2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
2.3.2. Thí nghiệm 2: Thí nghiệm nghiên cứu phương pháp LC/MS/MS dùng
cho phân tích định lượng xác định β-agonists trong thịt lợn.
Thí nghiệm 2.1: Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp
Thêm dung dịch chuẩn Salbutamol, Clenbuterol vào mẫu thịt (mẫu trắng) để
nồng độ trong mẫu 0,1: 0,15: 0,2: 0,25 µg/kg. Xử lý mẫu và thực hiện phân tích trên thiết bị LC/MS/MS theo các điều kiện đã chọn. Tìm nồng độ chuẩn trong nền mẫu tối thiểu của Clenbuterol và Salbutamol (Cmin clen và Cmin sal) sao cho sau khi tách chiết, làm sạch, tiêm vào máy với thể tích 10 µL dung dịch, mũi sắc đồ khối có tỷ số
(T) của tín hiệu (S) so với nhiễu đường nền (N) đáp ứng được điều kiện:
S
3 ≤ T = ---- ≤ 15 Trong đó S là tín hiêu; N là nhiễu đường nền
N
Khi đó giới hạn phát hiện (LOD) được tính theo công thức:
Cmin
LOD = 3 x --- <15 Trong đó Cmin lànồng độ cho mũi sắc đồ
T có tỷ số T
Giới hạn định lượng (LOQ) được tính theo công thức: LOQ = 3 x LOD
Thí nghiệm 2.2: Xác định độ thu hồi (R%), độ chụm (CV%) của phương pháp
Chuẩn bị mẫu thịt âm tính thêm chuẩn β-agonists (clenbuterol, salbutamol)
có nồng độ 0,4; 0,6; 0,8 µg/kg và nội chuẩn là 1ppb: Cân 5,0g ± 0.1g mẫu thịt đã
được xay nhỏ, đồng nhất cho vào ống ly tâm. Thêm 20; 30; 40 µl ở nồng độ 100
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 39
(salbutamol-d3, clenbuterol- d9) 100ppb; để yên 15 phút. Sau đó tiến hành chiết và làm sạch mẫu theo quy trình phân tích. Cuối cùng bơm dịch chiết lên hệ thống máy
LC/MS/MS và tính toán kết quả.
Đánh giá kết quả thí nghiệm theo quy định trongquyết định 657/2002/EC (Decision
657/EC, 2002):
- Độ thu hồi đạt yêu cầu khi giá trị tính nằm trong khoảng 40 -120% (Hàm
lượng chất≤ 1 ppb);
- Độ chụm đạt yêu cầu khi giá trị tính nằm trong khoảng ≤ 30% (Hàm lượng
chất≤ 1 ppb).
Thí nghiệm 2.3: Đảm bảo chất lượng kết quả thử nghiệm của phương pháp Bước 1. Kiểm tra hệ thống máy
Trước khi chạy mẫu, bơm dung môi ACN để kiểm tra sựổn định và ô nhiễm của máy.
Bước 2. Kiểm tra sự nhiễm bẩn sau khi bơm loạt mẫu
Cứ sau khi bơm một loạt 10 mẫu, bơm 01 mẫu ACN để kiểm tra sựổn định và ô nhiễm của máy.
Bước 3. Kiểm tra mẫu mù
Từng lô mẫu, bố trí 01 mẫu trắng, 01 mẫu dương tính đã biết nồng độ nhưng
người phân tích/chuẩn bị mẫu không được biết thông tin β-agonist (clenbuterol, salbutamol) có trong mẫu. Cụ thể như sau:
- Mẫu 1: Chuẩn bị mẫu thịt âm tính: Cân 5,0g ±0.1g mẫu thịt đã được nghiền nhuyễn cho vào ống ly tâm.
- Mẫu 02: Chuẩn bị mẫu thịt dương tính và đã kiểm phân tích để biết nồng
độ, thêm nội chuẩn salbutamol, clenbuterol để có nồng độ 1ppb: Cân 5,0g ±0.1g
mẫu thịt đã được nghiền nhuyễn cho vào ống ly tâm. Thêm 50 µl dung dịch nội chuẩn salbutamol, clenbuterol 100 ppb để yên 15 phút. Tiến hành chiết, làm sạch
mẫu theo quy trình phân tích và bơm lên máy để phân tích.
Đánh giá: Mẫu trắng phải cho kết quả âm tính; mẫu dương tính phải cho kết
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 40