2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
2.3.1.Thí nghiệm 1: Thí nghiệm nghiên cứu tính phù hợp của kit ELISA
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34
Tính ổn định của kit được đánh giá qua kết quả phân tích đường chuẩn của 5 bộ kít thuộc 5 lô vào các ngày khác nhau, mỗi nồng độ khi thử trên một bộ kit được lặp lại 2 lần, thứ tự nồng độ từ thấp đến cao. Đường chuẩn được xây dựng theo hướng dẫn của nhà sản xuất gồm 5 điểm tương ứng với 5 mức nồng độ: 0,05; 0,15; 0,5; 1,5 và 4,5 ng/ml.
Thí nghiệm về tính ổn định của kit được lặp lại sau 1 tháng với phần còn lại của bộ kit được bảo quản theo hướng dẫn của nhà sản xuất ở 2-80C.
Thiết lập phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số hồi quy (R2). Tiêu chí chấp nhận đường chuẩn: 0,98 ≤ R2 ≤1.
Thí nghiệm 1.2: Xác định giới hạn phát hiện (LOD) của kit ELISA
Theo quy trình chuẩn bị mẫu và mô tả vềđặc tính của bộ kít của nhà sản xuất bộ kit ELISA, nhà sản xuất đưa ra giới hạn phát hiện của kit đối với thịt tươi là 0,025 µg/kg. Giá trị này nhà sản xuất đã nghiên cứu trên nhiều loại đối tượng mẫu thịt khác nhau và trong những điều kiện đặc thù của nhà sản xuất. Ngoài ra, hầu hết mọi nhà sản xuất đều công bố các thông số đánh giá chất lượng bộ kít thường tốt hơn so với giá trị thực tế để nâng cao tính thương mại cạnh tranh trên thị trường.
Theo quy định của Văn phòng công nhận chất lượng (2005) hoặc Quyết định 657/2002/EC thì sự phù hợp mục đích sử dụng của phương pháp phân tích áp dụng cho thử nghiệm phải
được nghiên cứu trong điều kiện thực tế trên nền mẫu cụ thể. Quyết định 657/2002/EC cũng quy định cụ thể cách xác định giới hạn phát hiện của phương pháp định tính. Theo
đó, với phương pháp ELISA, xác định giới hạn phát hiện của kit ELISA bằng cách phân tích 21 mẫu trắng. Việc chuẩn bị mẫu thử cần tuân thủ theo hướng dẫn kèm theo của nhà sản xuất kit. Từ nồng độ đo được của 21 mẫu trắng, tính giá trị trung bình chung và độ lệch chuẩn (SD) của 21 mẫu trên. Giới hạn phát hiện tính theo công thức sau:
Giới hạn phát hiện: LOD = + 3SD
Thí nghiệm 1.3: Xác định khả năng phát hiện của kit (CCβ)
Theo hướng dẫn của 657/2002/EC, xác định khả năng phát hiện (CCβ) xác suất lỗi âm tính giả là β=5% của phương pháp bằng cách:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35
- Chuẩn bị 20 mẫu trắng và 20 mẫu thêm chuẩn ở nồng độ xác định (không
quá MRPL). Phân tích mẫu trên theo hướng dẫn kèm theo trong kit.
- Xác định giá trị “cut off”: giá trị lớn nhất của mẫu trắng không cao hơn giá
trị nhỏ nhất của mẫu thêm chuẩn.
- Kết luận giá trị CCβ (có ≤ 5% số mẫu thêm chuẩn có giá trị ≤ giá trị ‘cut – off’
thì nồng độ thêm chuẩn ở nồng độ xác định trong thí nghiệm này coi là CCβ).
- Tất cả mẫu trắng và mẫu thêm chuẩn khi thực hiện trên kit đều lặp lại 2 lần.
Thí nghiệm 1.4: Xác định độ chính xác (accuracy: AC), độ đặc hiệu (specificity:SP), độ nhạy (sensitivity: SE), độ lệch dương (positive deviation: PD) và độ lệch âm (negative deviation: ND) theo quyết định 657/2002/EC
Bố trí thí nghiệm: Chuẩn bị các mẫu khác nhau, chuẩn bị các mẫu này thành hai nhóm, trong đó có một nhóm mẫu âm tính và một nhóm mẫu thêm chuẩn ở
nồng độ khả năng phát hiện (CCβ), mỗi nhóm 20 mẫu.
Cân 3,0g ± 0,1g mẫu thịt lô 1 đã được đồng nhất, cho vào ống ly tâm. Thêm
30µl dung dịch chuẩn β-agonists 10 ppb để yên 15 phút. Sau đó tiến hành chiết và làm sạch mẫu theo quy trình của nhà sản xuất, mỗi mẫu khi thực hiện trên kit được lặp lại 2 lần. Đọc kết quả và tính kết quả theo các công thức sau:
Kết quả phân tích Mẫu chứng dương (+) Mẫu chứng âm (-) Mẫu có kết quả dương tính TP FP
Mẫu có kết quả âm tính FN TN Trong đó:
TP (True Positive): Dương tính đúng (Mẫu chứng có kết quả dương tính, kết quả
phân tích cho kết quả dương tính)
FP (False Positive): Dương tính giả (Mẫu chứng có kết quả âm tính, kết quả phân tích cho kết quả dương tính)
FN (False Negative): Âm tính giả (Mẫu chứng có kết quả dương tính, kết quả phân tích cho kết quả âm tính) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
TN (True Negative): Âm tính đúng (Mẫu chứng có kết quả âm tính, kết quả phân tích cho kết quả âm tính)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 37 Độ chính xác, độ đặc hiệu, độ nhạy, độ lệch dương, độ lệch âm được tính toán theo các công thức sau đây:
Đánh giá kết quả: Các thông số cần được đánh giá theo các chuẩn mực sau:
¡ Độ chính xác (AC) ≥ 90 %
¡ Độđặc hiệu (SP) ≥ 90 %
¡ Độ nhạy (SE) ≥ 90 %
¡ Độ lệch dương (PD) ≤ 10 %
¡ Độ lệch âm (ND) ≤ 10 %
Thí nghiệm 1.5: Thí nghiệm đảm bảo chất lượng kết quả thử nghiệm của kit ELISA
Bố trí thí nghiệm mẫu mùgồm mẫu trắng, mẫu dương tính (thí nghiệm lô 2)
và đã kiểm tra phân tích để biết nồng độ, mỗi loại gồm 1 mẫu trắng và 1 mẫu dương
tính. Thí nghiệm lặp lại 2 lần.
Tiến hành phân tích song song bằng 02 kỹ thuật là kỹ thuật phân tích định tính ELISA và kỹ thuật phân tích khẳng định LC/MS/MS.
Việc chuẩn bị mẫu phân tích định tính ELISA theo quy trình của nhà sản xuất kit. Việc chuẩn bị mẫu phân tích khẳng định bằng kỹ thuật LC/MS/MS theo quy trình phân tích của PTN Trung tâm kiểm tra vệ sinh thú y trung ương I – Cục Thú y nghiên cứu, lập dựng.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 38
Cuối cùng so sánh kết quả phân tích mẫu theo thí nghiệm được bố trí giữa 2 kỹ thuật.
Đánh giá kết quả: Kit ELISA đạt yêu cầu khi mẫu mù bố trí là mẫu trắng cho kết quả âm tính; mẫu mù bố trí là mẫu thêm chuẩn cho kết quả dương tính giống như kỹ thuật phân tích khẳng định bằng LC/MS/MS.