, W H (1995) The effect of cooking on veterinary drug residues in food Ministry of Agriculture, Fisheriers and Food, pp 67-76 34 WHO/FAO (2004) Pesticide residue in food, Report of Joint meeting of the FAO panel of expert on Pesticide residue in food and environment, 14-24 september 2004, Rome 35 Witkamp, R F (1996) Pharmacological and toxicological properties of β-agonists In Residues of veterinary drugs and mycotoxins in animal products, Anonymous (Ed.), Wageningen Pers, Wageningen, pp 113-123 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 69 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ Xác định dư lượng β-agonists (salbutamol, clenbuterol, ractopamin) thịt tươi phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu hai lần khối phổ (UPLC/MS/MS) (Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y – Tập XXI số 5/ 2014) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 70 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thời gian sản xuất, thời gian hết hạn cách bảo quản kit dùng nghiên cứu tính ổn định kit Lô kit Ngày sản xuất Ngày hết hạn Bảo quản Lô 28/06/2013 02/11/2014 2-80C Lô 05/07/2013 09/11/2014 2-80C Lô 15/08/2013 20/12/2014 2-80C Lô 23/10/2013 28/02/2015 2-80C Lô 11/12/2013 04/06/2015 2-80C Trong trường hợp dự định sử dụng kít vòng tháng nên bảo quản β-agonist antibody #1 100X HRB-conjugated antibody #2 -200C tủ âm Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 71 Phụ lục 2: Một số hình ảnh nghiên cứu Mẫu sau cho chất ủ 15 phút nhiệt độ phòng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 72 Mẫu trước đo mật độ quang Hệ thống máy LC/MS/MS Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 73 Bộ Kit ELISA Max SignalTM (Mỹ) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 74 [...]... tồn dư độc hại trong thực phẩm có nguồn gốc động vật, đảm bảo cung cấp thực phẩm an toàn cho nguời tiêu dùng, việc nghiên cứu: Đánh giá khả năng phát hiện β-agonists trong thịt lợn bằng kit ELISA là rất có ý nghĩa khoa học và hoàn toàn cần thiết 2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài - Đánh giá sự phù hợp của kit ELISA được lựa chọn để phân tích định tính dư lượng β-agonists trong thịt lợn - Sử dụng phương... β-agonists trong thịt Tecna, Randox, Euro-diagnostica, Biooscientific, Taiwan Advance Mỗi loại kit ELISA để phân tích định tính dư lượng β-agonists trong thịt của các hãng khác nhau là khác nhau rất nhiều về khả năng ứng dụng theo mục đích sử dụng và điều kiện thực tế tại phòng thử nghiệm ở Việt Nam Việc đánh Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2 giá loại kit ELISA. .. và nhóm β-agonists trong gan và thịt lợn bằng phương pháp ELISA trong 130 mẫu gan và thịt lợn ở một số tỉnh lân cận và TP HCM Kết quả có 28 mẫu phát hiện thấy tồn dư β-agonists, chiếm 21,54% Ở Đồng Nai, Ngày 12/3/2011, Đội Quản lý thị trường cơ động của Chi cục Quản lý thị trường Đồng Nai đã kiểm tra đột xuất Cty TNHH Nhân Lộc, tại xã Bình Lợi, huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai, phát hiện gần 2,5 tấn chất... cầu của phương pháp phân tích β-agonist trong thịt lợn 1.4.1 Phương pháp phân tích β-agonist trong thịt lợn 1.4.1.1 Phương pháp phân tích định tính ELISA (phương pháp sàng lọc) 1.4.1.1.1 Khái niệm về ELISA ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên dựa trên miễn dịch học, được dùng rất phổ biến trong lĩnh vực y học, dược học, sinh học,... Hà Nội đã phát hiện 8 mẫu thịt dương tính với chất tạo nạc (gốc β- agonits) trong 227 mẫu gồm thức ăn chăn nuôi, thịt lợn được kiểm nghiệm Năm 2012, qua kết quả kiểm tra, phân tích 286 mẫu (TĂCN) lấy tại các tỉnh, thành trên cả nước phát hiện có 13 mẫu (chiếm tỷ lệ 4,8%) dương tính với nhóm chất cấm β- agonists Riêng tại khu vực miền Bắc, phát hiện 3/150 mẫu dương tính với nhóm chất này, trong đó có... phân tích là rất cần thiết ELISA ( Enzyme – Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu cần phân tích Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm thực phẩm Trên thị trường hiện nay có nhiều loại kit ELISA của các hãng khác... phố Hồ Chí Minh, có tới 43% mẫu thịt và 26% mẫu nước tiểu được kiểm nghiệm dương tính với β- agonists Theo Chi cục Thú y Tp Hồ Chí Minh, năm 2006 xét nghiệm gần 500 mẫu thịt lợn tại Tp Hồ Chí Minh, đã phát hiện gần 30% mẫu dương tính với clenbuterol Tháng 11/2009 Chi cục Thú y TP.HCM phối hợp với Sở Y tế TP.HCM kiểm tra định kỳ thịt lợn đã phát hiện có đến 10% của 500 mẫu thịt dương tính với clenbuterol... ở Hòa Bình và Hải Dương, 1 mẫu gan lợn ở Bắc Ninh Cũng theo kết quả này, Cục Chăn nuôi đã phát hiện có 8/179 mẫu thịt, gan lợn dương tính với β- agonists (chiếm 4,4%) Việc xét nghiệm trên nước tiểu lợn cũng được tiến hành với 108 mẫu, trong đó có 7 mẫu (6,4%) dương tính với β- agonists Ngoài ra, cũng có 2/18 mẫu thuốc thú y (11,1%) có chứa βagonists đã được phát hiện (Ngọc Lê, 2012) Ngày 11/4/2012,... dư lượng β-agonists trong thịt lợn phải phù hợp với quy định trong Quyết định số 2002/657/EC do Ủy ban Châu Âu thiết lập cho phương pháp bán định lượng và cần được khẳng định bằng phương pháp định lượng Sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS/MS) Để góp phần giúp cơ quan có thẩm quyền, đặc biệt là Cục Thú y lựa chọn loại kit ELISA phù hợp cho phân tích định tính dư lượng β-agonists trong thịt lợn, góp phần xây dựng... định và pha tự do Sau đó là bước loại bỏ pha tự do Yếu tố phát hiện được thêm vào sau để phát hiện sự có mặt của yếu tố cần chẩn đoán còn lại trên pha cố định thông qua hoạt tính của enzyme Phương pháp EILSA phân chia gồm: * ELISA trực tiếp: - Yếu tố chẩn đoán (kháng nguyên) cố định trực tiếp lên bề mặt rắn sau đó được phát hiện bằng yếu tố phát hiện - Mô phỏng như sau: ]=Ag + Ab•E → ]=Ag-Ab•E - Phương