Ngƣời ta phát hiện thấy CKS vancomyxin thƣờng đƣợc tổng hợp bởi xạ khuẩn S. orientalis (trƣớc đây có tên Nocardia orientalis và Amycolatopsis orientalis). Việc phát hiện ra vancomyxin đƣợc coi nhƣ cứu cánh cho nhân loại, do có đặc tính chữa bệnh rất cao, phần nào khắc phục đƣợc hiện tƣợng kháng thuốc
30
của vi sinh vật gây bệnh [58]. Vancomyxin đƣợc đƣa vào thử nghiệm chữa bệnh từ năm 1958, và Bộ Y tế Mỹ cho phép sử dụng năm 1964 [71], [72]. Dạng vancomyxin thƣơng phẩm đƣợc đóng 500 mg vancomyxin.HCl/lọ, tƣơng đƣơng 0,34 mmol. VANCOCIN. HCl (Vancomyxin dạng tiêm, USP) của hãng Galaxy đƣợc đóng trong lọ plastic (PL 2040) chỉ sử dụng tiêm tĩnh mạch, làm giảm sự phát triển của vi khuẩn kháng kháng sinh, bảo vệ hiệu lực của vancomyxin và các thuốc kháng khuẩn khác. Vancomyxin chỉ nên dùng để chữa hoặc chống nhiễm trùng do vi khuẩn nghi ngờ đã nhờn thuốc gây nên. Khi dùng vancomyxin trong thời gian dài hoặc quá liều có thể bị giảm thính giác, gây điếc, tổn thƣơng thận. Ngoài ra vancomyxin chỉ có tác dụng khi tiêm qua đƣờng tĩnh mạch và không đƣợc hấp thụ qua đƣờng tiêu hóa [21], [22]. Vancoxyn, VancoxynD, VancoxynD IV, “Vancomycin by Abbott | VANCOCIN HCL | VANCOCIN HCL IN” (tên thƣơng phẩm của vancomyxin) đang đƣợc bán trên thị trƣờng thế giới với giá 18,25 USD/ 500 mg vancomyxin dùng để tiêm [72]. Hiện nay, vancomyxin vẫn đang đƣợc nghiên cứu hoàn thiện sản xuất, tăng độ tinh khiết và giảm độ độc của nó [5], [30], [33].
Theo công bố mới nhất, hiệu suất chủng đột biến của xạ khuẩn S. orientalis
(nhận đƣợc nhờ xử lý bằng tia UV) đạt 11,5 g/l sau 120 giờ lên men. Tuy nhiên hiện nay, sản xuất vancomyxin ở quy mô công nghiệp hiệu suất còn thấp, chỉ đạt 3,7 g/l, làm cho giá thành của CKS này khá cao, gấp 10 đến 20 lần so với các thuốc kháng sinh nhóm penixilin hoặc cephalosporin [30]. Để giải quyết vấn đề này, cần nghiên cứu tạo chủng sản có hoạt tính vancomyxin cao, tối ƣu điều kiện nuôi cấy bao gồm thành phần môi trƣờng, pH, nhiệt độ... Rất nhiều nghiên cứu về các yếu tố này đã đƣợc tiến hành trong điều kiện lên men theo mẻ hoặc lên men liên tục, lên men sử dụng sinh khối tái sinh hoặc tế bào cố định [41], [42].
Ngày nay, cùng với việc tổng hợp bằng con đƣờng sinh học ngƣời ta đã nghiên cứu sản xuất thành công dẫn xuất của vancomyxin bằng con đƣờng hoá học và bán tổng hợp. Các sản phẩm vancomyxin bán tổng hợp đƣợc tạo ra bởi việc gắn
31
thêm các gốc nhƣ đƣờng… để nâng cao hoạt tính và phổ tác dụng điều trị. Đây cũng là hƣớng trong tƣơng lai để sản xuất các sản phẩm vancomyxin.
Vancomyxin có trong Danh mục thuốc thiết yếu Việt Nam ban hành lần thứ 5 năm 2005. Ở nƣớc ta đang có nhu cầu sử dụng vancomyxin và giá bán khá cao là 180 nghìn đồng/1g. Do đó, Tổng Công ty Dƣợc Việt Nam đặt yêu cầu nghiên cứu sản xuất kháng sinh này ở quy mô nhỏ, từ 500 đến 1000 kg/năm. Đã có nhiều đề tài nghiên cứu tiếp cận đến việc sản xuất kháng sinh ở Việt Nam, trong đó đáng lƣu ý đến các công trình nghiên cứu sản xuất dekamyxin (neomyxin), oxytetraxyclin (Trƣờng Đại học Dƣợc HN), các vi sinh vật đối kháng và kháng sinh phục vụ chăn nuôi và bảo vệ thực vật (Viện Công nghệ sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Sƣ phạm HN...). Gần đây, có những nghiên cứu sản xuất các kháng sinh bán tổng hợp từ penixilin và cephalosporin [1]. Tuy nhiên, những nghiên cứu này chƣa tiếp cận đƣợc đến công nghiệp sản xuất. Một yếu tố quan trọng trong sản xuất kháng sinh là hiệu suất chủng giống, nguồn nguyên liệu môi trƣờng và điều kiện lên men thích hợp. Nếu có đầu tƣ nhƣng chủng giống có hiệu suất thấp thì cũng không thể cạnh tranh sản xuất trong tình hình hiện nay. Do vậy, muốn đầu tƣ sản xuất ở Việt Nam, chúng ta cần nghiên cứu xem kháng sinh nào phù hợp yêu cầu của thị trƣờng. Đặc biệt là sản xuất phải đảm bảo chất lƣợng và phải có lãi. Kháng sinh vancomyxin đáp ứng đƣợc các yêu cầu đó. Cho đến nay trong nƣớc chƣa có nghiên cứu nào liên quan đến sản xuất kháng sinh này. Mặc dù vancomyxin không đƣợc sử dụng nhiều nhƣ penixilin hay cephalosporin, nhƣng đây lại là một KS quan trọng, thƣờng đƣợc lựa chọn để điều trị VSV gây bệnh kháng lại các KS thông dụng. Nghiên cứu tạo chủng giống có HTKS cao, xây dựng quy trình sản xuất vancomyxin sử dụng nguồn nguyên liệu chính sẵn có trong nƣớc, phù hợp với điều kiện Việt Nam là công việc cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao. Hơn nữa, nghiên cứu lên men vancomyxin và nắm vững quy trình sản xuất CKS này còn tạo tiền đề cho việc xây dựng cơ sở sản xuất các CKS ở quy mô công nghiệp trong điều kiện Việt Nam, góp phần thực hiện mục tiêu tới năm 2020 sản xuất đƣợc 50% tổng số thuốc, do Bộ Y tế đề ra.
32
CHƢƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Chủng giống vi sinh vật
- Chủng S. orientalis 4912 là chủng xạ khuẩn dại, đƣợc phòng Công nghệ lên men mua từ Công ty TG Biotech thuộc Trƣờng Đại học Kyungpook Hàn Quốc (Kyungpook National University - gọi tắt là KNU).
- Các chủng vi sinh kiểm định Bacillus subtilis ATCC 6633, B. cereus
ATCC 21778, Sarcina lutea M5, Staphylococcus aureus 209P do Tổng cục 5, Bộ Công an cung cấp và đƣợc đƣa vào Bộ sƣu tập chủng giống của phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học.
- Chủng Escherichia coli PA2 do Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học phân lập và tuyển chọn vào Bộ sƣu tập chủng giống của phòng.
2.1.2. Hóa chất
Cao nấm men Việt Nam
Cao thịt Merck (Đức )
Bột đậu tƣơng, khô đậu tƣơng Việt Nam
Pepton Trung Quốc
NaCl, CaCO3 Việt Nam
Đƣờng kính, Tinh bột tan Việt Nam
Sacaroza, glucoza dùng trong lên men Việt Nam
Các loại đƣờng: glucoza, mannoza, galactoza... Merck (Đức ) Các loại muối khoáng dùng trong lên men: CaCl2, CuSO4… Việt Nam N-metyl-N‟-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) Fluka (Thụy Sỹ) Vancomyxin HCl (dạng đông khô), (Abbott Laboratories,
North Chicago, IL 60064, USA; LOT 015873A)
(Abbott) Mỹ
Vancomyxin HCl (dạng đông khô), Cat. No. 627850 Merck (Đức )
2.1.3. Thiết bị
33
Máy lắc Nhật bản
Tủ cấy vô trùng Pháp
Nồi hấp thanh trùng Đức
Kính hiển vi Olympus Nhật Bản
Cân điện tử Mettler Toledo Thụy Sỹ
Máy đo pH Mettler Toledo Thụy Sỹ
Thiết bị lên men Bioflo 110 (New Brunswick Scientific) Mỹ
Máy đo OD: SP-300 Optima Anh
Máy phá tế bào bằng siêu âm (Sonic) Mỹ
2.1.4. Môi trƣờng
- MT Gauze 1(g/l): Tinh bột tan 20; K2HPO4 0,5; MgSO4 0,5; KNO3 0,5; NaCl 0,5; FeSO4 0,01; thạch 20; nƣớc cất 1 lít; pH = 7,2-7,4.
- MT Gauze 2 (g/l): Cao thịt 0,5; pepton 5; NaCl 5; glucoza 10; thạch 20; nƣớc cất 1 lít; pH = 7,0-7,2.
- MT 48 (g/l): Cao nấm men 3; tinh bột tan 10; thạch 20; nƣớc cất 1 lít; pH = 7, - MT ISP 1 (g/l): Trypton 5; cao nấm men 3; thạch 20; nƣớc cất 1 lít; pH = 7,0-7,2. - MT ISP 2 (g/l): Cao nấm men 4; cao malt 10; dextroza 4; nƣớc cất 1 lít; thạch 20; pH = 7,3.
- MT ISP 4 (g/l): Tinh bột tan 10; K2HPO4 1; MgSO4.7H2O 1; NaCl 1; (NH4)2SO4 2; CaCO3 2; nƣớc cất 1 lít; dung dịch A 1ml; thạch 20; pH = 7,2-7,4. Dung dịch muối A (%): FeSO4 0,1; MnCl2 0,1; ZnSO4 0,1; nƣớc cất 100 ml.
- MT ISP 8 (g/l): Pepton 1; NaCl 0,5; KNO3 1; nƣớc cất 1 lít; pH = 7,0.
- MT ISP 9 (g/l): (NH4)2SO4 2,64; K2HPO4 5,65; KH2PO4 2,38; MgSO4 1; dung dịch B 1 ml; nguồn cacbon 10; thạch đã rửa 20-25; nƣớc cất 1 lít; pH = 6,8-7,0.
Dung dịch muối B (%): CuSO4 0,64; FeSO4 0,11; MgCl2 0,79; nƣớc cất 100 ml. - MT 1 (g/l): Glucoza 15; bột đậu tƣơng 15; pepton 3; NaCl 2,5; CaCO3 2; nƣớc cất 1 lít; pH = 6,5-7,0.
- MT 2 (g/l): Rỉ đƣờng 20; pepton 5; glucoza 10; sacaroza 20; CaCO3 2; nƣớc cất 1 lít; pH = 6,5-7,0.
34
- MT 3 (g/l): Glucoza 15; bột đậu tƣơng 15; pepton 3; NaCl 2,5; CaCO3 2; nƣớc cất 1 lít; pH = 6,5-7,0.
- MT 4 (g/l): Glucoza 15; khô đậu tƣơng 15; cao ngô 5; NaCl 2,5; CaCO3 2; nƣớc cất 1 lít; pH = 6,5-7,0.
- MT 5 (g/l): Glucoza 15; khô đậu tƣơng 15; pepton 5; NaCl 2,5; CaCO3 2; nƣớc cất 1 lít; pH = 6,5-7,0.
- MT 6 (g/l): Tinh bột tan 10; pepton 6; NH4Cl 2,5; CaCO3 2; nƣớc cất 1 lít; pH = 6,5-7,0.
- MT 7 (g/l): Tinh bột tan 10; glucoza 5; pepton 6; (NH4)SO4 2,5; CaCO3 2; nƣớc cất 1 lít; pH = 6,5-7,0.
- MT 8 (g/l): Tinh bột tan 10; sacaroza 10; pepton 6; NH4Cl 2,5; CaCO3 2; nƣớc cất 1 lít; pH = 6,5-7,0.
- MT 9 (g/l): Rỉ đƣờng 20; glucoza 10; pepton 4; CaCO3 2; nƣớc cất 1 lít; pH = 7,0- 7,2.
- MT 10 (g/l): Rỉ đƣờng 20; pepton 4; glucoza 5; sacaroza 5; nƣớc cất 1 lít; pH = 7,0-7,2.
- MT 11 (g/l): Glucoza 10; rỉ đƣờng 20; cao nấm men 2; NaCl 2,5; CaCO3 2; nƣớc cất 1 lít; pH = 7,0- 7,2.
- MT 79 (g/l): glucoza 10; pepton 10; cazein thuỷ phân 2; cao nấm men 2; NaCl 6; K2HPO4 0,2; thạch 20; nƣớc cất 1 lít; pH = 7,2-7,4.
- MT khoai tây (g/l) : khoai tây 200 ; thạch 20 ; nƣớc cất 1lít ; pH = 7,0-7,2.
- MT A-4 (g/l): Glucoza 10; bột đậu tƣơng 10; NaCl 5; CaCO3 1; nƣớc cất 1 lít; pH = 7,0.
- MT A-4H (g/l): Glucoza 15; bột đậu tƣơng 15; NaCl 5; CaCO3 1; nƣớc cất 1 lít; pH = 7,0.
- MT A-9 (g/l): Glucoza 10; rỉ đƣờng 20; pepton 5; nƣớc cất 1 lít; pH = 7,0.
- MT A-12 (g/l): Tinh bột tan 10; rỉ đƣờng 10; bột đậu tƣơng 10; K2HPO4 2; NaCl 5; CaCO3 1; nƣớc cất 1 lít; pH = 7,0.
35
- MT TH4- 47 (g/l): Tinh bột tan 15; glucoza 10; lactoza 30; bột đậu tƣơng 30; (NH4)SO4 5; CaCO3 5; nƣớc cất 1 lít; pH = 7,0.
- MT YEME (g/l): Cao nấm men 3; pepton 5; cao malt 3; glucoza 10; sacaroza 340; sau khi khử trùng thêm MgCl2 .6H2O (2,5M): 2ml/l; pH = 7,2.
- MT R2YE (g/l): Sacaroza 103; K2SO4 0,25; MgCl2 .6H2O 10,12; glucoza 10; Casaminoaxit 0,1; dungdịch vi lƣợng 2ml; cao nấm men 5; TES 5,73; nƣớc cất 0,964 lít; sau khi khử trùng thêm KH2PO4 (0,5%) 10ml; CaCl2.2H2O (5M) 4ml; NaOH (1N) 7ml; L-prolin (20%) 15ml; pH = 7,2. 2.1.5. Các dung dịch đệm Đệm P: - sacaroza: 103g - K2SO4: 0,25g - MgCl2. 6H2O: 2,02 g - Dung dịch vi lƣợng: 2ml - Nƣớc cất tới 800ml
Khi sử dụng thêm các dung dịch :
KH2PO4 (0,5%): 10ml; CaCl2.2H2O (3,68%): 100ml; TES (5,73%; pH = 7,2): 100ml Dung dịch vi lƣợng (mg/l): - ZnCl2: 40 - FeCl3. 6H2O: 200 - CuCl2. 2H2O: 10 - MnCl2. 4H2O: 10 - Na2B4O7. 10H2O: 10 - (NH4)6Mo7O24. 4H2O: 10 Đệm TM 0,05M; pH = 8: - Tris: 0,05M - Maleic axit: 0,05M
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Bảo quản giống
Chủng xạ khuẩn S. orientalis 4912 đƣợc giữ trong MT 48 thạch nghiêng, ở nhiệt độ 4oC và cấy chuyền lại hàng tháng. Giống sử dụng trong các nghiên cứu đƣợc hoạt hoá bằng cách nuôi trên MT 48 thạch nghiêng, ở nhiệt độ 28oC, kéo dài 5-7 ngày. Để bảo quản chủng lâu dài, giữ giống trong glyxerin ở -20 oC hoặc -70 đến -80 oC [2].
36
2.2.2. Xác định đặc điểm sinh học
Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng S. orientalis 4912 theo các phƣơng pháp của Đề án xạ khuẩn quốc tế (ISP - International Streptomyces Project) và Bergey‟s Manual of Determintative Bacteriology, Vol. 4, 1989 [11], [19], [55], [66], [67], [68].
2.2.2.1. Đặc điểm hình thái
Xạ khuẩn đƣợc nuôi trên MT Gauze 1 có cắm lamen nghiêng trên mặt MT, ở nhiệt độ 28-30oC. Sau 7-14 ngày, quan sát khuẩn ty và hình dạng cuống sinh bào tử trên lamen bằng kính hiển vi quang học.
Bề mặt bào tử: Dùng lƣới đồng có phủ lớp collodion đặt trực tiếp lên bề mặt khuẩn ty khí sinh có bào tử, quan sát và chụp ảnh dƣới kính hiển vi điện tử (tại Viện 69, Bộ tƣ lệnh Bảo vệ Lăng, Bộ Quốc phòng).
2.2.2.2. Đặc điểm nuôi cấy
Chủng S. orientalis 4912 đƣợc nuôi trên các MT Gauze 1, Gauze 2, 48, ISP1, ISP2, ISP4, ISP6, ISP8, ISP9, 79 và khoai tây ở 28-30oC. Sau 7, 14 và 21 ngày, quan sát khuẩn lạc, màu sắc của khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và sắc tố tiết ra MT theo phƣơng pháp của Tresner và Backus [61].
Sự hình thành sắc tố melanin: Xạ khuẩn đƣợc nuôi trên MT ISP-6 ở 28 và 37oC, quan sát màu của MT sau 24 giờ đến ngày thứ 14.
2.2.3. Xác định sinh khối
MT nuôi xạ khuẩn sau khi thu hồi đƣợc lọc bằng giấy lọc, rửa lại bằng nƣớc cất vô trùng. Lƣợng sinh khối có trên giấy lọc đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sấy khô ở nhiệt độ 105oC đến khi trọng lƣợng không đổi (sấy và cân giấy lọc trƣớc và sau khi lọc) [2].
2.2.4. Xác định hoạt tính kháng sinh
Phương pháp cục thạch
Chủng xạ khuẩn S. orientalis 4912 đƣợc nuôi trên MT thạch trong đĩa Petri ở 28-30oC. Sau 4-5 ngày dùng khoan nút chai đục các thỏi thạch chuyển sang đĩa khác có MT MPA thạch đã cấy vi sinh vật kiểm định. Đặt đĩa Petri ở 4-5o
37
6 giờ cho chất kháng sinh khuếch tán vào MT, sau đó đem nuôi ở tủ ấm 37oC trong 24 giờ để vi sinh vật kiểm định phát triển. Hoạt tính kháng sinh đƣợc xác định bằng đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) xung quanh cục thạch, vòng càng lớn thì hoạt tính kháng sinh càng mạnh [2].
Phương pháp đục lỗthạch
Phƣơng pháp đục lỗ đƣợc sử dụng để xác định hoạt tính kháng sinh có chứa trong MT lỏng. Dùng thiết bị đục lỗ, đục trên MT thạch đã cấy vi sinh vật kiểm định, nhỏ vào lỗ dung dịch cần thử. Các bƣớc tiếp theo làm nhƣ phƣơng pháp cục thạch. Hoạt tính kháng sinh đƣợc xác định bằng đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) xuất hiện xung quanh lỗ đã nhỏ dịch [2].
Phương pháp khoanh giấy lọc
Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng để xác định hoạt tính kháng sinh trong dung môi. Các khoanh giấy lọc có đƣờng kính 6 mm đƣợc tẩm một lƣợng dịch kháng sinh (thƣờng là 1ml/10 khoanh giấy lọc). Sau đó sấy khô ở 40oC. Đặt khoanh giấy lọc đã tẩm dịch kháng sinh trên MT thạch đã cấy vi sinh vật kiểm định, các bƣớc tiếp theo giống phƣơng pháp cục thạch [2].
Phương pháp định lượng kháng sinh
Định lƣợng chất kháng sinh bằng phƣơng pháp vi sinh vật học theo Dmitrieva [2]. Nồng độ dung dịch chất kháng sinh chuẩn và chất kháng sinh nghiên cứu đƣợc định lƣợng theo phƣơng pháp đục lỗ, vòng vô khuẩn càng gần 17 mm càng chính xác, chất kháng sinh chuẩn đƣợc pha loãng theo hệ số 2. Tính hiệu số vòng vô khuẩn giữa hai nồng độ liền kề và tra bảng của Dmitrieva tìm hiệu số chỉnh, sau đó nhân với hiệu số pha loãng và nồng độ kháng sinh chuẩn sẽ đƣợc nồng độ chất kháng sinh nghiên cứu (mcg/ml).
2.2.5. Phƣơng pháp lên men
2.2.5.1. Nhân giống
Từ ống nghiệm giữ giống, chủng S. orientalis 4912 đƣợc cấy chuyển sang ống nghiệm chứa MT thạch nghiêng, nuôi 4-5 ngày. Tiếp theo cấy giống vào bình tam giác, nuôi trên máy lắc (220 vòng/phút), ở nhiệt độ 28o
38
Sau đó xạ khuẩn đƣợc chuyển sang bình tam giác khác để nhân giống cấp 2 trong 36 giờ, trƣớc khi tiếp vào thiết bị lên men Bioflo [38], [48]. Lựa chọn cấp nhân giống nào là tùy thuộc vào khối lƣợng cần lên men.
2.2.5.2. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp
Chủng S. orientalis 4912 đƣợc nuôi trên các MT lên men từ MT1 đến MT12 [40] và Gauze1 [2], A-4, A-4H, TH4-47, A-12, A-9 [63] và 48 [70], là các MT đặc trƣng cho nghiên cứu xạ khuẩn. Sau 120 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 28oC, xác định hoạt tính kháng sinh và sinh khối. Trên MT nào xạ khuẩn sinh trƣởng tốt, tích lũy nhiều sinh khối sẽ chọn làm MT nhân giống. MT nào xạ khuẩn tích lũy chất kháng sinh cao nhất sẽ đƣợc lựa chọn làm MT lên men.
2.2.5.3. Xác định điều kiện lên men sinh tổng hợp kháng sinh
Quá trình lên men chủng 4912 đƣợc tiến hành trong bình tam giác dung tích 500 ml trên máy lắc tốc độ 220 vòng/phút, với MT lên men đã lựa chọn ở trên. Các