Phƣơng pháp lên men

2.2.5.1. Nhân giống

Từ ống nghiệm giữ giống, chủng S. orientalis 4912 đƣợc cấy chuyển sang ống nghiệm chứa MT thạch nghiêng, nuôi 4-5 ngày. Tiếp theo cấy giống vào bình tam giác, nuôi trên máy lắc (220 vòng/phút), ở nhiệt độ 28o

Sau đó xạ khuẩn đƣợc chuyển sang bình tam giác khác để nhân giống cấp 2 trong 36 giờ, trƣớc khi tiếp vào thiết bị lên men Bioflo [38], [48]. Lựa chọn cấp nhân giống nào là tùy thuộc vào khối lƣợng cần lên men.

2.2.5.2. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp

Chủng S. orientalis 4912 đƣợc nuôi trên các MT lên men từ MT1 đến MT12 [40] và Gauze1 [2], A-4, A-4H, TH4-47, A-12, A-9 [63] và 48 [70], là các MT đặc trƣng cho nghiên cứu xạ khuẩn. Sau 120 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 28oC, xác định hoạt tính kháng sinh và sinh khối. Trên MT nào xạ khuẩn sinh trƣởng tốt, tích lũy nhiều sinh khối sẽ chọn làm MT nhân giống. MT nào xạ khuẩn tích lũy chất kháng sinh cao nhất sẽ đƣợc lựa chọn làm MT lên men.

2.2.5.3. Xác định điều kiện lên men sinh tổng hợp kháng sinh

Quá trình lên men chủng 4912 đƣợc tiến hành trong bình tam giác dung tích 500 ml trên máy lắc tốc độ 220 vòng/phút, với MT lên men đã lựa chọn ở trên. Các thông số nghiên cứu bao gồm nhiệt độ, pH, độ thông khí, tuổi giống và tỷ lệ giống. Sau thời gian lên men 120 giờ, xác định HTKS theo phƣơng pháp đục lỗ.

- Nhiệt độ: Xạ khuẩn đƣợc nuôi ở các nhiệt độ 25, 28 và 35oC.

- pH ban đầu: Chỉnh pH ban đầu của MT theo các thang 6; 6,5; 7; 7,5 và 8 trƣớc khi cấy giống.

- Độ thông khí: Xạ khuẩn đƣợc nuôi trong các bình tam giác 500 ml chứa MT lên men với thể tích 25, 50, 75, 100 và 125 ml. Ngoài ra, lƣợng ôxy hòa tan trong MT lên men còn đƣợc đo bằng máy Horiba U-23 (Nhật).

- Tuổi giống và tỷ lệ tiếp giống: Giống đƣợc tiếp vào MT lên men theo các tỷ lệ 1-12%. Để xác định thời gian nhân giống thích hợp, nuôi cấy chủng 4912 trong thời gian 12, 24, 36, 48, 60 và 72 giờ trƣớc khi chuyển vào MT lên men.

Khi lên men trên thiết bị Bioflo 110, oxy hòa tan trong dịch lên men đƣợc ký hiệu là dO2, đơn vị tính là tỷ lệ phần trăm áp suất bão hòa. Oxy hòa tan đƣợc điều chỉnh ở các mức: dƣới 10%, trong khoảng10-20, 20-30 và 30-40% bằng cách thay đổi tốc độ khuấy lần lƣợt là 500-600, 500-700, 500-800, 500-900 vòng/phút. Sau 120 giờ lên men, xác định sinh khối và HTKS, sẽ tìm đƣợc giá trị oxy hòa tan cho

sinh tổng hợp vancomyxin cao nhất [30]. Mẫu đối chứng duy trì tốc độ khuấy 500 vòng/phút.

2.2.6. Phƣơng pháp xử lý tế bào bằng sóng siêu âm

Chủng S. orientalis 4912 đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng 48 dịch thể [70], sau 48 h nuôi cấy, thu sinh khối bằng cách ly tâm, hòa tan lại vào đệm pH 8; đƣa vào xử lý tế bào bằng siêu âm.

Huyền phù thu đƣợc sau siêu âm đƣợc dùng để gây đột biến.

2.2.7.Thu nhận tế bào trần xạ khuẩn

2.2.7.1. Thu nhận tế bào trần

Phƣơng pháp thu nhận tế bào trần theo Hopwood và cộng sự [24] đƣợc tóm tắt nhƣ sau:

TBT đƣợc bảo quản trong dung dịch P (xem phần phụ lục) hoặc P+glyxerin (tỷ lệ 1:1) ở -70oC. Để làm tan băng, lắc nhẹ các ống đông lạnh trong cốc nƣớc ở nhiệt độ 35oC.

2.2.7.2. Phục hồi và xác định số lượng tế bào trần

Cách 1: Tế bào trần của xạ khuẩn đƣợc pha loãng trong dung dịch P tới 10-5 và dung dịch SDS 0,01% tới 10-3. Sau đó lấy ở mỗi nồng độ 100l cấy vào đĩa Petri có MT R2YE đã làm khô trong tủ ấm 37oC kéo dài 24 giờ. Sau 5-7 ngày nuôi ở 28oC, đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch. Số tế bào trần bằng hiệu số giữa số khuẩn lạc

Xạ khuẩn (nuôi trong môi trƣờng dịch thể ở 28o

C, 48 giờ)

Sinh khối rửa 2 lần trong dung dịch sacaroza 10,3%

Sinh khối

Dịch huyền phù tế bào trần

Tế bào trần

Ủ trong dung lịch lysozym nồng độ 1mg/ml, ở 30oC Lọc qua phin lọc Milipore hoặc qua bông (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Ly tâm ở 4 oC trong 7 phút (3.000 v/p) Ly tâm 10 phút (3.000 v/p)

mọc trên đĩa có TBT pha trong dung dịch P và số khuẩn lạc trên đĩa có huyền dịch TBT pha trong SDS [24].

Cách 2: Pha loãng dịch tế bào trần bằng dung dịch P (ngoài tế bào trần còn tế bào nguyên vỏ), sau đó đếm trên buồng đếm hồng cầu đƣợc số tế bào là M1, [32]. Pha loãng dịch tế bào trần bằng dung dịch SDS 0,01% (tế bào trần bị vỡ), sau đó đếm trên buồng đếm hồng cầu đƣợc số tế bào là M2 (tế bào nguyên vỏ).

Số tế bào trần đƣợc tính nhƣ sau: M0 = M1 – M2.

Tổng số tế bào trần có trong 1 ml dịch đƣợc tính theo công thức sau: M = a x 400 x 10 x 103 x P

Trong đó, a là số tế bào trung bình trong 1 ô; P là độ pha loãng

2.2.8. Nghiên cứu nâng cao hiệu suất sinh kháng sinh bằng xử lý UV và N-metyl-N’-nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG) metyl-N’-nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG)

2.2.8.1. Gây đột biến bằng tia UV

Để thu đƣợc bào tử cho xử lý UV, chủng S. orientalis 4912 đƣợc nuôi trong ống nghiệm chứa MT 48 thạch nghiêng 8-10 ngày. Nhỏ nƣớc cất vô trùng theo mặt thạch và lọc qua dụng cụ lọc để lấy bào tử. Lấy 1ml dịch lọc cho vào 9 ml nƣớc cất hoặc nƣớc muối sinh lý đã khử trùng đƣợc dịch bào tử có độ pha loãng 10-1 tiếp tục pha loãng đến 10-8. Lấy ở mỗi độ pha loãng 100 l trang đều lên đĩa petri chứa MT 48, ở mỗi độ pha loãng làm ít nhất hai đĩa (Đối chứng).

Dịch bào tử hoặc dịch TBT đƣợc đặt trong cốc đong để chiếu tia UV với công suất của đèn là 30W, bƣớc sóng 2537A0 (260nm), cƣờng độ chiếu sáng 8x103 ergs/cm2/giây. Để xác định tỷ lệ sống sót qua các thời gian chiếu thì phải cố định khoảng cách từ đèn đến bề mặt dịch tế bào, khoảng cách 20 cm là phù hợp [65]. Thời gian chiếu thay đổi từ 5- 80 giây. Trong suốt thời gian chiếu dịch tế bào phải đƣợc khuấy nhẹ nhàng. Ở mỗi thời gian chiếu, hút 1ml dịch pha loãng với 9 ml nƣớc muối sinh lý vô trùng, trang đều lên đĩa Petri chứa MT 48 và R2YE, mỗi nồng độ làm ít nhất hai đĩa. Tất cả các thao tác làm trong điều kiện vô trùng. Các đĩa sau đó đƣợc nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 28oC, kéo dài 5-7 ngày để các khuẩn lạc phát triển [24].

2.2.8.2. Gây đột biến bằng MNNG

Dịch có tế bào trần hay bào tử, tế bào sau siêu âm đƣợc xử lý bằng chất gây đột biến MNNG (0,1-1 mg/ml) trong đệm TM pH = 8, giữ ở 30oC trong 10-120 phút. Sau đó ly tâm (7000 v/p, 5 phút), loại dịch nổi, rồi pha loãng bằng nƣớc cất hoặc dung dịch P có pH = 7,2 đến nồng độ 10-5. Lấy ra 0,1 ml nhỏ vào các đĩa Petri đã có 20 ml MT 48 và R2YE, nuôi ở 28oC trong 5 - 7 ngày [32]. Đếm số lƣợng khuẩn lạc phát triển, quan sát sự biển đổi hình thái và xác định hoạt tính kháng sinh của các khuẩn lạc đã phục hồi [24].

2.2.9. Xây dựng đƣờng cong sống sót

Đồ thị sống sót biểu diễn mối quan hệ giữa tỷ lệ % tế bào sống sót với thời gian xử lý. Sau khi nuôi cấy đếm số khuẩn lạc ở các độ pha loãng, thời gian chiếu tia UV hoặc xử lý với MNNG khác nhau và đĩa kiểm chứng. Các khuẩn lạc đếm phải phát triển tốt mọc riêng rẽ. Từ đó, xác định đƣợc tỷ lệ % tế bào sống sót ở các thời gian chiếu tia UV hoặc xử lý với MNNG khác nhau theo công thức [32]:

% SS =

Nm  100 %

Nm: số khuẩn lạc sống sót sau đột biến No: số khuẩn lạc ở mẫu kiểm chứng

2.2.10. Xác định sự biến đổi hình thái khuẩn lạc và hoạt tính kháng sinh

Biến đổi hình thái:Quan sát bằng mắt thƣờng các khuẩn lạc sau khi nuôi cấy ở các đĩa đã chiếu tia UV hoặc xử lý với MNNG và các đĩa kiểm chứng, về hình dạng khuẩn lạc, màu sắc khuẩn ty, sắc tố tiết ra MT để xác định sự thay đổi của chủng đột biến so với chủng gốc, [61].

Biến đổi hoạt tính kháng sinh: Sau khi xác định hoạt tính kháng sinh của các khuẩn lạc, sự biến động hoạt tính kháng sinh đƣợc xác định theo công thức sau:

% BĐHT = o i D D  100 %

Di: đƣờng kính vòng vô khuẩn biến chủng i Do: đƣờng kính vòng vô khuẩn chủng gốc

Từ phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng sinh ta chọn đƣợc khoảng phân bố hoạt tính kháng sinh của các chủng gây đột biến. Từ đó xây dựng đƣợc đồ thị phân bố hoạt tính kháng sinh biểu diễn mối quan hệ giữa số khuẩn lạc và đƣờng kính vòng vô khuẩn (D). Xác định đƣờng kính trung bình các lần đo: X = n X n i i 

Xi: giá trị đƣờng kính vòng vô khuẩn của lần đo i n: số lần đo Xác định độ lệch chuẩn :  = 1 ) ( 2    n X Xi

Các khuẩn lạc có đƣờng kính vòng vô khuẩn lớn hơn X +2 là những biến chủng dƣơng tính. Ngƣợc lại, các khuẩn lạc có đƣờng kính vòng vô khuẩn nhỏ hơn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

X -2 là những biến chủng âm tính. Chọn những biến chủng dƣơng tính cho lên men trong bình tam giác, nuôi trên máy lắc trong 5 ngày ở nhiệt độ 28o

C. Kết thúc quá trình lên men, xác định hoạt tính bằng phƣơng pháp đục lỗ thạch, dựa vào đƣờng kính vòng vô khuẩn chọn đƣợc chủng có hoạt tính kháng sinh cao nhất.

CHƢƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG Streptomyces orientalis 4912

Chủng S. orientalis 4912 đƣợc tuyển chọn từ bộ sƣu tập chủng giống vi sinh vật của phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học. Kết quả nghiên cứu chọn lọc xạ khuẩn sinh vancomyxin cho thấy đặc điểm ƣu việt của chủng 4912 là tính ổn định về khả năng phát triển và sinh kháng sinh qua thời gian bảo quản. Vì vậy, chủng xạ khuẩn này đƣợc sử dụng để nghiên cứu quy trình lên men sản xuất vancomyxin phù hợp điều kiện Việt Nam.

3.1.1. Đặc điểm nuôi cấy

Chủng S. orientalis 4912 đƣợc nuôi trên các môi trƣờng (MT) thạch có thành phần dinh dƣỡng khác nhau. Đây là các MT nuôi cấy đặc trƣng để phân loại các chủng xạ khuẩn. Đặc điểm nuôi cấy của chủng S. orientalis 4912 trên các MT đƣợc trình bày ở bảng 3.1. Kết quả cho thấy, sau 14 ngày nuôi, KTKS của chủng S. orientalis 4912 trên các MT khác nhau đều là màu trắng. Sau đó xạ khuẩn hình thành bào tử nên bắt đầu có sự thay đổi màu sắc,trên MT Gauze 1 và ISP-6, KTKS chuyển sang màu đỏ, trên MT Gauze 2 và ISP-4, KTKS chuyển sang màu vàng nhạt, trong khi vẫn giữ nguyên màu trắng trên MT 48 và MT khoai tây. Chủng 4912 phát triển tốt trên MT Gauze 1 và Gauze 2. Trên các MT, chủng S. orientalis 4912 không sinh sắc tố tan.

Bảng 3.1. Đặc điểm nuôi cấy của chủng S. orientalis 4912 MT Sinh trƣởng Màu KTCC Màu KTKS Sắc tố tan

Gauze 1 +++ Đỏ - vàng nâu Trắng đỏ Không có

Gauze 2 +++ Nâu vàng Trắng vàng Không có

ISP 1 +++ Trắng Vàng kem Không có

ISP 2 ± Trắng Vàng nhạt Không có

ISP 4 ± Trắng vàng Trắng vàng Không có

ISP 6 +++ Nâu vàng Trắng đỏ Không có

ISP 9 ± Trắng Nâu nhạt Không có

48 ++ Xám Trắng Không có

79 ± Trắng Vàng sáng Không có

Khoai tây ++ Nâu vàng - đỏ Trắng Không có

Ghi chú: +++: sinh trưởng tốt; ++: sinh trưởng bình thường; ±: sinh trưởng kém

Hình 3.1. Khuẩn lạc của chủng S. orientalis 4912 trên MT 48 3.1.2. Đặc điểm hình thái

Chủng S. orientalis 4912 đƣợc nuôi cấy trên MT Gauze 1 ở nhiệt độ 28oC trong 7-14 ngày, sau đó làm tiêu bản quan sát dƣới kính hiển vi. Hình dạng khuẩn ty và bào tử của chủng S. orientalis 4912 đƣợc thể hiện ở hình 3.2 và 3.3.

Hình 3.3. Hình dạng khuẩn ty và chuỗi bào tử của chủng S. orientalis 4912

của chủng S. orientalis 4912 (x 15.000)

Kết quả quan sát dƣới kính hiển vi điện tử cho thấy, chủng S. orientalis 4912 có khuẩn ty khá lớn mọc đan xen với nhau. Bào tử kết thành chuỗi dạng lƣợn sóng, và đƣợc hình thành ở đầu của các chuỗi. Trên mỗi chuỗi có khoảng từ 15-20 bào tử. Bào tử có dạng hình trụ, hình trứng, kích thƣớc 0,5-1 x 2-3 μm, bề mặt bào tử xù xì (kiểu Wa). Quan sát bằng mắt thƣờng thì thấy đó là các đám màu vàng xám.

3.2. KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH CỦA CHỦNG

Streptomyces orientalis 4912 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Thử nghiệm lên men chủng 4912 với 6 loại MT cơ sở có các nguồn dinh dƣỡng khác nhau là A-4, A-4H, A-9, A-12, Gauze 1 và 48. Kết quả kiểm tra HTKS của chủng S. orientalis 4912 cho thấy, chủng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh. Phổ kháng khuẩn của xạ khuẩn cũng là một trong những chỉ tiêu phân loại cần đƣợc nghiên cứu. Hoạt tính kháng khuẩn của chủng 4912 đƣợc kiểm tra với 5 loại vi khuẩn kiểm định là Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacillus cereus ATCC 21778,

Sarcina lutea M5 và Staphylococcus aureus 209P thuộc nhóm vi khuẩn Gram dƣơng và Escherichia coli PA2 thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm.

Kết quả trên bảng 3.2 và hình 3.4 cho thấy, chủng S. orientalis 4912 có khả năng ức chế đƣợc cả vi khuẩn Gram dƣơng và vi khuẩn Gram âm. Mặc dầu số lƣợng chủng vi sinh vật kiểm định đƣợc sử dụng ở đây chỉ có tính đại diện, nhƣng kết quả thu đƣợc cũng phù hợp với các công trình nghiên cứu khác là các chủng S. orientalis có phổ kháng khuẩn khá rộng và mạnh. Trên các MT, chủng S. orientalis

Hình 3.4. Hoạt tính kháng sinh kháng B. subtilis ATCC 6633 của chủng S. orientalis 4912

trên MT Gauze 1, chủng có sinh trƣởng nhƣng lại không sinh ra CKS ức chế vi sinh vật kiểm định. Ở các MT còn lại, xạ khuẩn sinh trƣởng tốt và sinh ra CKS ức chế vi sinh vật kiểm định, tuy nhiên CKS sinh ra không nhiều.

Bảng 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của chủng S. orientalis 4912

MT Hoạt tính kháng khuẩn (ĐKVVK, mm) B. subtilis ATCC 6633 E. coli PA2 S. aureus 208P S. lutea M5 B. cereus ATCC 21778 Gauze 1 0 0 0 0 0 A-4 12,5 11,5 14,0 10,5 12,5 A-4H 13,0 13,0 14,0 13,2 12,5 A-12 11,5 9,0 11,5 9,0 9,0 A- 9 14,2 12,0 13,5 13,4 10,1 48 16,0 14,5 15,4 14,5 12,8

3.3. NÂNG CAO HOẠT TÍNH KHÁNG SINH CỦA CHỦNG S. orientalis 4912

Yếu tố quan trọng hàng đầu cho mọi quá trình lên men sinh tổng hợp hoạt chất sinh học là chủng giống vi sinh vật. Để đảm bảo chủng giống luôn có hoạt tính cao,

ngoài việc bảo quản tốt chủng giống bằng các phƣơng pháp giữ giống, ngƣời ta còn thƣờng xuyên tuyển chọn nâng cao hiệu suất bằng các kĩ thuật di truyền.

Với mục đích tuyển chọn chủng giống có hiệu suất cao và bền vững, chủng

S. orientalis 4912 đƣợc tiến hành nghiên cứu chọn lọc, gây đột biến TBT và bào tử bằng tia UV và N-metyl-N‟-nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG).

Mặt khác, chủng S. orientalis 4912 đƣợc nuôi cấy và đƣa vào máy siêu âm phá màng tế bào sau đó đƣa vào đột biến bằng MNNG. Từ các kết quả nghiên cứu có thể lựa chọn đƣợc phƣơng pháp gây đột biến thích hợp tạo chủng sản có năng suất cao.

3.3.1. Thu nhận bào tử và tế bào trần từ chủng S. orientalis 4912

Để thu đƣợc bào tử cho xử lý đột biến, chủng S. orientalis 4912 đƣợc nuôi trong ống thạch nghiêng chứa MT 48 từ 8-10 ngày. Nhỏ nƣớc cất vô trùng theo mặt thạch, cạo nhẹ trên bề mặt để gạt bào tử vào nƣớc và đổ qua dụng cụ lọc để lấy bào tử. Để thu đƣợc TBT, chủng 4912 đƣợc nuôi trong MT YEME dịch thể, sau đó sinh khối đƣợc xử lý với lysozym . Tuy nhiên, việc tạo TBT phụ thuộc chủ yếu vào thời

Mục lục