metyl-N’-nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG)
2.2.8.1. Gây đột biến bằng tia UV
Để thu đƣợc bào tử cho xử lý UV, chủng S. orientalis 4912 đƣợc nuôi trong ống nghiệm chứa MT 48 thạch nghiêng 8-10 ngày. Nhỏ nƣớc cất vô trùng theo mặt thạch và lọc qua dụng cụ lọc để lấy bào tử. Lấy 1ml dịch lọc cho vào 9 ml nƣớc cất hoặc nƣớc muối sinh lý đã khử trùng đƣợc dịch bào tử có độ pha loãng 10-1 tiếp tục pha loãng đến 10-8. Lấy ở mỗi độ pha loãng 100 l trang đều lên đĩa petri chứa MT 48, ở mỗi độ pha loãng làm ít nhất hai đĩa (Đối chứng).
Dịch bào tử hoặc dịch TBT đƣợc đặt trong cốc đong để chiếu tia UV với công suất của đèn là 30W, bƣớc sóng 2537A0 (260nm), cƣờng độ chiếu sáng 8x103 ergs/cm2/giây. Để xác định tỷ lệ sống sót qua các thời gian chiếu thì phải cố định khoảng cách từ đèn đến bề mặt dịch tế bào, khoảng cách 20 cm là phù hợp [65]. Thời gian chiếu thay đổi từ 5- 80 giây. Trong suốt thời gian chiếu dịch tế bào phải đƣợc khuấy nhẹ nhàng. Ở mỗi thời gian chiếu, hút 1ml dịch pha loãng với 9 ml nƣớc muối sinh lý vô trùng, trang đều lên đĩa Petri chứa MT 48 và R2YE, mỗi nồng độ làm ít nhất hai đĩa. Tất cả các thao tác làm trong điều kiện vô trùng. Các đĩa sau đó đƣợc nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 28oC, kéo dài 5-7 ngày để các khuẩn lạc phát triển [24].
41
2.2.8.2. Gây đột biến bằng MNNG
Dịch có tế bào trần hay bào tử, tế bào sau siêu âm đƣợc xử lý bằng chất gây đột biến MNNG (0,1-1 mg/ml) trong đệm TM pH = 8, giữ ở 30oC trong 10-120 phút. Sau đó ly tâm (7000 v/p, 5 phút), loại dịch nổi, rồi pha loãng bằng nƣớc cất hoặc dung dịch P có pH = 7,2 đến nồng độ 10-5. Lấy ra 0,1 ml nhỏ vào các đĩa Petri đã có 20 ml MT 48 và R2YE, nuôi ở 28oC trong 5 - 7 ngày [32]. Đếm số lƣợng khuẩn lạc phát triển, quan sát sự biển đổi hình thái và xác định hoạt tính kháng sinh của các khuẩn lạc đã phục hồi [24].