Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của xạ khuẩn Streptomyces orientalis

Kháng sinh này đã được xem như cấu trúc sinh học chủ yếu, từ đó biến đổi bằng cách bán tổng hợp hoặc bằng công nghệ sinh học tạo ra những chất thay thế với những đặc tính ưu việt [37], [

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Chu Thanh Bình

NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP

VANCOMYXIN CỦA XẠ KHUẨN STREPTOMYCES orientalis 4912

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – Năm 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Chu Thanh Bình

NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP

VANCOMYXIN CỦA XẠ KHUẨN STREPTOMYCES orientalis 4912

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thày cô giáo Khoa Sinh học, Bộ môn Vi sinh vật học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học này

Tôi xin trân trọng cảm ơn Phân viện Công nghệ sinh học – Trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học và bản luận văn

Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí của đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vancomyxin hydrochlorid công suất 1 kg/mẻ” mã số 032/2012/HĐ- ĐTCNHD, thuộc “Chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp Hóa dược đến năm 2020”

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn bên tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Chu Thanh Bình

MỤC LỤC

Lời cảm ơn ………

Mục lục ……….……

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt………

Danh mục các bảng ………

Danh mục các hình vẽ, đồ thị………

MỞ ĐẦU ……… ……

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… … 1

1.1 Chất kháng sinh vancomyxin ……… 1

1.1.1 Lịch sử phát triển kháng sinh vancomyxin……… 1

1.1.2 Đặc tính của vancomyxin 2

1.1.3 Cơ chế kháng khuẩn của vancomyxin……… 4

1.1.4 Ứng dụng trong điều trị bệnh của vancomyxin……… 7

1.2 Streptomyces orientalis và các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp vancomyxin … 8

1.2.1 Streptomyces orientalis 8

1.2.2 Sinh tổng hợp vancomyxin ở xạ khuẩn……… 9

1.2.3 Nghiên cứu qui trình công nghệ sản xuất vancomyxin ……… 11

1.3 Nghiên cứu duy trì và nâng cao hiệu suất chủng giống sản xuất vancomyxin……… ……… 14

1.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất vancomyxin…… ……… 18

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……… 21

2.1 Vật liệu ……… ……… 21

2.1.1 Chủng giống vi sinh vật ……… 21

2.1.2 Hoá chất ……… 21

2.1.3 Thiết bị ……… 21

2.1.4 Môi trường ……… 22

2.1.5 Các dung dịch đệm 24 2.2 Phương pháp nghiên cứu …… ……… 24

2.2.1 Bảo quản giống ……… 24

2.2.3 Xác định sinh khối ……… 25

2.2.4 Xác định hoạt tính kháng sinh……… 25

2.2.5 Phương pháp lên men 26

2.2.6 Phương pháp phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm 28 2.2.7 Thu nhận tế bào trần xạ khuẩn……… 28

2.2.8 Nghiên cứu nâng cao hiệu suất sinh kháng sinh bằng xử lý UV và N-metyl-N‟-nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG)……… 29

2.2.9 Xây dựng đường cong sống sót……… 30

2.2.10 Xác định sự biến đổi hình thái khuẩn lạc và hoạt tính kháng sinh… 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……… 32

3.1 Đặc điểm sinh học của chủng Streptomyces orientalis 4912 32

3.1.1 Đặc điểm nuôi cấy……… 32

3.1.2 Đặc điểm hình thái……… 33

3.2 Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S orientalis 4912 34

3.3 Nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng S orientalis 4912……… 36

3.3.1 Thu nhận bào tử và tế bào trần từ chủng S.orientalis 4912……… 36

3.3.2 Nâng cao HTKS của chủng S orientalis 4912 bằng phương pháp gây đột biến dùng tia UV và N-metyl-N‟-nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG)………

40 3.4 Một số đặc điểm sinh học của biến chủng Streptomyces orientalis 4912- 81- 61………

46 3.5 Tối ưu hóa quy trình lên men biến chủng S orientalis 4912-81-61… 48 3.5.1 Lựa chọn môi trường nhân giống……… 48

3.5.2 Lựa chọn môi trường lên men……… 48

3.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng S orientalis 4912-81-61……… 48

3.5.4 Biến động quá trình lên men sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng S orientalis 4912-81-61 trong thiết bị lên men Bioflo………… 57

KẾT LUẬN 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 59

DANH MỤC CÁC BẢNG

3.3 Ảnh hưởng của nồng độ lysozym tới khả năng tạo TBT của chủng S

3.10 Một số đặc điểm sinh học của biến chủng S orientalis 4912-81-61 47

3.11 Khả năng sinh trưởng của biến chủng S orientalis 4912-81-61 trên

một số môi trường

48

3.12 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp vancomyxin

của biến chủng S orientalis 4912-81-61

49

3.13 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp vancomyxin

của biến chủng S orientalis 4912-81-61

50

3.14 Ảnh hưởng của bột đậu tương, glucoza và đường saccaroza tới khả

năng sinh tổng hợp vancomyxxin của biến chủng S orientalis

3.17 Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp

vancomyxin của biến chủng S orientalis 4912-81-61

54

3.18 Ảnh hưởng của oxy hòa tan tới sinh trưởng và sinh tổng hợp

vancomyxin bởi biến chủng S.orientalis 4912-81-61

56

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1.2 Các bước tấn công thành tế bào vi khuẩn của vancomyxin 6 1.3 Quá trình tổng hợp vancomyxin trong tế bào xạ khuẩn 10

3.3 Hình dạng khuẩn ty và chuỗi bào tử của chủng S orientalis 4912 34 3.4 Hoạt tính kháng sinh kháng B subtilis ATCC 6633 của chủng S

orientalis 4912

35

3.6 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng tạo thành TBT của

3.10 HTKS của biến chủng nhận được sau khi gây đột biến tế bào trần 45

3.11 Khuẩn lạc của biến chủng S orientalis 4912-81-61 (A) và chủng S

orientalis 4912 (B)

46

3.12 Ảnh hưởng của độ thông khí tới khả năng sinh tổng hợp vancomyxin

của biến chủng S orientalis 4912-81-61

55

3.13 Biến động quá trình lên men sinh tổng hợp vancomyxin bởi biến

chủng S orientalis 4912-81-61 trên thiết bị Bioflo 110

57

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU

Theo thống kê, Việt Nam thuộc vào những nước nhập khẩu thuốc nhiều nhất thế giới, hàng năm khoảng 350-400 triệu USD, trong đó kháng sinh chiếm thị phần tiêu thụ cao Dự kiến đến năm 2020, cả nước sẽ cần mỗi năm hơn 1,5 tỷ USD tiền thuốc, trong đó kháng sinh chiếm 30%

Theo Quyết định số 61/2007/QĐ- TTg ngày 07/5/2007 của Thủ tướng Chính

phủ phê duyệt “Chương trình Nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia

phát triển công nghệ hóa dược đến năm 2020” thì mục tiêu của chương trình là:

“Nghiên cứu tạo ra những công nghệ có chất lượng cao phù hợp với điều kiện sản xuất ở trong nước, làm chủ và ứng dụng công nghệ hiện đại của nước ngoài, tiến tới chủ động việc sản xuất thuốc chữa bệnh trong nước” Do vậy, việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học tiên tiến, phù hợp với điều kiện kinh tế, nhằm phát triển sản xuất kháng sinh ở Việt Nam là rất cần thiết

Vancomyxin là nguyên liệu cơ bản để nghiên cứu tạo ra các loại kháng sinh bán tổng hợp với đặc tính chữa bệnh cao và chọn lọc Chất kháng sinh này được

sản xuất nhờ xạ khuẩn Streptomyces orientalis Việc nâng cao khả năng sinh kháng

sinh vancomyxin của chủng và hạ giá thành sản phẩm là rất cần thiết Do vậy,

chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:“Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng

hợp vancomyxin của xạ khuẩn Streptomyces orientalis” với các nội dung chính như

sau:

1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng S orientalis

2 Nghiên cứu nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng S orientalis

3 Nghiên cứu tối ưu môi trường và điều kiện lên men chủng S orientalis

Đề tài được thực hiện tại Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Mục tiêu:

Nâng cao hoạt tính kháng sinh vancomyxin của xạ khuẩn S orientalis 4912

hướng tới sản xuất kháng sinh này phù hợp với nguyên liệu sẵn có, rẻ tiền và điều kiện môi trường khí hậu của Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CHẤT KHÁNG SINH VANCOMYXIN

1.1.1 Lịch sử phát triển kháng sinh vancomyxin

Vancomyxin là CKS tiêu biểu nhất trong nhóm KS glycopeptit, được Eli

Lilly và cộng sự mô tả lần đầu tiên vào năm 1956, do xạ khuẩn S orientalis phân

lập từ đất ở Indonexia và Ấn Độ sinh ra [45] Ban đầu CKS này được gọi là hợp chất 05865, nhưng sau đó đã được đặt tên là vancomyxin (do bắt nguồn từ

“Vanquyshed” có nghĩa là “đánh bại”) Năm 1958, CKS này được đưa vào điều trị thử nghiệm trên người Năm 1964, Bộ Y tế Mỹ chấp thuận đưa vancomyxin vào sử dụng rộng rãi trong các bệnh viện Khi CKS bán tổng hợp nhóm penixilin là metixilin được đưa vào dùng trong chữa bệnh thì nhu cầu về vancomyxin đã giảm

xuống trong một thời gian Tuy nhiên, sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn S

auureus kháng metixilin vào 2 thập kỷ cuối thế kỷ XX đã làm kháng sinh

glycopeptit được lựa chọn trong phác đồ điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn kháng nhiều loại KS thông dụng gây ra Lúc đó vancomyxin được ví như một loại thần dược hay phương thuốc cuối cùng vì có khả năng điều trị được các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm do các chủng vi sinh vật kháng metixilin gây nên Vancomyxin đã

mở ra liệu pháp điều trị đầu tiên khi có sự nghi ngờ về khả năng kháng penixilin của

các chủng Staphylococcus Sau khi những nghi ngờ này được dẫn chứng bằng

những số liệu cụ thể thì liệu pháp này được điều chỉnh cho phù hợp [18], [20], [22], [28], [36], [56] Vancomyxin được sử dụng trong vòng hơn 30 năm mà không có những dẫn chứng đáng kể nào về sự kháng thuốc Nhưng sự lạm dụng trong việc dùng vancomyxin đã làm con người phải đối mặt trước một thực tế là sự xuất hiện

và gia tăng ngày càng nhiều của các chủng vi khuẩn kháng lại CKS từng được xem như hy vọng cuối cùng trong điều trị các bệnh truyền nhiễm hiểm nghèo Chủng vi sinh vật kháng vancomyxin đầu tiên được công bố vào cuối những năm 1980 và sau

đó số lượng này tăng lên không ngừng Do sự xuất hiện của những chủng vi sinh

vật kháng vancomyxin, nhu cầu tìm kiếm các CKS thay thế với mục đích ngăn chặn mối hiểm họa cho sức khỏe cộng đồng luôn luôn được thúc đẩy Tuy nhiên, kể từ khi được phát hiện, cấu trúc phân tử và đặc tính của vancomyxin đã luôn lôi cuốn

sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học thuộc nhiều chuyên ngành khác nhau Kháng sinh này đã được xem như cấu trúc sinh học chủ yếu, từ đó biến đổi bằng cách bán tổng hợp hoặc bằng công nghệ sinh học tạo ra những chất thay thế với những đặc tính ưu việt [37], [52], [58]

Dạng vancomyxin HCl đầu tiên đã được Eli Lilly đưa ra thị trường dưới tên thương mại là Vancoxyn Giấy chứng nhận quyền sử dụng sản phẩm này hết hạn vào đầu những năm 1980 Ngày nay, các dạng thuốc mang đặc tính chung của vancomyxin được đưa ra dưới nhiều tên thương mại khác nhau Năm 2004, Eli Lilly

đã đăng ký bản quyền cho Vancoxyn với ViroPharma tại Mỹ, Flynn Pharma tại Anh

và Aspen Pharmacare tại Úc [58] Vancomyxin không những là một loại thuốc kháng sinh sử dụng điều trị bệnh nhiễm trùng rất có hiệu quả, mà còn là nguyên liệu

cơ bản để nghiên cứu tạo các loại kháng sinh bán tổng hợp đang rất được quan tâm Ngày nay, tầm quan trọng của vancomyxin vẫn được khẳng định, chúng được sử dụng rộng rãi trong các bệnh viện khi kết hợp với các CKS nhóm - lactam [10], [69] Cho đến nay, trên thị trường ít nhất đã có 10 biệt dược chứa vancomyxin do nhiều hãng thuốc nổi tiếng trên thế giới sản xuất như: Diatraxin (Dista, Tây Ban Nha), Hanomyxin (Samjin, Hàn Quốc), Lyphoxyn (Fujisawa, Mỹ), Vancoxyn (Lilly, Mỹ), Vancoxyna (Lilly, Mỹ), Vancoled (Lederle, Mỹ), Vancor (Andria, Mỹ), Vancolin, Vancomyxin (Dakota Pharm, Pháp), Voncon (Lilly, Mỹ) [72]

1.1.2 Đặc tính của vancomyxin

Vancomyxin có công thức tổng quát C66H75Cl2N9O24 Trong phân tử có chứa một disacarit ở vị trí axit amin thứ 4, cấu trúc hóa học được thể hiện ở hình 1.1 [9], [16] Vancomyxin có tổng số 18 trung tâm lập thể, với 9 trung tâm lập thể nằm trên lõi glycol và các trung tâm còn lại nằm tại các nhóm cacbonhydrat [58] Cấu trúc hóa học lập thể quyết định cơ chế hoạt động của vancomyxin Vancomyxin có một chuỗi hexapeptit đã glycozyl hóa, chứa 7 aminoaxit gồm các loại như chloro-β-

hydroxytyrozin, p-hydroxylphenylglyxin, N-metylleuxin và axit aspartic tạo thành

bộ khung phân tử vững chắc [13], [43], [53], [64]

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của vancomyxin [58], [71]

Trọng lượng phân tử của vancomyxin là 1449,3 Da Các phân tử vancomyxin thường không kết hợp với nhau nên vancomyxin là một chất vô định hình, không màu sắc và có tính chất lưỡng tính [40] Vancomyxin ở dạng clohydrat hòa tan rất tốt trong nước, hòa tan vừa phải trong methanol, hòa tan ít trong rượu bậc cao, clorofoc, etylaxetat, butylaxetat, axeton và este Giá trị pKa của vancomyxin là 2,9; 7,2; 8,6; 9,6; 10,5 và 11,7 Theo những phân tích cơ bản đã chỉ

ra rằng phân tử vancomyxin chứa khoảng 1,17% nitơ và 4,26% clo Vancomyxin bền trong nước ở pH = 3,0-7,0 và nhiệt độ 37oC trong 6 ngày, sau 6 ngày khả năng

ức chế vi khuẩn còn 10% Ở nhiệt độ phòng (khoảng 22oC) độ bền sẽ bị giảm sau

2-6 ngày Nếu pH nằm trong khoảng từ 7-12 và nhiệt độ nâng nhẹ (trên 22oC) thì sự phân hủy có thể quan sát được [4], [40] CKS này có thể hòa tan trong nước tại pH

7 (khoảng 1 mg/ml) và hòa tan tốt hơn ở pH kiềm (khoảng pH 8,5 – 9,0)

Vancomyxin bền ở dạng rắn và trong dịch lỏng tại nhiệt độ lớn hơn 70oC trong khoảng pH từ 2,5-9,0 Nhờ đặc điểm lưỡng tính, vancomyxin phản ứng với axit vô cơ như: HCl, H2SO4, H3PO4 và các axit khác… [36], [40] Vancomyxin có 3

hệ thống vòng, 2 nhóm cacbonhydrat, 5 vòng thơm, 9 nhóm OH trong đó có 3 nhóm phenol, 7 liên kết amit và 2 liên kết amin, điểm đẳng điện pI 7,2 Vancomyxin khác

với các kháng sinh thuộc nhóm glycopeptit khác bởi cấu trúc phức tạp Sự khác biệt này thể hiện trong cấu trúc của vancomyxin chứa một disacarit ở vị trí axit amin thứ

4, là vị trí cho phép gắn phân tử ngoại lai (như đường glucoza …) để tạo nên các vancomyxin bán tổng hợp có hoạt tính cao và bền vững với các tác nhân kháng Đây là hướng đang được quan tâm nghiên cứu nhằm mở ra một thế hệ KS mới có hoạt tính cao và chọn lọc [34], [58]

Theo “Sổ tay Kháng sinh” của Navashin, S.M & Fomina, I.P., 1974, 1 mg vancomyxin dạng sunphat chuẩn cần đạt 1007 đơn vị hay một đơn vị vancomyxin dạng sunphat tương đương 0,993 mcg Khi tiêm tĩnh mạch chuột nhắt trắng theo chuẩn dược, độ nhạy độc của vancomyxin HCl biểu hiện ở LD50 (liều gây chết 50% động vật thí nghiệm) được tìm thấy trong khoảng 435,7 ± 4,22 mg/kg

Người ta thường sử dụng vancomyxin khi biết hoặc nghi ngờ về khả năng nhiễm trùng máu, hoặc sử dụng cho các bệnh nhân bị viêm xương, viêm khớp, nhiễm trùng da và mô mềm [4], [10], [56] Tác dụng của vancomyxin cao hơn khi kết hợp với các CKS khác (ví dụ KS nhóm β-lactam) trong điều trị một số loại vi sinh vật có thể thay đổi cấu trúc thành tế bào để kháng lại vancomyxin [28], [58]

1.1.3 Cơ chế kháng khuẩn của vancomyxin

Vancomyxin và các kháng sinh nhóm glycopeptit có hoạt tính kháng vi sinh vật thông qua việc ức chế sự tổng hợp thành tế bào Vị trí mà các tác nhân tấn công vào thành tế bào là lớp peptidoglycan Đây là lớp cơ bản để vi khuẩn chống lại các điều kiện bất lợi của môi trường Nếu không có lớp này hoặc vì một lý do nào đó

mà lớp peptidoglycan bị phá hủy thì tế bào vi khuẩn trở nên cứng nhắc, không linh động, kết qủa tế bào bị chết [33] Vancomyxin ức chế giai đoạn cuối của quá trình sinh tổng hợp peptidoglycan qua 3 giai đoạn [58]:

- Giai đoạn 1: Vancomyxin không xâm nhập vào tế bào chất để ức chế các bước sinh tổng hợp thành tế bào tiếp theo mà chỉ hoạt động ở bên ngoài màng tế bào chất Sự ức chế các chất màng trên đã ngăn cản chu trình lặp lại các chất mang C55 lipit làm gia tăng sự tích lũy tiền chất của tế bào chất Đây là một cơ chế không

thường xuyên xảy ra đối với một tác nhân kháng vi sinh vật bao gồm việc sử dụng

cơ chất thay vì điều khiển hoạt tính của enzyme sinh tổng hợp

- Giai đoạn 2: Nhờ cấu tạo hình xoắn của phân tử mà gần đây người ta đã phát hiện ra khả năng kháng vi sinh vật của vancomyxin tác động ngược lại với sự mẫn cảm penixilin Ở màng ngoài tế bào vi khuẩn, enzyme transglycosylaza bổ sung các mảnh disacaryl pentapeptit để hình thành lớp peptidoglycan của tế bào Sau đó, enzyme transpeptidaza nối các peptit ở bên trong với các sợi của lớp peptidoglycan ở bên ngoài bề mặt của màng tế bào Đích tác dụng của vancomyxin

là gắn với các peptit cơ chất, ngăn cản chúng liên kết với vị trí hoạt động của enzyme Khi đó, phân tử vancomyxin có dạng hình chiếc cốc liên kết với ái lực cao nhờ bề mặt lõm của nó tạo năm liên kết hydro với đoạn cuối N-acyl-D-Alanyl-D-Alanin của cầu liên kết chéo peptit chưa nối với pentapeptit

- Giai đoạn 3: Liên kết của vancomyxin với chuỗi lipit-PP-Glc NAC- pentapeptit là liên kết vật lý tương đối bền vững đã ngăn cản tác động tiếp theo của transglycosylaza/transpeptidaza Vancomyxin không tấn công được disacaryl pentapeptit mà làm giảm các liên kết đồng hóa trị, giảm tính bền cơ học của lớp peptidoglycan và làm cho tế bào vi khuẩn dễ dàng bị phân giải nhờ những thay đổi xảy ra do áp suất thẩm thấu

Vancomyxin có hoạt tính mạnh với các cầu khuẩn và vi khuẩn Gram (+)

như: Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium, Enterococcus và xoắn

khuẩn (Bảng 1.2) [58], [62] CKS này có khả năng tiêu diệt tốt vi khuẩn đang ở trong giai đoạn sinh sản, pH tối ưu là 8,0 và hoạt tính giảm mạnh khi pH dưới 6,0 Điều này được giải thích bởi hai nguyên nhân: một là do sự khác biệt của cấu trúc thành tế bào giữa vi khuẩn Gram (+) và vi khuẩn Gram (-) Cấu trúc thành tế bào vi khuẩn Gram (+) gồm có lớp peptidoglycan dầy, axit teichoic và axit teichoronic, có thể có hoặc không có màng protein hoặc polysaccarit bao quanh Trong khi đó thành tế bào vi khuẩn Gram (-) gồm có lớp peptidoglycan mỏng, lipopolysacarit, lipoprotein, photpholipit và protein Trong các tế bào vi khuẩn Gram (-), lớp peptidoglycan và lớp màng bên trong được bao bọc bởi một lớp màng ngoài ngăn

chặn sự khuếch tán vancomyxin đến lớp peptidoglycan Ngược lại, lớp peptidoglycan của vi khuẩn Gram (+) được xác định trên bề mặt ngoài của thành tế bào và do đó nó mẫn cảm với kháng sinh vancomyxin Hai là có thể do phân tử glycopeptit là những phân tử lớn, chúng không thể hòa tan lớp lipit của màng tế bào

vi khuẩn Gram (-), do đó khó có thể xâm nhập được vào lớp bên trong của thành tế bào [40], [58], [71]

Hình 1.2 Các bước tấn công thành tế bào vi khuẩn của vancomyxin [71]

Bảng 1.1 Phổ kháng khuẩn của vancomyxin [58], [62]

1.1.4 Ứng dụng trong điều trị bệnh của vancomyxin

Vancomyxin từng được xem như phương thuốc cuối cùng, chỉ sử dụng sau khi việc điều trị bệnh bằng các kháng sinh khác không có hiệu quả Không lâu sau khi được phát hiện, vancomyxin được xếp vào danh mục những loại dược phẩm hàng đầu và được đưa vào dùng rộng rãi trong bệnh viện để điều trị các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm do các vi sinh vật kháng KS nhóm β-lactam gây nên [15], [58]

Vancomyxin đặc biệt có hiệu quả cao khi dùng trong điều trị các bệnh do MRSA gây nên, vi khuẩn này là mối nguy hiểm với bệnh nhân cao tuổi, bệnh nhân sau phẫu thuật và những người có hệ miễn dịch suy giảm [30] Vancomyxin còn được chỉ định để điều trị cho các bệnh nhân dị ứng với penixilin, các bệnh nhân

không thể sử dụng các loại thuốc như penixilin hoặc cephalosporin và sử dụng khi những chủng vi sinh vật mẫn cảm với vancomyxin Dưới tác dụng của vancomyxin tính bền vững vốn có của các cầu khuẩn Gram (+) đối với penixilin không phát hiện thấy [58] Mặc dù có nhiều CKS chữa trị các bệnh do vi khuẩn Gram (+) gây ra đã được công bố trong những năm gần đây, nhưng vancomyxin vẫn là kháng sinh

không thể thay thế trong việc chữa trị những bệnh do Staphyloccus, Enterococcus

và các chủng vi sinh vật kháng nhiều loại kháng sinh thông dụng gây nên [5], [30]

Vancomyxin có tác dụng cao khi dùng phối hợp hoặc thay thế kháng sinh nhóm β-lactam để chữa các bệnh nhiễm trùng do các loại vi khuẩn đã nhờn với kháng sinh thông dụng gây nên như: bệnh nhiễm trùng máu, viêm xương, viêm đường hô hấp … [17], [34] Ngoài ra, CKS này còn có tác dụng điều trị bệnh do vi

khuẩn bạch hầu gây nên [41], [45] Các chủng Staphylococcus có khả năng đề

kháng với penixilin G, streptomyxin, tetraxyclin, macrolit và các loại khác, nhưng mẫn cảm với vancomyxin [36], [44]

1.2 Streptomyces orientalis VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI SINH

TỔNG HỢP VANCOMYXIN

1.2.1 Streptomyces orientalis

Streptomyces orientalis có khả năng sinh CKS vancomyxin Lúc đầu, khi

mới phát hiện, xạ khuẩn này có tên là Amycolatopsis orientalis, được xếp vào chi

Nocardia, sau đó loài này được phân loại lại và xếp vào chi Streptomyces, đặt tên là

S orientalis, tuy nhiên, nhiều tài liệu vẫn gọi tên truyền thống là Amycolatopsis orientalis Cho đến nay, vẫn chỉ phát hiện thấy kháng sinh vancomyxin từ loài xạ

khuẩn này [23], [26], [31], [35], [51] S orientalis được phân biệt với các loài khác thuộc chi Streptomyces bởi các đặc điểm nuôi cấy, hình thái, sinh lý, sinh hóa…

Hình dáng khuẩn lạc lồi cao hoặc hơi lồi, khô, xù xì, tạo rãnh, có vùng khuẩn

ty màu trắng nhạt rất mỏng bao quanh, mặt dưới không màu

Đặc điểm nuôi cấy riêng: khi nuôi trên môi trường thạch tổng hợp, khuẩn ty

cơ chất có màu vàng kem sau 7 ngày và chuyển sang màu vàng sẫm sau 14 ngày, khuẩn ty khí sinh có màu trắng sau 7 ngày và có màu xám sau 14 ngày nuôi do có

sự hình thành bào tử, không có sắc tố tan trên môi trường nuôi cấy

Trong tự nhiên, sự phát triển của vi sinh vật, trong đó có xạ khuẩn, liên quan mật thiết đến nguồn thức ăn và mối liên hệ của chúng với nhau Mối quan hệ đối kháng giữa các vi sinh vật đã được Pasteur (1887) khẳng định là hiện tượng phổ biến Riêng đối với xạ khuẩn tính đối kháng thể hiện khá rõ rệt Kháng sinh là trường hợp riêng của tính đối kháng, hiện tượng một vi sinh vật với sản phẩm trao đổi chất của mình tạo điều kiện không thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật khác [8], [20], [23] Cơ chế hình thành CKS:

- Đối với các CKS tương tự với các chất trao đổi sơ cấp (axit amin, nucleotit, coenzyme) thì sự sinh tổng hợp giống như sự sinh tổng hợp của các chất trao đổi sơ cấp

- Đối với kháng sinh được tạo ra bằng con đường polymer hóa bao gồm: các chất là dẫn xuất polypeptit được tạo thành bằng cách ngưng tụ axit amin, mạch polypeptit được tạo thành có thể bị cải biến trong các phản ứng tiếp theo (sự ngưng

tụ axit amin không theo cơ chế cổ điển sinh tổng hợp protein); các chất được tạo thành từ các đơn vị axetat và propionate thì theo con đường tổng hợp axit béo; các chất tecpen được tạo thành từ các đơn vị izopren (chỉ do khuẩn ty sinh ra); đối với các chất aminoglucozit thì tạo thành bằng con đường ngưng tụ các phân tử đường, axit amin thông thường và các rượu amin mạch vòng [14], [27], [46]

1.2.2 Sinh tổng hợp vancomyxin ở xạ khuẩn

Cũng giống như con đường sinh tổng hợp KS nhóm glycopeptit, vancomyxin được tổng hợp bằng cách ngưng tụ các đơn vị nhỏ mà mỗi đơn vị này lại được tạo thành từ các con đường sinh tổng hợp riêng (Hình 1.3)

Hình 1.3 Quá trình tổng hợp vancomyxin trong tế bào xạ khuẩn [71]

Quá trình tổng hợp chịu sự chi phối của các gen nằm trên cluster trong bộ gen Các gen này quyết định sự tổng hợp vancomyxin theo con đường riêng, khác con đường tổng hợp axit amin để hình thành nên protein [58] Người ta có thể biết được điều này khi tiến hành phân tích một cách chi tiết thành phần các axitamin của vancomyxin Trong khoảng 20 axit amin cơ bản được tạo thành trong tổng hợp protein thì có p-hydroxyphenylglyxin, hydroxyltyrozin và 3,5 di-hydroxylphenyl-glyxin α và β là các thành phần chính của kháng sinh (Hình 1.3) Quá trình tổng hợp glycopeptit có những yêu cầu giống như tổng hợp protein nhưng sự tham gia axit amin theo con đường khác [40], [57], [58] Quá trình hình thành vòng heptapeptit không phải ở trên riboxom Để thay thế riboxom, các mạch peptit được tổng hợp nhờ enzyme NRPSs (nonribosomal protein synthase) NRPSs là một enzyme có khối lượng phân tử lớn, cấu tạo chia làm 4 phần, bao gồm vùng A (adenyl hóa), vùng ngưng tụ hoặc kéo dài (C), vùng E (epime hóa) và T (thioesterase) Tại các vùng tổng hợp, NRPSs chịu trách nhiệm phát hiện, loại bỏ các axit amin có những

sai khác, chỉ sử dụng các axit amin có hoạt tính, adenozin tri photphat (ATP) được dùng làm năng lượng cho hoạt động của enzyme Đầu tiên các axit amin được biến đổi L-tyrozin được biến đổi thành β-hydroxyclorotyrozin (β-hTyr) và 4-hydroxyphenylglyxin (HPG) Mặt khác, axetat được chuyển hóa từ vòng 3,5-dihydroxyphenylglyxin Tại vùng A, axit amin đặc hiệu được hoạt hóa bằng cách biến đổi thành phức hệ enzyme aminoaxyl adenyl hóa và gắn với 4 photpho-pantethein ở vùng T bởi thioesteraza, có sự giải phóng adenozin mono photphat (AMP) Vùng A có trách nhiệm cung cấp liên tục axit amin cho quá trình liên kết Phức hệ này sau đó chuyển qua vùng E thực hiện phản ứng epime hóa các axit amin Kết thúc ở vùng C, các liên kết peptit được hình thành giữa các axit amin hoạt tính Sự tổng hợp này mới hình thành nên các mạch heptapeptit thẳng Việc tạo nên các dạng mạch khác sẽ được thực hiện ở các vị trí khác, tùy thuộc theo từng chủng

xạ khuẩn Sau khi mạch heptapeptit thẳng được tổng hợp, vancomyxin phải trải qua một loạt các biến đổi tiếp theo nhờ hoạt động của 8 enzym như oxy hóa liên kết chéo, quá trình glycozyl hóa… để trở thành phân tử có hoạt tính học Sự tương tác giữa các cầu nối được thực hiện bởi P450, đây là một enzyme tương tự NRPSs, có vai trò gắn thêm phân tử đường vào lõi heptapeptit để hình thành glycopeptit theo con đường glycozyl hóa Ngoài ra còn có sự tham gia của nhóm sulphat vào phần cuối N Việc gắn nguyên tử Clo và vòng 2 và 6 nhờ enzyme haloperoxydaza thông qua quá trình oxy hóa Qúa trình hình thành glycopeptit chịu sự chi phối của rất nhiều gen, mỗi gen hoạt động lại chịu sự chi phối của rất nhiều yếu tố, do vậy không thể tách các gen đơn chiếc để tạo ra được vancomyxin

1.2.3 Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất vancomyxin

1.2.3.1 Điều kiện nuôi cấy

Theo các tài liệu đã công bố [30], [33], [41], [42], [44], [59], xạ khuẩn S

orientalis sử dụng trong sản xuất vancomyxin thường phát triển tốt ở nhiệt độ

20-35oC, nhiệt độ tối ưu cho quá trình sinh vancomyxin là 28oC, ở nhiệt độ 20oC và

35oC chủng này sinh trưởng yếu, sinh khối tích lũy và lượng kháng sinh tạo ra thấp

Độ pH thích hợp cho tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn thường là trung tính Tuy nhiên dải pH cho phép chủng sinh trưởng thường lớn hơn so với pH tối ưu cho

hoạt tính sinh tổng hợp kháng sinh Đối với xạ khuẩn S orientalis thì pH thích hợp

cho sinh trưởng là 6-8, còn pH thích hợp cho sinh vancomyxin chỉ từ 6,5-7,5 Môi trường kiềm hay axit đều ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh kháng sinh [25]

Xạ khuẩn có nhu cầu thông khí cao hơn so với vi sinh vật khác, nhất là trong giai đoạn nhân giống (khoảng từ giờ thứ 6 đến giờ 12 của quá trình nuôi) Theo nhiều nghiên cứu, nếu nuôi trong bình tam giác, trên máy lắc, thì thể tích môi trường chỉ nên bằng 10-15% so với thể tích bình lên men là thích hợp cho việc tạo kháng sinh, khi độ thông khí cao hơn hoặc thấp hơn đều ảnh hưởng đến quá trình này Lên men khối lượng lớn hơn phải thường xuyên cấp khí vô trùng và khuấy trộn cho phân tử oxy hòa tan đều trong môi trường lên men, đảm bảo lượng ôxy hòa tan, nhưng cũng làm tăng lượng sinh khối, rút ngắn thời gian pha tích tụ, có thể tạo thêm nhiều sản phẩm không mong muốn Trong thực tế, để đảm bảo lượng ô xy hòa tan, người ta thường phối hợp điều chỉnh cả hai thông số cường độ sục khí và khuấy trộn theo hướng đủ tạo ra các hạt nhỏ và mịn trong điều kiện khuấy trộn hơi dư so với nhu cầu Sục khí còn có tác dụng đuổi khí CO2 có trong dịch lên men, vì CO2làm cản trở quá trình hấp thụ và chuyển hóa cơ chất của chủng, nghĩa là cản trở sinh tổng hợp KS [21], [49], [50]

Vancomyxin được tạo thành chủ yếu trong pha thứ hai (pha tổng hợp) của qúa trình lên men Vì vậy, cần xác định được đúng thời điểm kết thúc lên men trước khi xạ khuẩn bị phân hủy làm giảm lượng KS tạo thành Thời gian kết thúc lên men được xác định bằng cách nghiên cứu động thái, thường kéo dài 120 giờ

Theo nhiều tài liệu công bố, sinh tổng hợp CKS không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men mà còn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng Môi trường nhân giống giàu chất dinh dưỡng hơn môi trường lên men sẽ cho hiệu suất sinh tổng hợp CKS cao hơn Lượng giống và tuổi giống được bổ sung vào môi trường lên men cũng có ảnh hưởng không nhỏ đến khả năng tổng hợp KS Thông thường lượng giống bổ sung vào môi trường lên men là 2 – 10% [38], [47

1.2.3.2 Thành phần môi trường

Quá trình sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn phụ thuộc rất nhiều vào thành phần môi trường lên men Mỗi chủng xạ khuẩn cần một nguồn cơ chất khác nhau Để xạ khuẩn phát triển tốt môi trường phải có đầy đủ nguồn cacbon, nitơ và các nguyên tố vi lượng Nguồn cacbon có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh

trưởng cũng như sinh tổng hợp CKS của xạ khuẩn S orientalis, do nguồn cacbon

không những tham gia vào cấu tạo tế bào mà còn tham gia quá trình hình thành nên cấu trúc của sản phẩm [59] Tuy nhiên, tùy thuộc vào từng chủng mà cần chọn nguồn cacbon thích hợp gồm các loại đường đơn như glucoza, fructoza … hay các loại đường kép như sacaroza, maltoza, lactoza… cũng có thể là các loại tinh bột hoặc rỉ đường hoặc đại mạch… Glucoza là nguồn đường dễ sử dụng nhất, tuy nhiên nếu hàm lượng glucoza trong môi trường quá cao hiệu suất lên men sẽ giảm đi [60] Nguyên nhân là glucoza làm tăng lượng axit hữu cơ trong môi trường đồng thời làm tăng các chất hữu cơ và axit nucleic trong khuẩn ty, dẫn tới thay đổi hoạt tính các enzyme phân giải glucoza Có thể khắc phục hiện tượng này bằng cách bổ sung định kỳ một lượng nhỏ glucoza để không xảy ra sự tích lũy các chất trao đổi ức chế [54], [59]

Quá trình sinh tổng hợp CKS từ xạ khuẩn đòi hỏi cung cấp đầy đủ nguồn nitơ vô cơ và nitơ hữu cơ Trong đó nguồn ni tơ vô cơ cho khả năng sinh CKS không cao, còn nguồn ni tơ hữu cơ có ảnh hưởng tốt đến khả năng sinh tổng hợp CKS do nó cung cấp các nguồn axit amin quan trọng dễ dàng đi vào chu trình tổng hợp để hình thành nên mạch heptapeptit, là bộ khung của vancomyxin Nguồn nitơ thích hợp thường được sử dụng là cao nấm men, cao thịt, pepton, bột đậu tương… nguồn nitơ vô cơ thường sử dụng là các muối amon, muối nitrat…[65]

Vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nói riêng rất cần chất khoáng trong quá trình trao đổi chất của chúng Một lượng nhỏ các nguyên tố vi lượng cũng có ảnh hưởng nhất định đến sự hình thành CKS của xạ khuẩn Sự có mặt của một số muối khoáng như Na, Fe, Al, Bo, K, Cr, Cu, Mn, Zn… [29] trong môi trường lên men sẽ tác dụng khác nhau đến khả năng sinh kháng sinh của VSV Có thể sự có mặt của

nguyên tố này sẽ làm giảm tác dụng kìm hãm hoặc làm tăng tác dụng kích thích của nguyên tố kia Một số muối khoáng như Ca2+, Cu2+… được cho là có ảnh hưởng tới khả năng sinh ra một vài loại kháng sinh trong đó có vancomyxin Các khoáng chất này có tác động lên hoạt động của các enzyme trong sinh tổng hợp kháng sinh [29]

1.3 NGHIÊN CỨU DUY TRÌ VÀ NÂNG CAO HIỆU SUẤT CHỦNG GIỐNG SẢN XUẤT VANCOMYXIN

Một yếu tố quan trọng hàng đầu cho mọi quá trình lên men sinh tổng hợp hoạt chất sinh học là chủng giống vi sinh vật Do các chủng VSV dễ bị biến dị và hoạt tính bị thoái hóa trong quá trình nuôi cấy nhiều lần bởi tác động của môi trường sống của chúng, nên phải tiến hành chọn lọc thường xuyên chủng giống cho lên men Phần lớn các chủng sản sinh KS phân lập từ tự nhiên thường có hiệu suất thấp vì thế không thể dùng ngay cho sản xuất [6], [7], [12], [26] Để thu được các chủng có khả năng siêu tổng hợp KS, có giá trị trong công nghiệp cần phải áp dụng các phương pháp đột biến nhân tạo (đột biến cảm ứng) Các phương pháp hiện đại

về sinh tổng hợp, kỹ thuật di truyền và công nghệ gen, siêu tổng hợp, điều khiển hoạt động của gen, gây đột biến định hướng, tạo và dung hợp tế bào trần (protoplas)… không những nâng cao hiệu suất chủng giống trong thời gian ngắn mà còn mở ra phương hướng đầy triển vọng trong sản xuất các CKS [58]

*Chọn lọc tự nhiên

Bào tử hoặc tế bào sinh dưỡng của chủng sinh kháng sinh được pha loãng trong nước muối sinh lý, sau đó cấy lên môi trường dinh dưỡng trong hộp petri sao cho chỉ hình thành 40-50 khuẩn lạc trong mỗi hộp Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp 4-5 ngày cho khuẩn lạc phát triển tốt và xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp cục thạch Khi tuyển chọn chủng sinh kháng sinh cao theo phương pháp này, cần phải kiểm tra lại bằng lên men để xác định hiệu suất sinh kháng sinh so với chủng ban đầu Phương pháp chọn chủng có hoạt tính cao theo cách này chỉ là những đột biến tự nhiên, không có ý nghĩa tạo chủng có năng suất cao, đáp ứng được nhu cầu của sản xuất [15], [69]

*Chọn lọc nhân tạo

Trong công nghệ kháng sinh, tất cả các chủng sản đều trải qua đột biến do cảm ứng Phương pháp có ý nghĩa, quyết định thành công trong việc tạo giống có năng suất cao là các phương pháp chọn lọc gây đột biến dưới tác động mạnh của các tác nhân như tia UV, tia X, tia Gamma hoặc các chất gây đột biến như etylenimin (EI), axit nitric, nitrosoguanidin, natri nitrit … [23], [24] Bằng phương pháp gây đột biến tạo được nhiều biến đổi về gen và chọn lọc định hướng như bổ sung CKS vào môi trường trong quá trình tuyển chọn, sẽ nâng cao được hoạt tính kháng sinh của chủng giống Không những thế, bằng phương pháp đột biến còn chọn lọc những ưu điểm của chủng sản thuận lợi cho quá trình sản xuất [3] Chẳng hạn, bằng phương pháp này người ta thu được chủng sản penixilin không sinh sắc

tố, chủng sản oxytetraxyclin ít gây bọt khi lên men và không chịu tác động của

photpho thừa, chủng S.orientalis sinh chủ yếu là vancomyxin và ít sản phẩm phụ

[33]

Nhân tố gây đột biến có thể tạo ra những thay đổi về di truyền có liên quan đến nhiều đặc tính cũ của sinh vật Để thu được những đột biến có ý nghĩa kinh tế, người ta đã nghiên cứu tích cực về phương pháp và điều kiện sử dụng các nhân tố

đó như: liều, pha, pH và cách phối hợp các nhân tố khác nhau Ví dụ, người ta đã chứng minh được rằng xử lý với EI liều nhỏ (không gây đột biến) có tác dụng hiệp đồng với tia tử ngoại, nhưng nếu theo trình tự ngược lại thì chỉ còn tác động của tia

tử ngoại Xử lý trước với tia tử ngoại sẽ loại trừ tác dụng của tia Rơn-ghen, nhưng làm ngược lại có tác dụng cộng hưởng Việc lựa chọn phương pháp xử lý đột biến

sẽ dựa trên tiêu chuẩn sau:

- Quá trình thí nghiệm không được quá nguy hiểm, vì nhiều chất gây đột biến

là những chất gây ung thư

- Các kỹ thuật phải đơn giản và các thiết bị hóa chất phải có sẵn

* Tác dụng của axit nitric

Axit nitriccó tác dụng biến đổi về mặt hóa học các bazơ nitơ của ADN Dưới tác dụng của axit nitric, nhóm amin trong các bazơ của axit nucleic bị thay thế bằng

nhóm hydroxyl hay oxy, nghĩa là xảy ra phản ứng oxy hóa khử amin Do đó adenin chuyển thành hydroxatin, guanin chuyển thành xantin và xytozin chuyển thành uraxin Tác dụng chủ yếu của axit nitric là gây nên các đột biến kiểu khử amin đối với các bazơ của ADN Ngoài ra, axit nitric có thể tác dụng làm đứt mối liên kết hydro trong các sợi ADN đang phân chia, tạo ra một loại biến đổi khác như kiểu cấu trúc lại nhiễm sắc thể [58]

* Tác dụng của tia cực tím

Tia cực tím (viết tắt là tia UV) là tác nhân đột biến vật lý được sử dụng rộng rãi trong di truyền vi sinh vật học 58 Tia UV tác dụng chủ yếu lên axit nucleic, mạnh nhất ở bước sóng 260 nm, dẫn đến hiện tượng dime hoá timin Ở đây hai timin gần nhau được liên kết cộng hoá trị với nhau ở nguyên tử cacbon thứ 5 và thứ

6, hậu quả là sao chép bị lầm vì ADN-polymeraza dễ lắp một nucleotit không chính xác vào vị trí trên Dưới tác dụng của tia UV, trên sợi ADN cũng xuất hiện một dime pirimidin-pirimidin khác gọi là quang sản phẩm 6-4 Ở đây, nguyên tử cacbon thứ 6 của pirimidin ở đầu 5‟ (T hoặc X) được liên kết với nguyên tử cacbon thứ 4 của pirimidin ở đầu 3‟ (thường là X) Sản phẩm này là nguyên nhân chủ yếu của đột biến gây nên bởi tia UV

Một đặc điểm tác dụng nữa của tia UV là hiện tượng phục hồi hoạt tính Hiện tượng này có thể quan sát thấy khi vi sinh vật bị mất hoạt tính do tia UV Nếu sau khi làm mất hoạt tính, đem chúng chiếu ánh sáng thường (320-480 nm) thì từ 50-80% tế bào được phục hồi hoạt tính [24] Năm 1962, Rupper thấy rằng, hoạt tính được phục hồi do tác dụng của một enzym nhất định gọi là enzym phục hồi Trong bóng tối enzym này liên kết với một quang sản phẩm nhất định xuất hiện trong ADN dưới tác dụng của tia tử ngoại cụ thể là dime pirimidin Khi đưa ra ánh sáng thì enzym này tách khỏi cơ chất, có khả năng tham gia vào phản ứng mới và những rối loạn trong ADN được phục hồi Ở đây người ta cho rằng, rối loạn do tia tử ngoại gây nên và có khả năng được phục hồi chính là sản phẩm của dime của hai timin lân cận có mối liên kết của C6 và C5 [58]

Ở Việt Nam, kỹ thuật gây đột biến bằng tia UV được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm Với kỹ thuật gây đột biến lên tế bào trần bằng chiếu tia UV

đã nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng S rimous R77 lên 10%-60% và chủng S

hygroscopics 5820 lên 600% [3]

* Chuẩn bị dịch tế bào trong kỹ thuật xử lý bằng siêu âm

Dịch huyền phù tế bào được chuẩn bị bằng cách nuôi cấy trên môi trường 48 dịch thể Sau đó được ly tâm và lấy sinh khối Các tế bào được hòa trong đệm YEME và đưa vào siêu âm Tất cả được tiến hành trong điều kiện tuyệt đối vô

trùng

* Chuẩn bị dịch tế bào trong kỹ thuật gây đột biến

Để đạt được hiệu quả bằng phương pháp gây đột biến thì việc chuẩn bị một dịch huyền phù tế bào hoặc bào tử phải thích hợp với điều kiện xử lý đột biến [24], [32], [39]

Dịch huyền phù tế bào được chuẩn bị bằng cách nhân giống các tế bào thuần

khiết Dịch huyền phù của bào tử Streptomyces được chuẩn bị như sau: nhỏ 5–10 ml

nước cất khử trùng bằng pipet theo một đường nghiêng trên bề mặt xạ khuẩn Các mảnh sợi xạ khuẩn được lọc qua phễu lọc Whatman No2 Tất cả các thao tác được thực hiện trong điều kiện tuyệt đối vô trùng

 Một số vi sinh vật không sinh bào tử hoặc thể đột biến mất khả năng sinh bào tử Dịch huyền phù thích hợp có thể được chuẩn bị bằng cách dùng pipet nhỏ lên trên bề mặt khuẩn lạc khoảng 10 ml nước theo bề mặt nghiêng rồi chuyển toàn

bộ thể tích vào một ống hẹp đã khử trùng Các mẩu sợi thô sẽ được giữ lại trong vài phút, hút 1ml dịch lọc hoà loãng vào 9 ml nước cất vô trùng Trong những trường hợp sợi dai, khó hoà tan thì bổ sung 3-5 ml nước cất vô trùng vào cho đồng nhất Quá trình nghiền nát sẽ làm hạn chế kết quả hoặc khả năng phát triển sẽ bị giảm nhiều Tuy nhiên, phương pháp này sẽ cho một dịch huyền phù tốt, không có các mảnh lớn

 Đối với nấm không sinh bào tử, đặc biệt đối với các loại có thể sinh các hệ sợi nhỏ, các đỉnh của sợi có thể được dùng để gây đột biến tại đó, sẽ thuận lợi hơn

khi thực hiện trên các khuẩn lạc trên đĩa Petri Có thể thực hiện phương pháp này bằng cách đặt một miếng giấy bóng kính vuông đã khử trùng hoặc một màng xốp với kích thước 3-4cm trên bề mặt thạch môi trường dinh dưỡng, chính giữa miếng giấy sẽ cấy nấm, sau khi nuôi một thời gian thích hợp các khuẩn lạc sẽ phát triển ra rìa miếng giấy Khi đỉnh của sợi nấm dài về phía trước 2-5 mm tách miếng giấy ra khỏi bề mặt đĩa, chuyển các đỉnh sợi nấm đi gây đột biến

 Những vi sinh vật sinh bào tử có thể có cấu trúc rất bền vững Dịch huyền phù của chúng được chuẩn bị như đã mô tả ở trên, nhưng để ADN dễ bị đột biến hơn, nên thực hiện xử lý ở thời điểm sinh tiền bào tử của chúng Nuôi vi sinh vật trên môi trường lỏng thích hợp trước khi xử lý Khi quan sát dưới kính hiển vi điện

tử thấy ống mầm có kích thước gấp đôi bào tử đó là lúc dịch huyền phù rất thích hợp cho xử lý gây đột biến Thời gian nảy mầm của bào tử không được quá lâu

 Một số nhà nghiên cứu cho rằng, sử dụng dịch huyền phù bào tử đơn nhân ở thời kỳ tiền sinh bào tử là tốt vì trong quá trình xử lý đột biến sự sao chép ADN nhạy cảm hơn với tác nhân gây đột biến Tuy nhiên, việc sử dụng quá trình sinh tiền bào tử của vi sinh vật có hệ sợi nấm sẽ gặp khó khăn khi lựa chọn các khuẩn lạc đột biến ở giai đoạn cuối

 Trường hợp sử dụng TBT của xạ khuẩn để gây đột biến bằng chiếu tia hoặc hóa chất, nên dùng dịch huyền phù tế bào đang phát triển ở giai đoạn đầu pha

logarit ( đối với S orientalis, S fradiae), hoặc ở thời kỳ chuyển tiếp giữa pha

logarit và pha cân bằng tùy thuộc loài để tạo TBT Tế bào trong giai đoạn phát triển này có khả năng tạo thành TBT và phục hồi tốt nhất Xạ khuẩn thường được nuôi trong môi trường có bổ sung glyxin làm cho thành tế bào mẫn cảm hơn với lysozym trong quá trình tạo TBT [24]

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT VANCOMYXIN

Người ta phát hiện thấy CKS vancomyxin thường được tổng hợp bởi xạ

khuẩn S orientalis (trước đây có tên Nocardia orientalis và Amycolatopsis

orientalis) Việc phát hiện ra vancomyxin được coi như cứu cánh cho nhân loại, do

có đặc tính chữa bệnh rất cao, phần nào khắc phục được hiện tượng kháng thuốc

của vi sinh vật gây bệnh [58] Vancomyxin được đưa vào thử nghiệm chữa bệnh từ năm 1958, và Bộ Y tế Mỹ cho phép sử dụng năm 1964 [71], [72] Dạng vancomyxin thương phẩm được đóng 500 mg vancomyxin.HCl/lọ, tương đương 0,34 mmol VANCOCIN HCl (Vancomyxin dạng tiêm, USP) của hãng Galaxy được đóng trong lọ plastic (PL 2040) chỉ sử dụng tiêm tĩnh mạch, làm giảm sự phát triển của vi khuẩn kháng kháng sinh, bảo vệ hiệu lực của vancomyxin và các thuốc kháng khuẩn khác Vancomyxin chỉ nên dùng để chữa hoặc chống nhiễm trùng do

vi khuẩn nghi ngờ đã nhờn thuốc gây nên Khi dùng vancomyxin trong thời gian dài hoặc quá liều có thể bị giảm thính giác, gây điếc, tổn thương thận Ngoài ra vancomyxin chỉ có tác dụng khi tiêm qua đường tĩnh mạch và không được hấp thụ qua đường tiêu hóa [21], [22] Vancoxyn, VancoxynD, VancoxynD IV,

“Vancomycin by Abbott | VANCOCIN HCL | VANCOCIN HCL IN” (tên thương phẩm của vancomyxin) đang được bán trên thị trường thế giới với giá 18,25 USD/

500 mg vancomyxin dùng để tiêm [72] Hiện nay, vancomyxin vẫn đang được nghiên cứu hoàn thiện sản xuất, tăng độ tinh khiết và giảm độ độc của nó [5], [30], [33]

Theo công bố mới nhất, hiệu suất chủng đột biến của xạ khuẩn S orientalis

(nhận được nhờ xử lý bằng tia UV) đạt 11,5 g/l sau 120 giờ lên men Tuy nhiên hiện nay, sản xuất vancomyxin ở quy mô công nghiệp hiệu suất còn thấp, chỉ đạt 3,7 g/l, làm cho giá thành của CKS này khá cao, gấp 10 đến 20 lần so với các thuốc kháng sinh nhóm penixilin hoặc cephalosporin [30] Để giải quyết vấn đề này, cần nghiên cứu tạo chủng sản có hoạt tính vancomyxin cao, tối ưu điều kiện nuôi cấy bao gồm thành phần môi trường, pH, nhiệt độ Rất nhiều nghiên cứu về các yếu tố này đã được tiến hành trong điều kiện lên men theo mẻ hoặc lên men liên tục, lên men sử dụng sinh khối tái sinh hoặc tế bào cố định [41], [42]

Ngày nay, cùng với việc tổng hợp bằng con đường sinh học người ta đã nghiên cứu sản xuất thành công dẫn xuất của vancomyxin bằng con đường hoá học

và bán tổng hợp Các sản phẩm vancomyxin bán tổng hợp được tạo ra bởi việc gắn

thêm các gốc như đường… để nâng cao hoạt tính và phổ tác dụng điều trị Đây cũng

là hướng trong tương lai để sản xuất các sản phẩm vancomyxin

Vancomyxin có trong Danh mục thuốc thiết yếu Việt Nam ban hành lần thứ 5 năm 2005 Ở nước ta đang có nhu cầu sử dụng vancomyxin và giá bán khá cao là

180 nghìn đồng/1g Do đó, Tổng Công ty Dược Việt Nam đặt yêu cầu nghiên cứu sản xuất kháng sinh này ở quy mô nhỏ, từ 500 đến 1000 kg/năm Đã có nhiều đề tài nghiên cứu tiếp cận đến việc sản xuất kháng sinh ở Việt Nam, trong đó đáng lưu ý đến các công trình nghiên cứu sản xuất dekamyxin (neomyxin), oxytetraxyclin (Trường Đại học Dược HN), các vi sinh vật đối kháng và kháng sinh phục vụ chăn nuôi và bảo vệ thực vật (Viện Công nghệ sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Sư phạm HN ) Gần đây, có những nghiên cứu sản xuất các kháng sinh bán tổng hợp từ penixilin và cephalosporin [1] Tuy nhiên, những nghiên cứu này chưa tiếp cận được đến công nghiệp sản xuất Một yếu tố quan trọng trong sản xuất kháng sinh là hiệu suất chủng giống, nguồn nguyên liệu môi trường và điều kiện lên men thích hợp Nếu có đầu tư nhưng chủng giống có hiệu suất thấp thì cũng không thể cạnh tranh sản xuất trong tình hình hiện nay Do vậy, muốn đầu tư sản xuất ở Việt Nam, chúng ta cần nghiên cứu xem kháng sinh nào phù hợp yêu cầu của thị trường Đặc biệt là sản xuất phải đảm bảo chất lượng và phải có lãi Kháng sinh vancomyxin đáp ứng được các yêu cầu đó Cho đến nay trong nước chưa có nghiên cứu nào liên quan đến sản xuất kháng sinh này Mặc dù vancomyxin không được sử dụng nhiều như penixilin hay cephalosporin, nhưng đây lại là một KS quan trọng, thường được lựa chọn để điều trị VSV gây bệnh kháng lại các KS thông dụng Nghiên cứu tạo chủng giống có HTKS cao, xây dựng quy trình sản xuất vancomyxin sử dụng nguồn nguyên liệu chính sẵn có trong nước, phù hợp với điều kiện Việt Nam là công việc cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao Hơn nữa, nghiên cứu lên men vancomyxin và nắm vững quy trình sản xuất CKS này còn tạo tiền đề cho việc xây dựng cơ sở sản xuất các CKS ở quy mô công nghiệp trong điều kiện Việt Nam, góp phần thực hiện mục tiêu tới năm 2020 sản xuất được 50% tổng số thuốc, do Bộ Y tế đề ra

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Chủng giống vi sinh vật

- Chủng S orientalis 4912 là chủng xạ khuẩn dại, được phòng Công nghệ lên

men mua từ Công ty TG Biotech thuộc Trường Đại học Kyungpook Hàn Quốc (Kyungpook National University - gọi tắt là KNU)

- Các chủng vi sinh kiểm định Bacillus subtilis ATCC 6633, B cereus ATCC 21778, Sarcina lutea M5, Staphylococcus aureus 209P do Tổng cục 5, Bộ

Công an cung cấp và được đưa vào Bộ sưu tập chủng giống của phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học

- Chủng Escherichia coli PA2 do Phòng Công nghệ lên men, Viện Công

nghệ sinh học phân lập và tuyển chọn vào Bộ sưu tập chủng giống của phòng

2.1.2 Hóa chất

Các loại đường: glucoza, mannoza, galactoza Merck (Đức ) Các loại muối khoáng dùng trong lên men: CaCl2, CuSO4… Việt Nam N-metyl-N‟-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) Fluka (Thụy Sỹ)

Vancomyxin HCl (dạng đông khô), (Abbott Laboratories,

North Chicago, IL 60064, USA; LOT 015873A)

(Abbott) Mỹ

Vancomyxin HCl (dạng đông khô), Cat No 627850 Merck (Đức )

2.1.3 Thiết bị

Máy lắc Nhật bản

Thiết bị lên men Bioflo 110 (New Brunswick Scientific) Mỹ

- MT 48 (g/l): Cao nấm men 3; tinh bột tan 10; thạch 20; nước cất 1 lít; pH = 7,

- MT ISP 1 (g/l): Trypton 5; cao nấm men 3; thạch 20; nước cất 1 lít; pH = 7,0-7,2

- MT ISP 2 (g/l): Cao nấm men 4; cao malt 10; dextroza 4; nước cất 1 lít; thạch 20;

pH = 7,3

- MT ISP 4 (g/l): Tinh bột tan 10; K2HPO4 1; MgSO4.7H2O 1; NaCl 1; (NH4)2SO4

2; CaCO3 2; nước cất 1 lít; dung dịch A 1ml; thạch 20; pH = 7,2-7,4 Dung dịch

muối A (%): FeSO4 0,1; MnCl2 0,1; ZnSO4 0,1; nước cất 100 ml

- MT ISP 8 (g/l): Pepton 1; NaCl 0,5; KNO3 1; nước cất 1 lít; pH = 7,0

- MT ISP 9 (g/l): (NH4)2SO4 2,64; K2HPO4 5,65; KH2PO4 2,38; MgSO4 1; dung

dịch B 1 ml; nguồn cacbon 10; thạch đã rửa 20-25; nước cất 1 lít; pH = 6,8-7,0

Dung dịch muối B (%): CuSO4 0,64; FeSO4 0,11; MgCl2 0,79; nước cất 100 ml

- MT 1 (g/l): Glucoza 15; bột đậu tương 15; pepton 3; NaCl 2,5; CaCO3 2; nước cất

1 lít; pH = 6,5-7,0

- MT 2 (g/l): Rỉ đường 20; pepton 5; glucoza 10; sacaroza 20; CaCO3 2; nước cất 1

lít; pH = 6,5-7,0

- MT 3 (g/l): Glucoza 15; bột đậu tương 15; pepton 3; NaCl 2,5; CaCO3 2; nước cất

- MT khoai tây (g/l) : khoai tây 200 ; thạch 20 ; nước cất 1lít ; pH = 7,0-7,2

- MT A-4 (g/l): Glucoza 10; bột đậu tương 10; NaCl 5; CaCO3 1; nước cất 1 lít; pH

= 7,0

- MT A-4H (g/l): Glucoza 15; bột đậu tương 15; NaCl 5; CaCO3 1; nước cất 1 lít;

pH = 7,0

- MT A-9 (g/l): Glucoza 10; rỉ đường 20; pepton 5; nước cất 1 lít; pH = 7,0

- MT A-12 (g/l): Tinh bột tan 10; rỉ đường 10; bột đậu tương 10; K2HPO4 2; NaCl 5; CaCO3 1; nước cất 1 lít; pH = 7,0

- MT TH4- 47 (g/l): Tinh bột tan 15; glucoza 10; lactoza 30; bột đậu tương 30; (NH4)SO4 5; CaCO3 5; nước cất 1 lít; pH = 7,0

- MT YEME (g/l): Cao nấm men 3; pepton 5; cao malt 3; glucoza 10; sacaroza 340; sau khi khử trùng thêm MgCl2 6H2O (2,5M): 2ml/l; pH = 7,2

- MT R2YE (g/l): Sacaroza 103; K2SO4 0,25; MgCl2 6H2O 10,12; glucoza 10; Casaminoaxit 0,1; dungdịch vi lượng 2ml; cao nấm men 5; TES 5,73; nước cất 0,964 lít; sau khi khử trùng thêm KH2PO4 (0,5%) 10ml; CaCl2.2H2O (5M) 4ml; NaOH (1N) 7ml; L-prolin (20%) 15ml; pH = 7,2

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Bảo quản giống

Chủng xạ khuẩn S orientalis 4912 được giữ trong MT 48 thạch nghiêng, ở

nhiệt độ 4oC và cấy chuyền lại hàng tháng Giống sử dụng trong các nghiên cứu được hoạt hoá bằng cách nuôi trên MT 48 thạch nghiêng, ở nhiệt độ 28oC, kéo dài 5-7 ngày Để bảo quản chủng lâu dài, giữ giống trong glyxerin ở -20 oC hoặc -70 đến -80 oC [2]

Bề mặt bào tử: Dùng lưới đồng có phủ lớp collodion đặt trực tiếp lên bề mặt khuẩn ty khí sinh có bào tử, quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử (tại Viện

69, Bộ tư lệnh Bảo vệ Lăng, Bộ Quốc phòng)

2.2.2.2 Đặc điểm nuôi cấy

Chủng S orientalis 4912 được nuôi trên các MT Gauze 1, Gauze 2, 48, ISP1,

ISP2, ISP4, ISP6, ISP8, ISP9, 79 và khoai tây ở 28-30oC Sau 7, 14 và 21 ngày, quan sát khuẩn lạc, màu sắc của khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và sắc tố tiết ra

MT theo phương pháp của Tresner và Backus [61]

Sự hình thành sắc tố melanin: Xạ khuẩn được nuôi trên MT ISP-6 ở 28 và

37oC, quan sát màu của MT sau 24 giờ đến ngày thứ 14

2.2.3 Xác định sinh khối

MT nuôi xạ khuẩn sau khi thu hồi được lọc bằng giấy lọc, rửa lại bằng nước cất vô trùng Lượng sinh khối có trên giấy lọc được xác định bằng phương pháp sấy khô ở nhiệt độ 105oC đến khi trọng lượng không đổi (sấy và cân giấy lọc trước và sau khi lọc) [2]

2.2.4 Xác định hoạt tính kháng sinh

 Phương pháp cục thạch

Chủng xạ khuẩn S orientalis 4912 được nuôi trên MT thạch trong đĩa Petri ở

28-30oC Sau 4-5 ngày dùng khoan nút chai đục các thỏi thạch chuyển sang đĩa khác có MT MPA thạch đã cấy vi sinh vật kiểm định Đặt đĩa Petri ở 4-5o

C trong 4-

6 giờ cho chất kháng sinh khuếch tán vào MT, sau đó đem nuôi ở tủ ấm 37oC trong

24 giờ để vi sinh vật kiểm định phát triển Hoạt tính kháng sinh được xác định bằng đường kính vòng vô khuẩn (mm) xung quanh cục thạch, vòng càng lớn thì hoạt tính kháng sinh càng mạnh [2]

 Phương pháp đục lỗ thạch

Phương pháp đục lỗ được sử dụng để xác định hoạt tính kháng sinh có chứa trong MT lỏng Dùng thiết bị đục lỗ, đục trên MT thạch đã cấy vi sinh vật kiểm định, nhỏ vào lỗ dung dịch cần thử Các bước tiếp theo làm như phương pháp cục thạch Hoạt tính kháng sinh được xác định bằng đường kính vòng vô khuẩn (mm)

xuất hiện xung quanh lỗ đã nhỏ dịch [2]

 Phương pháp khoanh giấy lọc

Phương pháp này được sử dụng để xác định hoạt tính kháng sinh trong dung môi Các khoanh giấy lọc có đường kính 6 mm được tẩm một lượng dịch kháng sinh (thường là 1ml/10 khoanh giấy lọc) Sau đó sấy khô ở 40oC Đặt khoanh giấy lọc đã tẩm dịch kháng sinh trên MT thạch đã cấy vi sinh vật kiểm định, các bước tiếp theo giống phương pháp cục thạch [2]

 Phương pháp định lượng kháng sinh

Định lượng chất kháng sinh bằng phương pháp vi sinh vật học theo Dmitrieva [2] Nồng độ dung dịch chất kháng sinh chuẩn và chất kháng sinh nghiên cứu được định lượng theo phương pháp đục lỗ, vòng vô khuẩn càng gần 17 mm càng chính xác, chất kháng sinh chuẩn được pha loãng theo hệ số 2 Tính hiệu số vòng vô khuẩn giữa hai nồng độ liền kề và tra bảng của Dmitrieva tìm hiệu số chỉnh, sau đó nhân với hiệu số pha loãng và nồng độ kháng sinh chuẩn sẽ được nồng độ chất kháng sinh nghiên cứu (mcg/ml)

2.2.5 Phương pháp lên men

2.2.5.1 Nhân giống

Từ ống nghiệm giữ giống, chủng S orientalis 4912 được cấy chuyển sang ống

nghiệm chứa MT thạch nghiêng, nuôi 4-5 ngày Tiếp theo cấy giống vào bình tam giác, nuôi trên máy lắc (220 vòng/phút), ở nhiệt độ 28o

C trong 48 giờ (giống cấp 1)

Sau đó xạ khuẩn được chuyển sang bình tam giác khác để nhân giống cấp 2 trong

36 giờ, trước khi tiếp vào thiết bị lên men Bioflo [38], [48] Lựa chọn cấp nhân giống nào là tùy thuộc vào khối lượng cần lên men

2.2.5.2 Lựa chọn môi trường lên men thích hợp

Chủng S orientalis 4912 được nuôi trên các MT lên men từ MT1 đến MT12

[40] và Gauze1 [2], A-4, A-4H, TH4-47, A-12, A-9 [63] và 48 [70], là các MT đặc

trưng cho nghiên cứu xạ khuẩn Sau 120 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 28oC, xác định hoạt tính kháng sinh và sinh khối Trên MT nào xạ khuẩn sinh trưởng tốt, tích lũy nhiều sinh khối sẽ chọn làm MT nhân giống MT nào xạ khuẩn tích lũy chất kháng sinh cao nhất sẽ được lựa chọn làm MT lên men

2.2.5.3 Xác định điều kiện lên men sinh tổng hợp kháng sinh

Quá trình lên men chủng 4912 được tiến hành trong bình tam giác dung tích

500 ml trên máy lắc tốc độ 220 vòng/phút, với MT lên men đã lựa chọn ở trên Các thông số nghiên cứu bao gồm nhiệt độ, pH, độ thông khí, tuổi giống và tỷ lệ giống Sau thời gian lên men 120 giờ, xác định HTKS theo phương pháp đục lỗ

- Nhiệt độ: Xạ khuẩn được nuôi ở các nhiệt độ 25, 28 và 35oC

- pH ban đầu: Chỉnh pH ban đầu của MT theo các thang 6; 6,5; 7; 7,5 và 8 trước khi cấy giống

- Độ thông khí: Xạ khuẩn được nuôi trong các bình tam giác 500 ml chứa MT lên men với thể tích 25, 50, 75, 100 và 125 ml Ngoài ra, lượng ôxy hòa tan trong

MT lên men còn được đo bằng máy Horiba U-23 (Nhật)

- Tuổi giống và tỷ lệ tiếp giống: Giống được tiếp vào MT lên men theo các tỷ

lệ 1-12% Để xác định thời gian nhân giống thích hợp, nuôi cấy chủng 4912 trong thời gian 12, 24, 36, 48, 60 và 72 giờ trước khi chuyển vào MT lên men

Khi lên men trên thiết bị Bioflo 110, oxy hòa tan trong dịch lên men được ký hiệu là dO2, đơn vị tính là tỷ lệ phần trăm áp suất bão hòa Oxy hòa tan được điều chỉnh ở các mức: dưới 10%, trong khoảng10-20, 20-30 và 30-40% bằng cách thay đổi tốc độ khuấy lần lượt là 500-600, 500-700, 500-800, 500-900 vòng/phút Sau