2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
2.3.3. Ứng dụng kết quả nghiên cứu của phương pháp để phân tích mẫu thực
Bước 1. Phân tích định tính bằng kỹ thuật ELISA với loại kit đã được xác
định là phù hợp cho phân tích sàng lọc.
Bước 2. Phân tích định lượng bằng kỹ thuật LC/MS/MS với quy trình đã
được xác định là phù hợp cho phân tích khẳng định.
2.3.3.1. Phương pháp lấy mẫu:
Kỹ thuật lấy mẫu và bảo quản mẫu theo TCVN 4833-1.2002
Mẫu thịt được thu thập một cách ngẫu nhiên tại các cửa hàng kinh doanh. Mỗi mẫu là một miếng nạc tươi với trọng lượng 250 - 300 gam. Mẫu được lấy một lần vào các buổi sáng. Sau khi lấy mẫu, mẫu được đựng vào túi nilong, dán nhãn,
đựng trong hộp xốp, bảo quản ở nhiệt độ không quá 40C và được vận chuyển về
phòng thí nghiệm càng sớm càng tốt. Nếu mẫu không được phân tích ngay, phải bảo quản mẫu ở nhiệt độ < -18oC.
2.3.3.2. Phân tích định tính β-agonist bằng kit ELISA
Giai đoạn chuẩn bị mẫu:
- Loại bỏ mỡ khỏi mẫu. Đồng nhất mẫu bằng máy đồng nhất mẫu với một lượng thích hợp.
- Cân 3 gam mẫu đã được đồng nhất, cho vào đó 8 ml acetonitrile và 1ml ethyl acetate. Lắc trong 3 phút bằng máy Votex ở tốc độ cao nhất.
- Ly tâm trong 5 phút với tốc độ 4000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (20- 250oC/ 68-770oF).
- Chuyển 6 ml dung dịch lớp trên mặt qua một ống mới. Làm khô mẫu bằng khí nitơở nhiệt độ 60-70 oC.
- Thêm 1ml n-hexan và 1ml 1xPBS trộn đều bằng vortex trong 1 phút ở tốc
độ tối đa.
- Để mởống và làm nóng mẫu ở 85 oC trong 3 phút. Ly tâm mẫu trong 5 phút
ở tốc độ 4000 vòng/phút
- Hút 50 µl phần dịch trong ở phía dưới để tiến hành ELISA.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 41
- Nhỏ 50 µl mỗi chất chuẩn β-agonists vào các giếng khác nhau, mỗi nồng độ
nhỏ 2 giếng. Cần nhỏ vào đĩa theo thứ tự từ nồng độ thấp đến nồng độ cao. - Nhỏ 50 µl mỗi mẫu vào các giếng mẫu khác nhau, mỗi mẫu nhỏ 2 giếng. - Nhỏ 100 µl Antibody #1 và lắc xoay tròn đĩa bằng tay trong 1 phút. - Ủđĩa 30 phút ở nhiệt độ phòng (20-250C/ 68-770F)
- Rửa đĩa 3 lần với 250 µl 1 x Wash Solution. Sau lần rửa cuối cùng, úp ngựơc đĩa và làm khô đĩa bằng cách đập nhẹđĩa trên khăn giấy. Cần chú ý thực hiện ngay bước kế tiếp này sau khi rửa đĩa. Không nên để đĩa khô giữa 2 bước này.
- Nhỏ 150 µl 1 x HRP-Conjugated Antibody #2. Ủ đĩa 30 phút ở nhiệt độ
phòng (20-250C/ 68-770F). Tránh ánh sáng trực tiếp và mặt bàn/ghế lạnh trong suốt quá trình ủ. Khuyến cáo nên đậy bằng khăn parafin lên đĩa trong khi ủ.
- Rửa đĩa 3 lần với 250 µl 1 x Wash Solution. Sau lần rửa cuối cùng, úp ngựơc đĩa và làm khô đĩa bằng cách đập nhẹđĩa trên khăn giấy. Cần chú ý thực hiện ngay bước kế tiếp này sau khi rửa đĩa. Không nên để đĩa khô giữa 2 bước này.
- Nhỏ 100 µl TMB substrate. Phản ứng xảy ra ngay sau khi cho subtrate vào giếng và lắc xoay tròn đĩa bằng tay trong 1 phút. Thuốc thử còn dư không nên cho ngược lại vào lọ đựng ban đầu để tránh khả năng vấy nhiễm. Thuốc thử phản ứng thay đổi màu là dấu hiệu hỏng và phải loại bỏ. Khuyến cáo nên đậy bằng khăn parafin lên đĩa trong khi ủ.
- Sau khi ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng (20-250C/ 68-770F), nhỏ 100 µl đệm dừng phản ứng để làm ngừng phản ứng của enzym.
- Có thể đọc kết quả ngay sau khi nhỏđệm dừng phản ứng trên máy đọc đĩa
ở bước sóng 450 nm. Trước khi đọc, sử dụng một miếng vải mỏng để lau chùi phía
đáy của đĩa để chắc chắn đáy đĩa không có hơi nước hoặc dấu vân tay gây trở ngại cho sựđọc kết quả.
2.3.3.3. Phân tích định lượng β-agonist bằng kỹ thuật LC/MS/MS
Các mẫu dương tính với nhóm β-agonists bằng phương pháp định tính được phân tích khẳng định bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 42
- Mẫu thịt được xay nhuyễn và đồng nhất.
- Cân 5g mẫu vào ống nghiệm ly tâm 50ml. Thêm 5ml methanol và 10 ml sodium acetate 0,2M (pH 5,2).
- Khuấy trong 3 phút bằng vortex ở tốc độ tối đa và đem ly tâm tốc độ 4500 vòng/ phút trong 15 phút.
- Chuyển dung dịch sang ống mới, cô quay tới còn 2/3 thể tích ban đầu - Thêm 5ml sodium acetate 0,2M, sau đó ly tâm.
- Cho lên cột C18: Hoạt hóa cột bằng: 3ml metanol, 3ml mước cất. Chuyển tất cả
dung dịch mẫu vào cột. Rửa cột bằng: 4ml nước, 4ml acetic acid, 4ml methanol. Để khô cột trong 6 phút. Rửa giải cột bằng: 6ml ethylacetate/acetonitrile/ammonium hydroxyde 32% (90/10/5).
- Thổi khô bằng khí nitrơở nhiệt độ 50oC, sau đó hòa tan bằng 0,25ml dung dịch pha động nước/acetonitrile (90/10). Cho vào lọ để phân tích sắc ký (LC/MS/MS).
2.3.4. Phương pháp phân tích số liệu
- Phần mền Masslyns 4.1 (lập dựng đường chuẩn và tính kết quả phân tích
mẫu) cho phân tích định lượng.
- Phần mền KC (lập dựng đường chuẩn và tính kết quả phân tích mẫu) cho
phân tích định tính.
- Đánh giá phê duyệt phương pháp theo quyết định 657/2002/EC của EC.
- Nhập và bảo quản số liệu bằng chương trình Excel.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 43 Giá trị trung bình ∑ = = n i i x n x 1 1 Tính độ lệch chuẩn (SD): Trong đó: SD: Độ lệch chuẩn xi: Giá trị thứ i : Giá trị trung bình n: Số lần làm lặp lại Tính độ thu hồi, R% Trong đó: R%: Độ thu hồi, %
Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)
Ctt: Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn
Tính độ lệch chuẩn tương đối:
Trong đó: SD: Độ lệch chuẩn
: Giá trị trung bình của các lần thử nghiệm RSD%: Độ lệch chuẩn tương đối
CV%: Hệ số biến thiên
- Phân tích thống kê phân tích bằng thử nghiệm:
* Thử nghiệm t-student để đánh giá độ đúng. Tính ttn (t thực nghiệm) theo công thức: trong đó µ là giá trị thực của đại lượng cần xem xét, n là số lần thực nghiệm. So sánh ttn với t(f=0,95, n-1) tra bảng t-student.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 44
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu tính phù hợp của kit ELISA dùng cho phân tích định tính xác định β-agonists trong thịt lợn.