trên một số MT
MT Gauze 1 Gauze 2 A 4 A- 4H TH4- 47 A 12 A 9 48
Sinh trƣởng
(SKK, mg/ml) 5,6 5,5 4,0 4,3 4,7 4,5 5,3 6,0
3.5.2. Lựa chọn môi trƣờng lên men
Trên 11 MT lên men cơ bản cho xạ khuẩn sinh kháng sinh MT 1 - MT 11, chủng S. orientalis 4912-81-61 đều có khả năng sinh trƣởng và sinh CKS, tuy nhiên có sự khác biệt rất lớn. HTKS đƣợc xác định theo phƣơng pháp Dmitrieva, dao động trong khoảng 1609-1889 mcg/ml. Căn cứ vào kết quả thu đƣợc thì lên men trên MT 5 HTKS của chủng lớn nhất, là 1889 mcg/ml. MT 5 có thành phần nhƣ sau đƣợc lựa chọn để nghiên cứu tiếp (g/l): Glucoza 15; khô đậu tƣơng 15; pepton 5; NaCl 2,5; CaCO3 2; pH 6,5-7,0.
3.5.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng S. orientalis 4912-81-61 chủng S. orientalis 4912-81-61
Với mục đích nghiên cứu một số yếu tố ảnh hƣởng tới sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp vancomyxin, nhằm tối ƣu các điều kiện lên men và thành phần MT sử
60
dụng nguồn nguyên liệu trong nƣớc, chủng S. orientalis 4912-81-61 đƣợc nuôi trong bình tam giác có thể tích 500 ml, trên máy lắc 220 vòng/phút, kéo dài 120 giờ.
3.5.3.1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men
Hai thành phần chủ yếu trong MT lên men cung cấp chất dinh dƣỡng cho sinh trƣởng của vi sinh vật và ảnh hƣởng lớn đến sinh tổng hợp CKS là cacbon và nitơ. Do vậy, nghiên cứu lựa chọn nguồn dinh dƣỡng này sao cho rẻ tiền và sẵn có trong nƣớc là việc rất quan trọng.
Nguồn cacbon duy nhất của MT 5 là glucoza. Để xác định nguồn cacbon thích hợp, lần lƣợt thay thế glucoza bằng các nguồn cacbon khác sẵn có trên thị trƣờng trong nƣớc và thƣờng dùng trong lên men nhƣ đƣờng kính, tinh bột tan, dextrin, bột ngô, với hàm lƣợng tính theo cacbon tƣơng đƣơng nhƣ glucoza. Các thành phần khác của MT đƣợc giữ nguyên.
Bảng 3.12. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng S. orientalis 4912-81-61
Nguồn cacbon HTKS (mcg/ml) Sinh khối khô (mg/ml)
Glucoza 1889 7,9
Bột ngô 1793 7,9
Đƣờng kính 1908 8,05
Tinh bột tan 1695 8,1
Dextrin 1908 8,0
Kết quả thể hiện trên bảng 3.12 cho thấy, những nguồn cacbon đƣợc sử dụng trong thí nghiệm đều có tác dụng tốt tới khả năng sinh tổng hợp kháng sinh nhƣng tốt nhất là dextrin và đƣờng kính. Tuy nhiên, đƣờng kính có giá thành rẻ hơn dextrin rất nhiều và sẵn có trên thị trƣờng, ngoài ra không tạo màu hay làm đục MT, vì thế sẽ thuận lợi cho khâu thu hồi và tinh sạch CKS. Do vậy, nguồn cacbon này đƣợc lựa chọn cho lên men sinh tổng hợp vancomyxin. Bên cạnh nguồn cacbon chính đã lựa chọn là đƣờng kính, thành phần glucoza trong MT sẽ không bị thay thế
61
do đây là nguồn dinh dƣỡng dễ tiêu thụ, thuận lợi cho sinh trƣởng của chủng giống trong giai đoạn đầu của quá trình lên men. Cần phải nghiên cứu tìm hàm lƣợng glucoza thích hợp cho sinh trƣởng của chủng sản mà không ức chế quá trình tạo thành vancomyxin.
Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng S. orientalis 4912-81-61
Nguồn nitơ HTKS (mcg/ml) Sinh khối khô (mg/ml)
Bột đậu tƣơng 1909 8,2
Khô đậu tƣơng 1896 8,0
Cao nấm men 1630 7,8
Pepton 1889 7,9
NH4Cl 1617 6,3
NH4NO3 1600 6,9
(NH4)2SO4 1620 6,7
Trong MT 5 có pepton và khô đậu tƣơng là nguồn cung cấp nitơ. Tiến hành thay thế pepton bằng các nguồn nitơ khác nhau và vẫn giữ nguyên các thành phần khác. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của các nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ thông dụng tới khả năng phát triển và sinh tổng hợp CKS của chủng S. orientalis 4912-81- 61 đƣợc thể hiện ở bảng 3.13 cho thấy, các nguồn nitơ hữu cơ rất tốt cho quá trình sinh tổng hợp kháng sinh và có tác động tích cực nhất là bột đậu tƣơng, điều này cũng phù hợp với một số công trình nghiên cứu sinh tổng hợp vancomyxin từ xạ khuẩn S. orientalis [30], [33]. Các nguồn nitơ vô cơ nhƣ NH4Cl, NH4NO3 và (NH4)2SO4 có tác động không tốt đối với việc sinh tổng hợp vancomyxin. Từ những kết quả trên, bột đậu tƣơng đƣợc lựa chọn là nguồn nitơ thích hợp cho quá trình lên men sinh tổng hợp vancomyxin của chủng 61. Giá trị dinh dƣỡng của bột đậu tƣơng cũng cao. Hàm lƣợng đạm trong bột đậu tƣơng dao động trong khoảng 36 - 40%, trong đó có chứa đầy đủ các axit amin cần thiết. Ngoài ra, trong bột đậu tƣơng còn có 19,46% axit glutamic; 3,89% axit aspartic; 1,12% xystein; 22 - 35,5% gluxit;
62
chất béo; một số vitamin và các muối khoáng. Đây là nguồn nguyên liệu rẻ tiền và sẵn có tại Việt Nam.
Tuy nhiên trong thành phần MT 5 ban đầu, ngoài pepton còn có khô đậu tƣơng cũng cung cấp nguồn nitơ cho quá trình lên men. Thành phần của khô đậu tƣơng gần giống nhƣ bột đậu tƣơng, ngoại trừ hàm lƣợng chất béo (dƣới 8%) và vitamin ít hơn do quá trình chế biến tách dầu làm giảm đi. Theo bảng 3.13, khi trong MT có khô đậu tƣơng và bột đậu tƣơng, HTKS là 1909 mcg/ml; khi chỉ có nguồn nitơ là khô đậu tƣơng HTKS là 1896 mcg/ml. Khi chỉ sử dụng bột đậu tƣơng với hàm lƣợng bằng tổng hàm lƣợng của bột đậu tƣơng trong thí nghiệm trên (11,2 g/l) và lƣợng khô đậu theo thành phần ban đầu của MT 5 (15 g/l), HTKS đạt 1917 mcg/ml. Nhƣ vậy, sự chệnh lệch này không nhiều. Điều đáng chú ý là khô đậu tƣơng cũng sẵn có trên thị trƣờng và có giá thành rẻ hơn, chỉ bằng khoảng 1/5 giá thành bột đậu tƣơng. Vì thế, khi lên men mẻ lớn cần nghiên cứu kỹ hơn khả năng sử dụng khô đậu tƣơng để hạ giá thành. Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi đã lựa chọn nguồn cacbon và nitơ chính là bột đậu tƣơng và đƣờng saccaroza. Tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của hàm lƣợng các nguồn dinh dƣỡng này tới sinh tổng hợp vancomyxin của chủng S. orientalis 4912-81-61, kết quả trình bày ở bảng 3.14.
Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của bột đậu tƣơng, glucoza và đƣờng saccaroza tới khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng S. orientalis 4912-81-61 Đƣờng saccaroza (g/l) HTKS (mcg/ml) Glucoza (g/l) HTKS (mcg/ml) Bột đậu tƣơng (g/l) HTKS (mcg/ml) 15 1908 5 1908 5 1896 30 1929 10 1920 15 1921 45 1955 15 1945 25 1949 60 1937 20 1892 35 1931 75 1904 25 1885 45 1909
63
Trong thí nghiệm, chủng 61 đƣợc nuôi lắc trong bình tam giác 500 ml với 75 ml MT. Hàm lƣợng đƣờng sacaroza thay đổi từ 15-75 g/l; bột đậu tƣơng thay đổi từ 5-45 g/l; glucoza từ 5-25 g/l. Từ bảng 3.14, tìm đƣợc khoảng có ý nghĩa công nghệ của các thành phần MT lên men là: đƣờng kính 30-60 g/l; glucoza 10-20 g/l; bột đậu tƣơng 15-35 g/l. Tối ƣu thành phần MT lên men theo phƣơng pháp Box- Wilson, lập đƣợc phƣơng trình hồi qui nhƣ sau:
3 2 1 3 3 2 2 1 1 0 ~ 61 , 0 ~ 4 , 0 ~ 35 , 0 24 , 23 ~ ~ ~ b x b x x x x x b b Y
Từ đó thực hiên tối ƣu hoá chọn đƣợc bƣớc nhảy của x1 (glucoza) là 0,5 g/l; x2 (đƣờng saccaroza) là 1,7 g/l; bƣớc nhảy của x3 (bột đậu tƣơng)là 1,4 g/l. Thực nghiệm theo ma trận tiến lên tìm đƣợc thành phần MT cho sinh tổng hợp
vancomyxin cao nhất bởi biến chủng 61 là (g/l): đƣờng kính 51,8; glucoza 17; bột đậu tƣơng 30,6; NaCl 2,5; CaCO3 2; pH 6,5-7,0. Trên MT tối ƣu, sau 120 giờ lên men, CKS tích lũy đạt 2603 mcg/ml.
Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của CaCl2 đến khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng S. orientalis 4912-81-61
Bảng 3.16. Ảnh hƣởng của CuSO4 đến khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng S. orientalis 4912-81-61 Hàm lƣợng CaCl2.2H2O (mg/l) HTKS (mcg/ml) Hàm lƣợng CuSO4.5H2O (mg/l) HTKS (mcg/ml) 0 2603 0 2603 1 2608 1 2603 5 2613 5 2611 10 2620 10 2621 20 2623 20 2595 40 2629 40 2458 100 2490
64
Theo một số tài liệu, trong quá trình lên men vancomyxin, các chất khoáng có ảnh hƣởng tích cực lên hoạt động của các enzym. Tiến hành thí nghiệm với một số muối khoáng đƣợc cho là có tác động tốt lên khả năng sinh vancomyxin nhƣ CaCl2 và CuSO4 [29], [33]. Kết quả nghiên cứu trên bảng 3.15 và 3.16 cho thấy, khi nghiên cứu riêng rẽ từng loại muối khoáng, hàm lƣợng CaCl2.2H2O thích hợp là 40 mg/l, hàm lƣợng CuSO4 đƣợc lựa chọn là 10 mg/l. Khi MT có hàm lƣợng các muối khoáng lớn hơn thì HTKS của chủng sẽ giảm. Đặc biệt khi kết hợp 2 loại muối khoáng trong MT 5 đã tối ƣu tại các hàm lƣợng lựa chọn trên, sau thời gian lên men 120 giờ, hoạt tính kháng sinh tăng lên, đạt 2648 mcg/ml.
Theo một số tài liệu [30], [33], [48], [54], tối ƣu các điều kiện nuôi cấy nhƣ pH, nhiệt độ, độ oxy hòa tan, thành phần MT lên men có thể tăng khả năng sinh kháng sinh của chủng sản lên gần 2 lần. Trên cơ sở MT 5 đã tối ƣu có thành phần (g/l): đƣờng kính 51,8; glucoza 17; bột đậu tƣơng 30,6; NaCl 2,5; CaCO3 2; CaCl2.2H2O 0,04; CuSO4.5H2O 0,01; pH 6,5-7,0; tiếp tục nghiên cứu tối ƣu các điều kiện lên men cho sinh tổng hợp vancomyxin bởi biến chủng S. orientalis 4912- 81-61.
3.5.3.2. Ảnh hưởng của một số điều kiện lên men
Ảnh hƣởng của các yếu tố điều kiện lên men nhƣ pH ban đầu của MT, nhiệt độ, tỷ lệ giống tiếp vào MT đối với chủng 61 đƣợc nghiên cứu riêng rẽ trong bình tam giác. Dải pH khảo sát là 6-7,5; nhiệt độ 25-32o
C; tỷ lệ tiếp giống 4-10%.
Kêt quả ở bảng 3.17 cho thấy, tỷ lệ tiếp giống không có ảnh hƣởng rõ rệt đến quá trình lên men. Nhƣ vậy, lựa chọn tỷ lệ tiếp giống 4% cho các thí nghiệm tiếp theo. Khi lên men ở các nhiệt độ 25, 28, 30 và 32oC thì HTKS của chủng 61 đạt cao nhất là 2657 mcg/ml ở 30oC. So với chủng gốc 4912, nhiệt độ tối thích cho lên men sinh vancomyxin của chủng 61 cao hơn 2oC. Độ pH tối ƣu cho sinh vancomyxin của chủng 4912-81-61 là 6,5 - 7, điều này cũng phù hợp với một số tài liệu đã công
65
bố về S. orientalis rằng pH thích hợp cho sinh trƣởng cũng đồng thời là pH thích hợp cho sự tạo thành CKS [29], [30], [33].
Bảng 3.17. Ảnh hƣởng của pH, nhiệt độ, tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng S. orientalis 4912-81-61
pH ban đầu HTKS (mcg/ml) Nhiệt độ (oC) HTKS (mcg/ml) Tỷ lệ giống (%) HTKS (mcg/ml) 6 2013 25 1506 4 2645 6,5 2648 28 2648 6 2648 7 2665 30 2657 8 2642 7,5 2110 32 1618 10 2439
Nhƣ vậy, biến chủng 61 chỉ khác biệt so với chủng gốc ở khả năng sinh vancomyxin cao hơn còn vẫn giữ những đặc tính sinh lý cơ bản ƣa ấm và ƣa pH trung tính. Trong các thí nghiệm tiếp theo với biến chủng này sẽ áp dụng điều kiện: pH ban đầu 7,0; tỷ lệ tiếp giống 4% và nhiệt độ nuôi 30o
C.
Chủng S. orientalis là vi sinh vật hiếu khí, do đó hàm lƣợng oxy hòa tan trong MT nhân giống và lên men đóng một vai trò rất quan trọng đối với sinh trƣởng và sinh tổng hợp vancomyxin. Nhu cầu về oxy của biến chủng 61 đƣợc đánh giá một cách gián tiếp thông qua nuôi lắc trong bình tam giác 500 ml với thể tích MT thay đổi từ 50, 75, 100, 125 và 150 ml. Tỷ lệ giữa MT và thể tích bình tƣơng ứng là: 10, 15, 20, 25 và 30%. Kết quả đo HTKS cho thấy lƣợng kháng sinh đạt cao nhất là 2665 mcg/ml khi thể tích MT là 50 ml, tƣơng ứng với 10% thể tích bình. Kiểm tra song song bằng phƣơng pháp đục lỗ thạch cũng cho kết quả tƣơng tự (Hình 3.12), trong đó 50, 75, 100, 125 và 150 là mẫu tƣơng ứng với thể tích MT lên men. Trên hình cũng thấy rõ hoạt tính kháng sinh giảm mạnh đối với các thể tích MT khác. Điều này phù hợp với công bố của các tác giả khác nghiên cứu về sinh
66
tổng hợp vancomyxin từ xạ khuẩn S. orientalis rằng thể tích MT lên men chiếm khoảng 10 % so với thể tích bình là phù hợp [30], [47].
Theo một số tài liệu [30], [33] về lên men xạ khuẩn S. orientalis sinh vancomyxin ở quy mô pilot, nếu điều chỉnh hàm lƣợng oxy hòa tan trong MT ở mức 20-30% bằng cách thay đổi tốc độ khuấy có thể tăng HTKS của chủng sản lên đáng kể.
Để nghiên cứu ảnh hƣởng của hàm lƣợng oxy hòa tan trong MT tới sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp vancomyxin trong thiết bị Bioflo, các thí nghiệm lên men biến chủng 4912-81-61 đƣợc thực hiện trong hệ thống Bioflo 110 dung tích 7,5 lit. Khí nén đƣợc cấp với tốc độ không đổi 1 lít không khí/ 1 lít MT/ 1 phút. Tốc độ khuấy trong bình đối chứng đƣợc duy trì ở 500 vòng/phút trong suốt quá trình lên men, còn trong các bình thí nghiệm thì đƣợc điều chỉnh nhằm duy trì dO2 ở các mức: dƣới 10%, trong khoảng 10-20, 20-30 và 30-40%.
Quan sát các thí nghiệm cho thấy dO2 giảm khá nhanh, sau 24 giờ xuống tới 60% và từ 36 đến 48 giờ lên men phải điều chỉnh tốc độ khuấy để duy trì dO2 ở mức mong muốn. Ở bình đối chứng, sau 48 giờ dO2 xuống tới 20% và giữ ở mức
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của độ thông khí tới khả năng sinh tổng hợp vancomyxincủa biếnchủng S. orientalis 4912-81-61. Trong đó 50, 75, 100, 125 và 150 là thể tích môi
67
rất thấp. Kết quả xác định sinh khối khô và HTKS sau 120 giờ lên men đƣợc trình bày ở bảng 3.18. Theo đó, khi dO2 đƣợc duy trì ở mức 20-30% thì lƣợng vancomyxin và sinh khối đạt cao nhất, tƣơng ứng bằng 2983 mcg/ml và 9,8 mg/ml. Mẫu đối chứng cho kết quả thấp hơn, sinh khối đạt 8,5 mg/ml và HTKS 2509 mcg/ml. Nhƣ vậy, kết quả của các thí nghiệm này cho thấy việc cung cấp đủ oxy hòa tan và bảo đảm đảo trộn tốt trong bình lên men là điều kiện thiết yếu của sản xuất vancomyxin. Điều này cũng phù hợp với nhiều tài liệu đã công bố về ảnh hƣởng của oxy hòa tan tới quá trình trao đổi chất và hình thành sản phẩm. Một số chủng có phản ứng rất dễ nhận biết khi nồng độ oxy hòa tan thấp, ví dụ khi dO2 ở dƣới mức 20% trong MT nuôi cấy xạ khuẩn S. orientalis xuất hiện sắc tố màu đỏ [42]. Tƣơng tự, khi lên men sản xuất erythromyxin từ Saccharopolyspora eythraea
trong điều kiện oxy thấp cũng tạo nên sắc tố đỏ. Tăng sản lƣợng erythromyxin và xephalosporin C bằng cách điều chỉnh lƣợng oxy hòa tan trong MT lên men cũng đã đƣợc công bố bởi Brunker và DeModena. Dunstan cũng công bố khi lên men chủng
S. orientalis ATCC 19795 trong điều kiện oxy thấp thì không có sự tổng hợp vancomyxin [17].
Bảng 3.18. Ảnh hƣởng của oxy hòa tan tới sinh trƣởng và sinh tổng hợp vancomyxin bởi biến chủng S. orientalis 4912-81-61 Oxy hòa tan (%) Sinh khốikhô (mg/ml) HTKS (mcg/ml)
Đối chứng 8,5 2509
0†10 8,9 2680
10 † 20 9,5 2705
20 ÷ 30 9,8 2983
30 † 40 9,5 2552
Có thể tóm tắt kết quả nghiên cứu tối ƣu điều kiện và thành phần MT lên men cho biến chủng S. orientalis 4912-81-61 nhƣ sau: MT tối ƣu bao gồm (g/l): đƣờng kính 51,8; glucoza 17; bột đậu tƣơng 30,6; NaCl 2,5; CaCO3 2; CaCl2.2H2O 0,04;
68
CuSO4.5H2O 0,01. Điều kiện lên men thích hợp nhất: pH 7, nhiệt độ 30o
C, tỷ lệ tiếp giống 4%, thể tích MT lên men chiếm 10% so với thể tích bình (quy mô bình tam giác) hoặc dO2 ở mức 20-30% và tốc độ khuấy tới 800 vòng/phút (quy mô bình lên men Bioflo 110).
3.5.3. Biến động quá trình lên men sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng
S. orientalis 4912-81-61trong thiết bị lên men Bioflo
Để xác định đƣợc thời điểm thu hồi CKS thích hợp nhất cần nghiên cứu động thái quá trình lên men sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng 61. Thí