2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
2.1.Vật liệu nghiên cứu:
2.1.1.Đối tượng nghiên cứu
- Kit ELISA hãng Biooscientific (MaxSignalTMβ-agonist, mã 1009). - Dư lượng β-agonists trong mẫu thịt lợn.
2.1.2.Địa điểm nghiên cứu
-Địa điểm: Phòng thử nghiệm thuộc Trung tâm Kiểm tra vệ sinh thú y TƯ1 - Cục Thú y (VILAS 059, ISO 17025:2005).
2.1.3. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 10 năm 2013 đến tháng 08 năm 2014.
2.1.4. Vật liệu, hóa chất và thuốc thử
2.1.4.1. Chuẩn bị mẫu thịt âm tính và dương tính với β-agonists
Chuẩn bị lợn choai, có nguồn gốc tin tưởng, rõ ràng, chưa bao giờ nuôi bằng thức ăn công nghiệp, chưa bao giờ cho sử dụng thuốc thú y, đặc biệt là thuốc
thú y có thể nhiễm β-agonists. Việc Chuẩn bị mẫu thịt âm tính và dương tính với
β-agonists gồm:
- Nuôi 01 lợn bằng thức ăn không có β-agonists. Tiến hành theo dõi, chăn sóc liên tục thêm trong 3 tuần. Giết thịt thu mẫu. Mẫu thịt thu từ lô này là mẫu âm tính.
- Nuôi 01 lợn bằng thức ăn có β-agonists có salbutamol với hàm lượng 0,5 mg/kg thức ăn và clenbuterol với hàm lượng 0,5 mg/kg thức ăn, liên tục trong 10 ngày. Giết thịt thu mẫu thịt.
- Bảo quản mẫu thử: Mẫu thịt tươi bảo quản ở nhiệt độ 0-4oC không quá 1 tuần; Mẫu thịt đông lạnh bảo quản ở nhiệt độ < -18oC không quá 6 tháng. Khi giải
đông cần giải đông nhanh ở nhiệt độ lạnh.
2.1.4.2. Hóa chất và thuốc thử dùng cho phân tích định tính
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31
2.1.4.3. Hóa chất và thuốc thử dùng cho phân tích định lượng
Hoá chất và thuốc thử phải đạt tiêu chuẩn tinh khiết cấp độ LCMS, bao gồm:
• Hóa chất:
Chất chuẩn salbutamol, clenbuterol và chuẩn nội salbutamol-d3, clenbuterol- d9 (hãng Dr. Ehrenstorfer);
Nước tinh khiết, Methanol tinh khiết; Acetonitrile tinh khiết cấp LCMS
(hãng JT.Baker).
Cột chiết pha rắn C18 (MCX-OASIS);
Các loại hóa chất loại dùng cho phân tích như n-hexan, sodium acetate, acetic
acid, amonium hydroxyde, amoniac... • Dung dịch và dung môi:
- Chuẩn bị dung dịch sodium acetate 0,2M: Cân 2,722 g sodium acetate hòa tan vào trong 100ml nước cất.
- Chuẩn bị dung dịch amonium hydroxyde 5% amoniac/ acetonitrile.
- Chuẩn bị dung dịch: ethylacetate : acetonitrile : amonium hydroxyde 32% (90:10:5)
- Chuẩn bị dung dịch: Nước cất / acetonitrile (90/10)
- Acetic acid 1 M: Hút 5,7 ml acetic acid hòa tan vào 100 ml nước cất. - Chuẩn bị dung môi pha động: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Pha động A: Acetonitrile + 0,1% formic acid
Pha động B: Nước cất tinh khiết + 0,1% formic acid • Chuẩn bị dung dịch chuẩn và nội chuẩn
* Chuẩn bị dung dịch chuẩn Salbutamol, Clenbuterol:
- Dung dịch chuẩn gốc 1000 µg/mL: Cân chính xác 10 mg chuẩn mỗi loại salbutamol, clenbuterol, hoà tan và định mức tới 10 mL bằng methanol. Dung dịch chuẩn được bảo quản trong tủ lạnh 3 tháng.
- Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 10 µg/mL: 100 µl dung dịch chuẩn gốc 1000 µg/mL mỗi loại, định mức tới 10 mL bằng methanol. Dung dịch chuẩn
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32
- Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 1 µg/mL: 50 µl dung dịch chuẩn gốc 1000 µg/mL mỗi loại, định mức tới 50 mL bằng methanol. Dung dịch chuẩn được bảo quản trong tủ lạnh 1 tháng.
- Dung dịch chuẩn hỗn hợp cho vào mẫu 100 ng/mL: 100 µL dung dịch chuẩn trung gian 10 µg/mL mỗi loại, định mức tới 10 mL bằng methanol. Dung dịch này được chuẩn bị hàng ngày.
* Chuẩn bị dung dịch nội chuẩn: Clenbuterol –d9 và Salbutamol –d3
- Dung dịch nội chuẩn gốc 100 µg/mL;
- Dung dịch nội chuẩn trung gian hỗn hợp 1 µg/mL: 100 µL dung dịch chuẩn gốc 100 µg/mL mỗi loại, định mức tới 10 ml bằng methanol. Dung dịch được bảo quản trong tủ lạnh 1 tháng;
- Dung dịch nội chuẩn làm việc hỗn hợp 10 ng/mL: 100 µL dung dịch chuẩn trung gian 1µg/mL mỗi loại, định mức tới 10 mL bằng methanol. Dung dịch này
được được chuẩn bị hàng tuần.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc tinh khiết: Dung dịch chuẩn làm việc
tinh khiết, chuẩn bị hàng tuần (bảng 2.1):
Bảng 2.1: Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc
Nồng độ (ng/ml) Thể tích chuẩn hỗn hợp làm việc 100 ng/mL (µl) Thể tích chuẩn hỗn hợp trung gian 1 µg/mL (µl) Thể tích nội chuẩn hỗn hợp làm việc 10 ng/ml (µl) 0 0 0 50 0,2 10 0 50 0,6 30 0 50 1,8 90 0 50 5,4 0 27 50 16,2 0 81 50 2.1.5. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm - Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS (hãng Waters).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33
- Các thiết bị phụ trợ cho việc chuẩn bị mẫu như máy lắc vortex, máy đồng
nhất mẫu, máy bay hơi nitơ kèm bể điều nhiệt 24 lỗ giếng, máy li tâm MIKRO
22R...Các dụng cụ như micropipette 1 kênh và 8 kênh, ống nghiệm ly tâm, ống
đong, kéo, găng tay…
2.2.Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu tính phù hợp của kit ELISA dùng cho phân tích định tính xác định β-agonists trong thịt lợn.
- Nghiên cứu tính ổn định của kit ELISA
- Nghiên cứu xác định giới hạn phát hiện (LOD) của kit ELISA - Nghiên cứu xác định khả năng phát hiện (CCβ) của kit ELISA
- Nghiên cứu xác định độ chính xác, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ lệch dương và
độ lệch âm của kit ELISA
- Nghiên cứu đảm bảo chất lượng kết quả thử nghiệm của kit ELISA
Nội dung 2: Nghiên cứu phương pháp LC/MS/MS dùng cho phân tích định lượng xác định β-agonists trong thịt lợn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Nghiên cứu xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp
- Nghiên cứu xác định độ thu hồi (R), độ chụm (CV) của phương pháp - Nghiên cứu đảm bảo chất lượng kết quả thử nghiệm của phương pháp
Nội dung 3: Ứng dụng kit ELISA và kỹ thật LC/MS/MS để xác định dư lượng β- agonists trong mẫu thịt lợn.
- Phân tích định tính dư lượng β-agonists trong mẫu thịt lợn bằng kit ELISA
- Phân tích khẳng định và định lượng β-agonists trong mẫu thịtlợn bằng kỹ
thuật LC/MS/MS.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Thí nghiệm 1: Thí nghiệm nghiên cứu tính phù hợp của kit ELISA dùng cho phân tích định tính xác định β-agonists trong thịt lợn.