biến dùng tia UV và N-metyl-N’-nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG)
3.3.2.1. Xác định tỷ lệ sống sót của chủng S. orientalis 4912 sau khi chiếu tia UV và xử lý bằng MNNG
Để xây dựng đƣờng cong sống sót khi xử lý với tia UV, dịch bào tử và TBT đƣợc xử lý với khoảng cách 20 cm. Sau thời gian xử lý từ 0 - 80 giây, cấy lên đĩa thạch MT 48 (với bào tử) và R2YE (với TBT), nuôi trong tủ ấm ở 28-30oC trong 5 ngày. Đồ thị sống sót của tế bào trần và bào tử chủng S. orientalis 4912 sau khi gây đột biến cho thấy (Hình 3.8), thời gian chiếu UV càng lâu thì tỷ lệ sống sót càng giảm. Thời gian chiếu là 30 giây, tỷ lệ bào tử sống sót là 26,8% và TBT là 12,6%. Thời gian chiếu là 40 giây tỷ lệ sống sót của bào tử còn 10,10% và tế bào trần là 8,6%; thời gian chiếu 50 và 60 giây tỷ lệ TBT sống sót là 3,2% và 0,03%; bào tử là 4,22 và 0,1%. Thời gian chiếu là 70 giây số cá thể sống không tồn tại. Rõ ràng khả năng tác động của tia UV lên tế bào trần của chủng 4912 mạnh hơn lên bào tử. Điều này phù hợp với quy luật tự nhiên.
Hình 3.8. Khả năng sống sót của tế bào sau siêu âm, tế bào trần và bào tử của chủng 4912 sau khi xử lý UV và MNNG
52
Bên cạnh việc sử dụng tác nhân vật lý là tia UV, tế bào sau khi phá bằng siêu âm, BT và TBT của chủng 4912 còn đƣợc xử lý với MNNG. MNNG là hóa chất đƣợc dùng phổ biến trong các thí nghiệm gây đột biến tế bào vi sinh vật. Để tìm điều kiện thích hợp cho quá trình gây đột biến, tế bào sau siêu âm, TBT và BT của chủng 4912 đƣợc xử lý với MNNG ở các nồng độ từ 0-3 mg/ml và pH 6-9 trong thời gian 0-80 phút (Bảng 3.5, 3.6 và 3.7).
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của nồng độ MNNG tới khả năng sống sót của chủng S. orientalis 4912 Nồng độ MNNG (mg/ml) Tỷ lệ sống sót của BT (%) Tỷ lệ sống sót của TBT (%) Tỷ lệ sống sót của tế bào sau siêu âm (%)
0 100 100 100 0,01 100 65 88 0,05 98 33 64 0,1 78,7 23,3 58 0,3 47 3,19 22 0,5 23 0,11 15,2 1,0 10,9 0,03 8,05 1,5 0,7 0 0,06 2,0 0 0 0 3,0 0 0 0
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của pH khi xử lý bằng MNNG tới khả năng sống sót của chủng S. orientalis 4912 pH Tỷ lệ sống sót của BT (%) Tỷ lệ sống sót của TBT (%) Tỷ lệ sống sót của tế bào sau siêu âm (%)
8 (Đối chứng) 100 100 100
6 22,2 34 29,4
7 20,9 31 26
8 10,9 3,19 12,7
53
Kết quả ghi ở các bảng 3.5, 3.6 và 3.7 cho thấy, TBT của chủng 4912 mẫn cảm với MNNG hơn bào tử rất nhiều, điều này cũng phù hợp với quy luật tự nhiên và kết quả của nhiều nghiên cứu trên thế giới. Theo Kim và cộng sự (1983), tỷ lệ sống sót của BT xạ khuẩn M. rosaria sau khi xử lý với MNNG có nồng độ 0,5 mg/ml trong thời gian 20 phút là 10% trong khi tỷ lệ sống sót của TBT khi xử lý MNNG ở nồng độ 0,1 mg/ml trong cùng thời gian 20 phút là 11% [32].
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của thời gian xử lý bằng MNNG tới khả năng sống sót của chủng S. orientalis 4912 Thời gian (Phút) Tỷ lệ sống sót của BT (%) Tỷ lệ sống sót của TBT (%) Tỷ lệ sống sót của tế bào sau siêu âm (%)
0 100 100 100 10 68 20,75 80 20 51,4 16,38 72,5 30 22 7,8 30,2 40 10,9 3,19 12,8 50 3,8 0,82 4,1 60 2,9 0,15 2,5 70 0,19 0 0,53 80 0 0 0
Khi xử lý BT và TBT của chủng 4912 với MNNG ở các nồng độ khác nhau tại pH 8 trong thời gian 40 phút thì thấy ở nồng độ 1 mg/ml tỷ lệ sống sót của BT là 10,9 %. Ở các nồng độ MNNG thấp hơn 1 mg/ml tỷ lệ sống sót của BT cao trên 20 %, ở các nồng độ cao hơn 1 mg/ml tỷ lệ sống sót của BT quá thấp, dƣới 1 %, nhƣ vậy sẽ không thu đƣợc các đột biến có ý nghĩa. Từ đó lựa chọn nồng độ MNNG cho tỷ lệ sống sót gần 10% nhất cho nghiên cứu tiếp theo để tìm pH và thời gian xử lý MNNG thích hợp. Tƣơng tự, lựa chọn nồng độ MNNG xử lý TBT là 0,3 mg/ml cho nghiên cứu tiếp theo. Từ kết quả ở bảng 3.6 và 3.7, chọn đƣợc pH và thời gian xử lý MNNG cho tỷ lệ sống sót nằm trong khoảng 1-10% là pH 8 và 50-60 phút đối với bào tử (tỷ lệ sống sót là 3,8 và 2,9 %); 30-40 phút đối với TBT (tỷ lệ sống sót là 7,8
54
và 3,19 %), với tế bào siêu âm là pH 8 và 40 – 50 phút (tỷ lệ sống sót là 12,8 và 4,1 %).
Theo tài liệu đã công bố, tỷ lệ sống sót từ 1 -10 % sẽ cho xác suất chủng bị đột biến cao nhất 32. Dựa vào đồ thị sống sót của chủng S. orientalis 4912 đƣợc trình bày trên hình 3.8, các khuẩn lạc mọc sau thời gian chiếu UV là 40 đến 50 giây, các khuẩn lạc phục hồi sau khi xử lý MNNG trong 50-60 phút đối với bào tử và 30-40 phút đối với TBT, đối với tế bào siêu âm là 40 -50 phút đƣợc lựa chọn để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo về hình thái khuẩn lạc cũng nhƣ sự tổng hợp CKS.
3.3.2.2. Sự biến động hình thái và HTKS của chủng S. orientalis 4912 sau đột biến
Chủng gốc có đặc điểm: khuẩn lạc có kích thƣớc 3-4 mm, bề mặt khuẩn lạc khô, xù xì, xẻ thùy và đƣợc che phủ bởi nhiều lớp mỏng KTKS màu trắng, KTCC có màu vàng nhạt sau 7 ngày nuôi, chuyển sang màu vàng sẫm sau 14 ngày nuôi.
Tiến hành gây đột biến liên tiếp nhiều lần thu đƣợc 645 khuẩn lạc mọc riêng rẽ với hình thái biến đổi. Sự phân ly màu sắc của các khuẩn lạc của chủng S. orientalis 4912 sau khi xử lý UVvà MNNG đƣợc thể hiện ở bảng 3.8, hình 3.9. Kết quả thí nghiệm cho thấy, sau khi xử lý UV và MNNG, tế bào siêu âm, chủng S. orientalis 4912 phân ly thành 8 typ theo hình dạng và màu sắc của khuẩn lạc. Trong đó typ 2 nhiều nhất chiếm 40,07% sau đó là typ 6 chiếm 20,5 % và typ 5 là 18,3 %. Điều này đã khẳng định tác động của tia UV và MNNG đến quá trình hình thành sắc tố cũng nhƣ hình dạng khuẩn lạc so với chủng ban đầu.
Hình 3.9. Hình dạng khuẩn lạc của chủng S. orientalis 4912 sau khi chiếu tia UV tế bào trần
55
Bảng 3.8. Sự biến đổi hình thái khuẩn lạc của chủng S. orientalis 4912 sau khi xử lý UV và MNNG
Dạng
khuẩn lạc KTCC KTKS Thùy Mấu Tỷ lệ %
1 Vàng (Y-2fb) Vàng (Y-2fb) Có Không 1,97
2 Vàng (Y-2fb) Trắng (W-1a) Không Có 40,07
3 Vàng (Y-2fb) Xám (GY-2dc) Có Không 5,52
4 Vàng (Y-2fb) Viền (W-1a)
TrongVàng (Y-1ba) Có Không 8,2
5 Vàng (Y-2fb) Viền trắng (W-1a)
Mấu vàng(Y-2ba) Không Có 18,3
6 Vàng (Y-2fb) Vàng (Y-1ba) Có Không 20,5
7 Trắng (W-1a) Trắng (W-1a) Không Có 3,6
8 Xám (GY-2dc) Xám (GY-2dc)
Viền trắng(W-1a) Có Có 1,84
Ghi chú: Y: yellow (vàng); W: white (trắng); GY: gray (xám); 1a: trắng; 2dc: xám tự nhiên; 1ba: vàng ánh xà cừ; 2ba: vàng ánh ngọc trai; 2fb: vàng rơm
Kết quả thu đƣợc cho thấy, khi xử lý bào tử với tia UV tỷ lệ chủng có HTKS cao hơn chủng gốc là 45,6 %; khi xử lý TBT với UV tỷ lệ này là 81,1 %; khi dùng chất gây đột biến MNNG để xử lý bào tử và TBT thì tỷ lệ chủng có HTKS cao hơn chủng gốc là 80,8 và 92,86 %, đối với tế bào siêu âm thì hoạt tính cao hơn là 55,5%. Điều này cho thấy ảnh hƣởng tích cực của việc gây đột biến chủng S. orientalis
4912 để lựa chọn các biến chủng có hoạt tính cao. Rõ ràng là các tác nhân gây đột biến có tác động lên TBT mạnh hơn lên bào tử, và chất gây đột biến MNNG có tác động mạnh hơn tia UV. Điều này cũng phù hợp với qui luật tự nhiên và công bố của nhiều công trình nghiên cứu [32]. Để xác định chính xác biến chủng có HTKS cao nhất, 6 biến chủng dƣơng tính thuộc nhóm 11 và 12 (nhận đƣợc sau khi gây đột biến bằng MNNG), các biến chủng có ĐKVVK cao nhất sau khi chiếu tia UV lên TBT (2 biến chủng) và bào tử (4 biến chủng), đột biến tế bào siêu âm bằng MNNG, đƣợc kiểm tra HTKS bằng phƣơng pháp lên men chìm trên MT 48 cùng với các đối chứng (4912 và 4912-81). HTKS đƣợc xác định theo phƣơng pháp Dmitrieva, kết quả đƣợc trình bày trên bảng 3.9 và hình 3.10.
56
Hình 3.10. HTKS của biến chủng nhận đƣợc sau khi gây đột biến tế bào trần
Bốn biến chủng nhận đƣợc sau khi chiếu tia UV lên bào tử có ký hiệu là 4912- 81-327; 4912-81-333; 4912-81-340; 4912-81-345 và hai biến chủng nhận đƣợc sau khi chiếu tia UV lên TBT có ký hiệu là 4912-81-11; 4912-81-27. Các biến chủng nhận đƣợc sau khi gây đột biến bằng MNNG ký hiệu là 4912-81-71; 4912-81-22 (từ bào tử) và 4912-81-37; 4912-81-17; 4912-81-42; 4912-81-61 (từ TBT). Các biến chủng nhận đƣợc khi đột biến tế bào siêu âm bằng MNNG là 4912-81-454; 4912- 81-482
Bảng 3.9. Kết quả lên men các biến chủng sau khi đột biến
Chủng xạ khuẩn HTKS (mcg/ml) Chủng xạ khuẩn HTKS (mcg/ml) ĐC-1 (chủng 4912) 866 4912-81-11 1186 ĐC-2 (chủng 4912-81) 974 4912-81-27 1201 4912-81-327 986 4912-81-71 1349 4912-81-333 999 4912-81-22 1351 4918-81-340 986 4912-81-37 1499 4912-81-345 1130 4912-81-17 1504 4912-81-454 1343 4912-81-42 1512 4912-81-482 1195 4912-81-61 1683
Số liệu trên bảng 3.9 cho thấy rằng, HTKS của chủng 4912 gốc đạt 866 mcg/ml, chủng 4912-81 đạt 974 mcg/ml. Trong số 4 biến chủng thu đƣợc sau khi chiếu tia UV lên bào tử, biến chủng S. orientalis 4912-81-345 có HTKS cao nhất đạt 1130 mcg/ml, cao hơn chủng gốc 30,4 %. Biến chủng nhận đƣợc từ phƣơng pháp chiếu tia UV lên TBT có HTKS cao nhất là 4912-81-27, đạt 1201 mcg/ml, cao
57
hơn chủng gốc 38,7 %. Khi gây đột biến bằng MNNG tế bào sau siêu âm nhận đƣợc biến chủng có HTKS lớn nhất là 4912-81-454, đạt 1343 mcg/ml cao hơn chủng gốc là 55% . Khi gây đột biến bào tử bằng MNNG, nhận đƣợc biến chủng có HTKS lớn nhất là 4912-81-22, đạt 1351 mcg/ml, cao hơn chủng gốc 56 %. Trong số 6 biến chủng dƣơng tính, biến chủng 4912-81-61 có HTKS cao nhất, đạt 1683 mcg/ml. Đây cũng là biến chủng có ĐKVVK lớn nhất theo phƣơng pháp cục thạch ở trên. Sau khi gây đột biến TBT chủng S. orientalis 4912 bằng MNNG, biến chủng 4912- 81-61 có HTKS cao nhất, hơn chủng gốc 94,3 %, đã đƣợc chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.4. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BIẾN CHỦNG Streptomyces orientalis 4912-81-61
Biến chủng S. orientalis 4912-81-61 (sau này gọi tắt là chủng 61) nhận đƣợc sau khi gây đột biến TBT chủng xạ khuẩn S. orientalis 4912 bằng hóa chất MNNG, có HTKS cao hơn chủng gốc. Để thuận lợi cho nghiên cứu tối ƣu quá trình lên men, nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp vancomyxin từ biến chủng này, cần nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của biến chủng, phƣơng pháp nghiên cứu tƣơng tự nhƣ đối với chủng gốc 4912.
Kết quả trên bảng 3.10 cho thấy, biến chủng 61 có đặc điểm sinh học tƣơng tự chủng gốc 4912, chỉ có sự khác nhau về hình thái khuẩn lạc (Hình 3.11). Khi nuôi trên MT 48, hai chủng phát triển tốt, khuẩn lạc của chủng 61 có đƣờng kính lớn hơn chủng 4912, bề mặt khuẩn lạc nhìn thoáng qua có vẻ nhẵn do khuẩn ty khí sinh bện chặt. Trong khi đó, bề mặt khuẩn lạc của chủng 4912 đƣợc che phủ bởi nhiều lớp khuẩn ty màu trắng nên có vẻ xốp hơn.
A B
Hình 3.11. Khuẩn lạc của biến chủng S. orientalis 4912-81-61 (A) và chủng S. orientalis 4912 (B)
58
Chủng 61 có khả năng ức chế các vi sinh vật kiểm định nhƣ Bacillus subtilis
ATCC 6633, B. cereus ATCC 21778, Sarcina lutea M5 và Staphylococcus aureus
209P và Escherichia coli PA2, nhƣng ở mức độ mạnh hơn so với chủng 4912 do có HTKS cao hơn chủng gốc. Giống nhƣ chủng 4912, chủng 61 cũng sử dụng tốt các nguồn đƣờng thông dụng nhƣ glucoza, sacaroza, fructoza, lactoza, maltoza….. Ngoài ra chủng 61 còn có khả năng sinh ra các enzym thủy phân tinh bột, cazein, gelatin, pepton hóa sữa nên sẽ thuận lợi cho việc lựa chọn các nguồn dinh dƣỡng khi lên men sản xuất vancomyxin trong điều kiện Việt Nam.
Bảng 3.10. Một số đặc điểm sinh học của biến chủng S. orientalis 4912-81-61 Các chỉ tiêu Chủng 61 Chủng 4912
Khuẩn lạc trên MT 48 Tròn, đƣờng kính 6- 8mm, không xẻ thùy, bề mặt khô, có mấu lồi ở trung tâm
Tròn, bề mặt xù xì, khô và nhăn nheo tạo thành các nếp gấp, có mấu lồi ở trung tâm, có các vết nứt màu nâu nhạt, đƣờng kính 3-5mm KTKS Màu trắng, dạng sợi mảnh phân nhánh, bện chặt làm bề mặt khuẩn lạc nhƣ màng dẻo Màu trắng, dạng sợi mảnh phân nhánh KTCC Màu trắng Vàng nhạt Tạo bào tử Có Có Sử dụng glucoza, sacaroza Có Có
Phân giải xenluloza Không Không
Phân giải cazein Có Có
Phân giải gelatin Có Có
Khả năng pepton hoá sữa Có Có
Thuỷ phân tinh bột Có Có
Hình thành melanin Không Không
Nhiệt độ tối ƣu cho sinh trƣởng (oC)
28 - 30 28 - 30
pH tối ƣu cho sinh trƣởng 6 - 8 6 - 8
59
3.5. TỐI ƢU HÓA QUY TRÌNH LÊN MEN BIẾN CHỦNG Streptomyces orientalis 4912- 81- 61
Các bƣớc tiến hành nhƣ đối với chủng S. orientalis 4912 gốc. Kết quả nhận đƣợc nhƣ sau:
3.5.1. Lựa chọn môi trƣờng nhân giống
Nuôi chủng 61 trên một số MT nhƣ đã thí nghiệm với chủng 4912: Gauze 1; A-4; A-4H; TH4-47; A-12; A-9 và 48 trong bình tam giác 500 ml trên máy lắc tốc độ 220 vòng/phút, kéo dài 120 giờ, ở 28oC, thể tích MT là 75 ml. Kết quả trên bảng 3.25 cho thấy, chủng 61 cũng phát triển tốt nhất trên MT 48, sinh khối khô đạt 6,0 mg/ml. Thành phần MT 48 đơn giản chỉ gồm cao nấm men (Việt Nam) và tinh bột tan, hai nguồn này rẻ tiền và rất sẵn có tại thị trƣờng trong nƣớc, do vậy MT 48 đƣợc chọn làm MT nhân giống.
Bảng 3.11. Khả năng sinh trƣởngcủa biến chủng S. orientalis 4912 -81-61 trên một số MT
MT Gauze 1 Gauze 2 A 4 A- 4H TH4- 47 A 12 A 9 48
Sinh trƣởng
(SKK, mg/ml) 5,6 5,5 4,0 4,3 4,7 4,5 5,3 6,0