SẢN XUẤT VANCOMYXIN
Một yếu tố quan trọng hàng đầu cho mọi quá trình lên men sinh tổng hợp hoạt chất sinh học là chủng giống vi sinh vật. Do các chủng VSV dễ bị biến dị và hoạt tính bị thoái hóa trong quá trình nuôi cấy nhiều lần bởi tác động của môi trƣờng sống của chúng, nên phải tiến hành chọn lọc thƣờng xuyên chủng giống cho lên men. Phần lớn các chủng sản sinh KS phân lập từ tự nhiên thƣờng có hiệu suất thấp vì thế không thể dùng ngay cho sản xuất [6], [7], [12], [26]. Để thu đƣợc các chủng có khả năng siêu tổng hợp KS, có giá trị trong công nghiệp cần phải áp dụng các phƣơng pháp đột biến nhân tạo (đột biến cảm ứng). Các phƣơng pháp hiện đại về sinh tổng hợp, kỹ thuật di truyền và công nghệ gen, siêu tổng hợp, điều khiển hoạt động của gen, gây đột biến định hƣớng, tạo và dung hợp tế bào trần (protoplas)… không những nâng cao hiệu suất chủng giống trong thời gian ngắn mà còn mở ra phƣơng hƣớng đầy triển vọng trong sản xuất các CKS [58].
*Chọn lọc tự nhiên
Bào tử hoặc tế bào sinh dƣỡng của chủng sinh kháng sinh đƣợc pha loãng trong nƣớc muối sinh lý, sau đó cấy lên môi trƣờng dinh dƣỡng trong hộp petri sao cho chỉ hình thành 40-50 khuẩn lạc trong mỗi hộp. Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp 4-5 ngày cho khuẩn lạc phát triển tốt và xác định hoạt tính kháng sinh bằng phƣơng pháp cục thạch. Khi tuyển chọn chủng sinh kháng sinh cao theo phƣơng pháp này, cần phải kiểm tra lại bằng lên men để xác định hiệu suất sinh kháng sinh so với chủng ban đầu. Phƣơng pháp chọn chủng có hoạt tính cao theo cách này chỉ là những đột biến tự nhiên, không có ý nghĩa tạo chủng có năng suất cao, đáp ứng đƣợc nhu cầu của sản xuất [15], [69].
26
*Chọn lọc nhân tạo
Trong công nghệ kháng sinh, tất cả các chủng sản đều trải qua đột biến do cảm ứng. Phƣơng pháp có ý nghĩa, quyết định thành công trong việc tạo giống có năng suất cao là các phƣơng pháp chọn lọc gây đột biến dƣới tác động mạnh của các tác nhân nhƣ tia UV, tia X, tia Gamma hoặc các chất gây đột biến nhƣ etylenimin (EI), axit nitric, nitrosoguanidin, natri nitrit … [23], [24]. Bằng phƣơng pháp gây đột biến tạo đƣợc nhiều biến đổi về gen và chọn lọc định hƣớng nhƣ bổ sung CKS vào môi trƣờng trong quá trình tuyển chọn, sẽ nâng cao đƣợc hoạt tính kháng sinh của chủng giống. Không những thế, bằng phƣơng pháp đột biến còn chọn lọc những ƣu điểm của chủng sản thuận lợi cho quá trình sản xuất [3]. Chẳng hạn, bằng phƣơng pháp này ngƣời ta thu đƣợc chủng sản penixilin không sinh sắc tố, chủng sản oxytetraxyclin ít gây bọt khi lên men và không chịu tác động của photpho thừa, chủng S.orientalis sinh chủ yếu là vancomyxin và ít sản phẩm phụ [33].
Nhân tố gây đột biến có thể tạo ra những thay đổi về di truyền có liên quan đến nhiều đặc tính cũ của sinh vật. Để thu đƣợc những đột biến có ý nghĩa kinh tế, ngƣời ta đã nghiên cứu tích cực về phƣơng pháp và điều kiện sử dụng các nhân tố đó nhƣ: liều, pha, pH... và cách phối hợp các nhân tố khác nhau. Ví dụ, ngƣời ta đã chứng minh đƣợc rằng xử lý với EI liều nhỏ (không gây đột biến) có tác dụng hiệp đồng với tia tử ngoại, nhƣng nếu theo trình tự ngƣợc lại thì chỉ còn tác động của tia tử ngoại. Xử lý trƣớc với tia tử ngoại sẽ loại trừ tác dụng của tia Rơn-ghen, nhƣng làm ngƣợc lại có tác dụng cộng hƣởng. Việc lựa chọn phƣơng pháp xử lý đột biến sẽ dựa trên tiêu chuẩn sau:
- Quá trình thí nghiệm không đƣợc quá nguy hiểm, vì nhiều chất gây đột biến là những chất gây ung thƣ.
- Các kỹ thuật phải đơn giản và các thiết bị hóa chất phải có sẵn.
* Tác dụng của axit nitric
Axit nitriccó tác dụng biến đổi về mặt hóa học các bazơ nitơ của ADN. Dƣới tác dụng của axit nitric, nhóm amin trong các bazơ của axit nucleic bị thay thế bằng
27
nhóm hydroxyl hay oxy, nghĩa là xảy ra phản ứng oxy hóa khử amin. Do đó adenin chuyển thành hydroxatin, guanin chuyển thành xantin và xytozin chuyển thành uraxin. Tác dụng chủ yếu của axit nitric là gây nên các đột biến kiểu khử amin đối với các bazơ của ADN. Ngoài ra, axit nitric có thể tác dụng làm đứt mối liên kết hydro trong các sợi ADN đang phân chia, tạo ra một loại biến đổi khác nhƣ kiểu cấu trúc lại nhiễm sắc thể [58].
* Tác dụng của tia cực tím
Tia cực tím (viết tắt là tia UV) là tác nhân đột biến vật lý đƣợc sử dụng rộng rãi trong di truyền vi sinh vật học 58. Tia UV tác dụng chủ yếu lên axit nucleic, mạnh nhất ở bƣớc sóng 260 nm, dẫn đến hiện tƣợng dime hoá timin. Ở đây hai timin gần nhau đƣợc liên kết cộng hoá trị với nhau ở nguyên tử cacbon thứ 5 và thứ 6, hậu quả là sao chép bị lầm vì ADN-polymeraza dễ lắp một nucleotit không chính xác vào vị trí trên. Dƣới tác dụng của tia UV, trên sợi ADN cũng xuất hiện một dime pirimidin-pirimidin khác gọi là quang sản phẩm 6-4. Ở đây, nguyên tử cacbon thứ 6 của pirimidin ở đầu 5‟ (T hoặc X) đƣợc liên kết với nguyên tử cacbon thứ 4 của pirimidin ở đầu 3‟ (thƣờng là X). Sản phẩm này là nguyên nhân chủ yếu của đột biến gây nên bởi tia UV.
Một đặc điểm tác dụng nữa của tia UV là hiện tƣợng phục hồi hoạt tính. Hiện tƣợng này có thể quan sát thấy khi vi sinh vật bị mất hoạt tính do tia UV. Nếu sau khi làm mất hoạt tính, đem chúng chiếu ánh sáng thƣờng (320-480 nm) thì từ 50- 80% tế bào đƣợc phục hồi hoạt tính [24]. Năm 1962, Rupper thấy rằng, hoạt tính đƣợc phục hồi do tác dụng của một enzym nhất định gọi là enzym phục hồi. Trong bóng tối enzym này liên kết với một quang sản phẩm nhất định xuất hiện trong ADN dƣới tác dụng của tia tử ngoại cụ thể là dime pirimidin. Khi đƣa ra ánh sáng thì enzym này tách khỏi cơ chất, có khả năng tham gia vào phản ứng mới và những rối loạn trong ADN đƣợc phục hồi. Ở đây ngƣời ta cho rằng, rối loạn do tia tử ngoại gây nên và có khả năng đƣợc phục hồi chính là sản phẩm của dime của hai timin lân cận có mối liên kết của C6 và C5 [58].
28
Ở Việt Nam, kỹ thuật gây đột biến bằng tia UV đƣợc sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm. Với kỹ thuật gây đột biến lên tế bào trần bằng chiếu tia UV đã nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng S. rimous R77 lên 10%-60% và chủng S. hygroscopics 5820 lên 600% [3].
* Chuẩn bị dịch tế bào trong kỹ thuật xử lý bằng siêu âm
Dịch huyền phù tế bào đƣợc chuẩn bị bằng cách nuôi cấy trên môi trƣờng 48 dịch thể. Sau đó đƣợc ly tâm và lấy sinh khối. Các tế bào đƣợc hòa trong đệm YEME và đƣa vào siêu âm. Tất cả đƣợc tiến hành trong điều kiện tuyệt đối vô trùng.
* Chuẩn bị dịch tế bào trong kỹ thuật gây đột biến
Để đạt đƣợc hiệu quả bằng phƣơng pháp gây đột biến thì việc chuẩn bị một dịch huyền phù tế bào hoặc bào tử phải thích hợp với điều kiện xử lý đột biến [24], [32], [39].
Dịch huyền phù tế bào đƣợc chuẩn bị bằng cách nhân giống các tế bào thuần khiết. Dịch huyền phù của bào tử Streptomyces đƣợc chuẩn bị nhƣ sau: nhỏ 5–10 ml nƣớc cất khử trùng bằng pipet theo một đƣờng nghiêng trên bề mặt xạ khuẩn. Các mảnh sợi xạ khuẩn đƣợc lọc qua phễu lọc Whatman No2. Tất cả các thao tác đƣợc thực hiện trong điều kiện tuyệt đối vô trùng.
Một số vi sinh vật không sinh bào tử hoặc thể đột biến mất khả năng sinh bào tử. Dịch huyền phù thích hợp có thể đƣợc chuẩn bị bằng cách dùng pipet nhỏ lên trên bề mặt khuẩn lạc khoảng 10 ml nƣớc theo bề mặt nghiêng rồi chuyển toàn bộ thể tích vào một ống hẹp đã khử trùng. Các mẩu sợi thô sẽ đƣợc giữ lại trong vài phút, hút 1ml dịch lọc hoà loãng vào 9 ml nƣớc cất vô trùng. Trong những trƣờng hợp sợi dai, khó hoà tan thì bổ sung 3-5 ml nƣớc cất vô trùng vào cho đồng nhất. Quá trình nghiền nát sẽ làm hạn chế kết quả hoặc khả năng phát triển sẽ bị giảm nhiều. Tuy nhiên, phƣơng pháp này sẽ cho một dịch huyền phù tốt, không có các mảnh lớn.
Đối với nấm không sinh bào tử, đặc biệt đối với các loại có thể sinh các hệ sợi nhỏ, các đỉnh của sợi có thể đƣợc dùng để gây đột biến tại đó, sẽ thuận lợi hơn
29
khi thực hiện trên các khuẩn lạc trên đĩa Petri. Có thể thực hiện phƣơng pháp này bằng cách đặt một miếng giấy bóng kính vuông đã khử trùng hoặc một màng xốp với kích thƣớc 3-4cm trên bề mặt thạch môi trƣờng dinh dƣỡng, chính giữa miếng giấy sẽ cấy nấm, sau khi nuôi một thời gian thích hợp các khuẩn lạc sẽ phát triển ra rìa miếng giấy. Khi đỉnh của sợi nấm dài về phía trƣớc 2-5 mm tách miếng giấy ra khỏi bề mặt đĩa, chuyển các đỉnh sợi nấm đi gây đột biến.
Những vi sinh vật sinh bào tử có thể có cấu trúc rất bền vững. Dịch huyền phù của chúng đƣợc chuẩn bị nhƣ đã mô tả ở trên, nhƣng để ADN dễ bị đột biến hơn, nên thực hiện xử lý ở thời điểm sinh tiền bào tử của chúng. Nuôi vi sinh vật trên môi trƣờng lỏng thích hợp trƣớc khi xử lý. Khi quan sát dƣới kính hiển vi điện tử thấy ống mầm có kích thƣớc gấp đôi bào tử đó là lúc dịch huyền phù rất thích hợp cho xử lý gây đột biến. Thời gian nảy mầm của bào tử không đƣợc quá lâu.
Một số nhà nghiên cứu cho rằng, sử dụng dịch huyền phù bào tử đơn nhân ở thời kỳ tiền sinh bào tử là tốt vì trong quá trình xử lý đột biến sự sao chép ADN nhạy cảm hơn với tác nhân gây đột biến. Tuy nhiên, việc sử dụng quá trình sinh tiền bào tử của vi sinh vật có hệ sợi nấm sẽ gặp khó khăn khi lựa chọn các khuẩn lạc đột biến ở giai đoạn cuối.
Trƣờng hợp sử dụng TBT của xạ khuẩn để gây đột biến bằng chiếu tia hoặc hóa chất, nên dùng dịch huyền phù tế bào đang phát triển ở giai đoạn đầu pha logarit ( đối với S. orientalis, S. fradiae), hoặc ở thời kỳ chuyển tiếp giữa pha logarit và pha cân bằng tùy thuộc loài để tạo TBT. Tế bào trong giai đoạn phát triển này có khả năng tạo thành TBT và phục hồi tốt nhất. Xạ khuẩn thƣờng đƣợc nuôi trong môi trƣờng có bổ sung glyxin làm cho thành tế bào mẫn cảm hơn với lysozym trong quá trình tạo TBT [24]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});