2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
3.3.3.So sánh sự tương đồng kết quả phân tích giữa ELISA và LC/MS/MS
Kết quả phân tích mẫu thịt lợn nhiễm salbutamol và clenbuterol bằng kit ELISA và kỹ thuật LC/MS/MS được trình bày trong hình 3.3 và 3.4. Các giá trị hàm lượng salbutamol và clenbuterol xác định được bằng kit ELISA và kỹ thuật LC/MS/MS trên cùng một mẫu được thể hiện trên 2 cột.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 63
Hình 3.3. Sự tương đồng kết quả phân tích salbutamol trong thịt lợn giữa ELISA
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 64
Hình 3.4. Sự tương đồng kết quả phân tích clenbuterol trong thịt lợn giữa ELISA và LC/MS/MS
Hình 3.3 và 3.4 cho thấy có sự tương đồng về kết quả giữa ELISA và LC/MS/MS. Kết quả cho thấy dư lượng của salbutamol và clenbuterol vẫn có trong các mẫu thịt.
Phương pháp sàng lọc ELISA phát hiện thấy 14/140 mẫu thịt lợn nhiễm β- agonists nhưng khi khẳng định và định lượng bằng phương pháp LC/MS/MS thì chỉ có 11/14 mẫu phát hiện thấy salbutamol và/hoặc clenbuterol thuộc nhóm β-agonists trong đó: 3 trong số 14 mẫu thịt phát hiện thấy có clenbuterol, 8 mẫu trong số 14 mẫu thịt phát hiện thấy có chứa salbutamol. Điều này có thể là trong mẫu thịt ngoài salbutamol và clenbuterol còn một số chất khác như ractopamine, bitolterol, carbuterol,... mà phương pháp phân tích định lượng LC/MS/MS áp dụng trong nghiên cứu này chưa có điều kiện phân tích tất cả các chất trong nhóm. Kết quả này là chấp nhận được vì theo protocol của nhà sản xuất, ngoài salbutamol và clenbuterol, kit còn có phản ứng đặc hiệu ở mức cao (≥70%) với nhiều chất khác của nhóm β-agonists như bitolterol, carbuterol, cimbuterol.
Trong số các mẫu phân tích khẳng định và định lượng bằng phương pháp LC/MS/MS có kết quả dương tính với β-agonists, đáng lưu ý là có 2 trong số 14 mẫu đã phát hiện thấy cả salbutamol và clenbuterol. Có thể đây là do sự phối hợp salbutamol và clenbuterol của người chăn nuôi lạm dụng chất cấm bất hợp pháp hoặc trên thị trường có bán các sản phẩm hỗn hợp như vậy.
Nhóm β-agonists đã cấm sử dụng trong chăn nuôi động vật sản xuất thực phẩm (Bộ NN và PTNN, 2012). Kết quả nghiên cứu đã cho thấy vẫn còn sự lạm dụng chất cấm β-agonists trong sản xuất thịt lợn. Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với nhận định của Nguyễn Thị Thu Thủy (2011) về nguy cơ ô nhiễm chất cấm β-agonists trong sản xuất thịt lợn trong những năm tiếp theo.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 65 Các phương pháp áp dụng trong phân tích mẫu, cả định tính và định lượng là hợp lệ theo quy định của quyết định 657/2002/EC cũng như của Văn phòng công nhận chất lượng VILAS (2005). Tuy nhiên, phương pháp phân tích sàng lọc vẫn có thể bỏ sót một tỷ lệ nhỏ mẫu thịt ô nhiễm với β-agonists vì ngưỡng giới hạn chuẩn hóa của nghiên cứu này vẫn cao hơn ngưỡng giới hạn trong protocol của nhà sản xuất kit. Hơn nữa, phương pháp phân tích khẳng định và định lượng β-agonists trong nghiên cứu này chỉ tập trung vào 02 chất trong nhóm là salbutamol và clenbuterol chứ không phân tích được tất cả các chất có thể có của nhóm β-agonists như bitolterol, carbuterol, ractopamine…Như thế, tỷ lệ mẫu phát hiện thấy β-agonists trong mẫu thịt nghiên cứu là tỷ lệ mẫu phát hiện thấy salbutamol và clenbuterol; tỷ lệ mẫu thịt lợn nhiễm nhiễm β-agonists nói chung có thể cao hơn.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 66
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Bộ kit ELISA dùng cho phân tích định tính dư lượng β-agonists trong thịt lợn của hãng Biooscientific (MaxSignalTM β-agonist, mã 1009) có tính ổn định, khả năng phát hiện, hiệu lực của kit trong điều kiện phòng thử nghiệm là:
Giới hạn phát hiện (LOD) là 0,062 µg/kg Độ chính xác (AC): 95% (AC ≥ 90%) Độ đặc hiệu (SP): 95% (SP ≥ 90%) Độ nhạy (SE) : 95% (SE ≥ 90%) Độ lệch dương (PD) : 5% (PD ≤ 10%) Độ lệch âm (ND) : 5% (ND ≤ 10%).
Kết quả này đáp ứng được yêu cầu của một phương pháp định tính quy định trong quyết định 657/2002/EC.
2. Phương pháp LC/MS/MS là phù hợp để phân tích dư lượng β-agonists (salbutamol, clenbuterol) trong thịt lợn ở ngưỡng giới hạn phát hiện là 0,1 µg/kg và giới hạn định lượng là 0,3 µg/kg.
3. Có sự tương đồng về kết quả phân tích dư lượng β-agonists (salbutamol, clenbuterol) trong thịt lợn giữa kit ELISA của hãng Biooscientific (MaxSignalTM β- agonist, mã 1009) và phương pháp phân tích định lượng LC/MS/MS
4. Trong 140 mẫu thịt lợn phân tích, có 3/140 mẫu có tồn dư clenbuterol (với hàm lượng 0,39 – 0,54 µg/kg), 8/140 mẫu có tồn dư salbutamol (với hàm lượng 0,34 – 2,71 µg/kg).
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu kit ELISA β-agonists của hãng Biooscientific (MaxSignalTM β-agonist, mã 1009) trên các nền mẫu thịt gia súc, gia cầm khác để nghiên cứu sự phù hợp của kit cho mục đích sử dụng.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Võ Thị Trà An (2001). Tình hình sử dụng kháng sinh và dư lượng kháng sinh trong thịt gà tại các cơ sở chăn nuôi gà công nghiệp của thành phố Hồ Chí Minh, Luận Văn thạc sĩ
Khoa Học Nông Nghiệp, Đại Học Nông Lâm, Thành phố Hồ Chí Minh. 2. Võ Thị Trà An (2007). Kháng sinh cho vật nuôi, Nhà xuất bản Đà Nẵng.
3. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2002). Quyết định số 54/2002 QĐ-BNN ngày 20 tháng 06 năm 2002 về việc cấm sản xuất, nhập khẩu, lưu thông và sử dụng một số loại kháng sinh hóa chất trong sản xuát và kinh doanh thức ăn chăn nuôi.
4. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2012). Thông tư số 57/2012/TT-BNNPTNT ngày 07 tháng 11 năm 2012 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn về quy định việc kiểm tra, giám sát các chất thuộc nhóm β-agonists trong chăn nuôi.
5. Bộ Y tế (2002). Tin ngắn,Tạp chí thuốc và sức khỏe, (210) ngày 15/4/2002.
6. Bộ Y tế (2007). Quyết định số 46 /2007/QĐ-BYT ngày 19 tháng 12 năm 2007 của Bộ trưởng Bộ
Y tế về việc quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
7. Đoàn Thị Khang, Phan Thanh Đạm, Dương Thị Thu Anh và Đào Đức Hảo (2008). Ứng dụng kỹ thuật ELISA để xác định clenbuterol và salbutamol trong thức ăn chăn nuôi, Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi số 13, tháng 8/2008.
8. Ngọc Lê (2012). Đã kiểm soát được chất tạo nạc, Truy cập ngày 28/5/2014 từ
http://vietbao.vn/Kinh-te/Da-kiem-soat-duoc-chat-tao-nac/55447631/88/
9. Dương Thanh Liêm, Bùi Như Phúc và Dương Duy Đồng (2002). Thức ăn và dinh dưỡng vật nuôi, NXB Đại học Nông Lâm, TP. HCM, tr 146-179.
10. Phạm Thị Kiều Nga (2008). Bước đầu khảo sát dư lượng dexamethasone và clenbuterol trong thịt bò, heo và gà tại TP.HCM, Luận văn, Đại học Nông lâm TP.HCM .
11. Phạm Nho và Huỳnh Hồng Quang (2012). β-agonist: Ứng dụng và nguy cơảnh hưởng
đến sức khỏe con người, Truy cập ngày 3/3/2014 từ http://www.impe-qn.org.vn/impe- qn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=1092&ID=5756
12. Nguyễn Tâm (2012). Ba tỉnh phát hiện có mẫu thịt chứa chất tạo nạc, Truy cập ngày 28/5/2014 từ http://vtc.vn/321-328138/suc-khoe/ba-tinh-phat-hien-co-mau-thit-chua- chat-tao-nac.htm
13. Nguyễn Thị Thu Thủy (2011). Đánh giá hàm lượng các chất β-agonist (clenbuterol và salbutamol) trong thức ăn gia súc và dư lượng trong thịt gia súc bằng kỹ thuật sắc ký lỏng. 14. Phan Thị Nhã Tú (2007). Điều tra tình hình tồn dư dexamethasone và nhóm β –agonists
trong gan và thịt heo bằng phương pháp ELISA ở một số tỉnh lân cận và Tp. HCM,
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 68
Tiếng Anh
15. Andrzej Posyniak, Jan Zmudzki and Jolanta Niedzielska (2003). Screening procedures for clenbuterol residue determination in bovine urine and liver matrices using enzyme – linked immunosorbent assay and liquid chromatography, Analytica Chimica Acta 483: 61–67.
16. Baker P.K., Dalrymple R.H., Ingle D.L., Ricks C.A., (1984). Use of a β-adrenergic agonist to alter muscle and fat deposition in lambs, Journal of Animal Science, 59: 1256-1261. 17. Barbosa, J., Cruz, C., Martin, J., Siva, J. M., and Neves, C. (2005). Food poisoning by clenbuterol in Portugal, Laboratorio Nacional de Investigacao Veterinaria, Lisboa, Portugal, 563: 6.
18. Bucknall, S. D., MacKenzie, A. L., Sauer, M. J., Everest, D. J., Newman, R. and Jackman, R. (1993). Determination of clenbuterol in bovine liver by enzyme immunoassay, Analytica Chimica Acta, 275: 227-230.
19. Crescenzi, C., Bayoudh, S., Cormack, P. A. G., Klein, T., and Ensing, K. (2001). Determination of Clenbuterol in Bovine Liver by Combining Matrix Solid-Phase Dispersion and Molecularly Imprinted Solid-Phase Extraction Followed by Liquid Chromatography/Electrospray Ion Trap Multiple –Stage Mass Spectrometry, Anal, Chem, 73: 2171- 2177.
20. Dalrymple, R. H., Baker, P. K., Gingher, P. E., Ingle, D. L., Pensack, J. M. & Ricks, C. A. (1984). A repartitioning agent to improve performance and carcass composition of broilers, Poultry Science, 63: 2376-2383.
21. Dickson, L.C.; MacNeil, J.D.; Lee, S. & Fesser, A.C. (2005). Determination of beta- agonist residues in bovine urine using liquid chromatography-tandem mass spectrometry, Journal of AOAC International, 88(1): 46-56.
22. EC (1996). Council Directive 96/22/EC of 29 April 1996 concerning the prohibition on the use in stockfarming of certain substances having a hormonal or thyrostatic action and of ß-agonists, and repealing Directives 81/602/EEC, 88/146/EEC and 88/299/EEC, Official Journal of the European Communities, L125, 3-9.
23. EU (2002): EU regulation, European commission decision 2002/657/EC.
24. Gianfranco Brambilla, Maurizio Fiori, Barbara Rizzo,Vittorio Crescenzi, and Giancarlo Masci (2001). Use of molecularly imprinted polymers in the solid-phase extraction of clenbuterol from animal feeds and biological matrices, Journal of Chromatography B 759, pp 27–32.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 69
25. Guy Degand and Anne Bernes-Duyckaerts (1993). Determination of β-agonists in urine by an enzyme immunoassay based on the use of an anti-salbutamol antiserum, Analytica Chimica Acta, 275: 241-247.
26. Jose Blanca, Patricia Mu noz, Miguel Morgado, Nely M endez, Angela Aranda, Thea Reuvers and Henny Hooghuis (2005). Determination of clenbuterol, ractopamine and zilpaterol in liver and urine by liquid chromatography tandem mass spectrometry, Analytica Chimica Acta 529: 199–205.
31. Kootstra, P. R., Kuijpers, C.J.P.F., Wubs, K.L, Doorn D.van, Sterk S.S., van Ginkel L.A. and Stephany, R.W. (2005). The analysis of β-agonists in bovine muscle using molecular imprinted polymers with ion trap LCMSs creening, Analytica Chimica Acta 529: 75–81.
27. Kuiper, H. A., Noordam, M.Y., Schlit, R. (1998). Illegal use of β-adrenergic agonists: European community-State Institute for Quality Control of Agricultural Products, P.O. Box 230, 6700 AE Wageningen, The Nethelands, pp195-207.
28. Michael and O’Keeffe (1999). Methods for veterinary drug residue analysis in food, The National Food Centre, Dunsinea, Castle nock, Dublin, 15: 1 – 25.
29. Miller, M. F., Garcia, D. K., Coleman, M. E., Ekeren, P. A., Lunt, D. K., Wagner, K. A., Procknor, M., Welsh, T. H. Jr. & Smith, S. B. (1988). Adipose tissue, longissimus muscle and anterior pituitary growth and function in clenbuterol-fed heifers, Journal of Animal Science, 66: 12-20.
30. Ones R.W., Easter R.A., Mckeith F.K., Dalrymple R.H., Maddock H.M., Bechtel P.J. (1985). Effect of the β-adrenergic agonist cimaterol on the growth and carcass characteristics of finishing swine, Journal of Animal Science, 61: 905-913.
31. Pulce, C., Lamaison, D., Keck, G., Bostvironnois, C., Nicolas, J. & Descotes, J. (1991). Collective human food poisonings by clenbuterol residues in veal liver. Veterinary Human Toxicology, pp 480-482. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
32. Ricks, C. A., Dalrymple, R. H., Baker, P. K. & Ingle, D. L. (1984). Use of a β-agonist to alter fat and muscle deposition in steers, Journal of Animal Science, 59: 1247-1255. 33. Rose, M. D., Shearer, G., Farrington, W. H. (1995). The effect of cooking on veterinary
drug residues in food. Ministry of Agriculture, Fisheriers and Food, pp 67-76.
34. WHO/FAO (2004). Pesticide residue in food, Report of Joint meeting of the FAO panel of expert on Pesticide residue in food and environment, 14-24 september 2004, Rome. 35. Witkamp, R. F. (1996). Pharmacological and toxicological properties of β-agonists. In
Residues of veterinary drugs and mycotoxins in animal products, Anonymous (Ed.), Wageningen Pers, Wageningen, pp. 113-123.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 70
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
1. Xác định dư lượng β-agonists (salbutamol, clenbuterol, ractopamin) trong thịt tươi bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng hai lần khối phổ (UPLC/MS/MS) (Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y – Tập XXI số 5/ 2014).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 71
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Thời gian sản xuất, thời gian hết hạn và cách bảo quản của 5 bộ kit dùng trong nghiên cứu tính ổn định của kit.
Lô kit Ngày sản xuất Ngày hết hạn Bảo quản
Lô 1 28/06/2013 02/11/2014 2-80C
Lô 2 05/07/2013 09/11/2014 2-80C
Lô 3 15/08/2013 20/12/2014 2-80C
Lô 4 23/10/2013 28/02/2015 2-80C
Lô 5 11/12/2013 04/06/2015 2-80C
Trong trường hợp không có dự định sử dụng kít trong vòng 3 tháng nên bảo quản β-agonist antibody #1 và 100X HRB-conjugated antibody #2 ở -200C hoặc trong tủ âm.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 72
Phụ lục 2: Một số hình ảnh trong nghiên cứu
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 73
Mẫu trước khi đo mật độ quang
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 74