Chủng S. orientalis 4912 đƣợc nuôi trên các môi trƣờng (MT) thạch có thành phần dinh dƣỡng khác nhau. Đây là các MT nuôi cấy đặc trƣng để phân loại các chủng xạ khuẩn. Đặc điểm nuôi cấy của chủng S. orientalis 4912 trên các MT đƣợc trình bày ở bảng 3.1. Kết quả cho thấy, sau 14 ngày nuôi, KTKS của chủng S. orientalis 4912 trên các MT khác nhau đều là màu trắng. Sau đó xạ khuẩn hình thành bào tử nên bắt đầu có sự thay đổi màu sắc,trên MT Gauze 1 và ISP-6, KTKS chuyển sang màu đỏ, trên MT Gauze 2 và ISP-4, KTKS chuyển sang màu vàng nhạt, trong khi vẫn giữ nguyên màu trắng trên MT 48 và MT khoai tây. Chủng 4912 phát triển tốt trên MT Gauze 1 và Gauze 2. Trên các MT, chủng S. orientalis 4912 không sinh sắc tố tan.
Bảng 3.1. Đặc điểm nuôi cấy của chủng S. orientalis 4912 MT Sinh trƣởng Màu KTCC Màu KTKS Sắc tố tan
Gauze 1 +++ Đỏ - vàng nâu Trắng đỏ Không có
Gauze 2 +++ Nâu vàng Trắng vàng Không có
ISP 1 +++ Trắng Vàng kem Không có
ISP 2 ± Trắng Vàng nhạt Không có
ISP 4 ± Trắng vàng Trắng vàng Không có
ISP 6 +++ Nâu vàng Trắng đỏ Không có
44
ISP 9 ± Trắng Nâu nhạt Không có
48 ++ Xám Trắng Không có
79 ± Trắng Vàng sáng Không có
Khoai tây ++ Nâu vàng - đỏ Trắng Không có
Ghi chú: +++: sinh trưởng tốt; ++: sinh trưởng bình thường; ±: sinh trưởng kém
Hình 3.1. Khuẩn lạc của chủng S. orientalis 4912 trên MT 48 3.1.2. Đặc điểm hình thái
Chủng S. orientalis 4912 đƣợc nuôi cấy trên MT Gauze 1 ở nhiệt độ 28oC trong 7-14 ngày, sau đó làm tiêu bản quan sát dƣới kính hiển vi. Hình dạng khuẩn ty và bào tử của chủng S. orientalis 4912 đƣợc thể hiện ở hình 3.2 và 3.3.
45
Hình 3.3. Hình dạng khuẩn ty và chuỗi bào tử của chủng S. orientalis 4912
của chủng S. orientalis 4912 (x 15.000)
Kết quả quan sát dƣới kính hiển vi điện tử cho thấy, chủng S. orientalis 4912 có khuẩn ty khá lớn mọc đan xen với nhau. Bào tử kết thành chuỗi dạng lƣợn sóng, và đƣợc hình thành ở đầu của các chuỗi. Trên mỗi chuỗi có khoảng từ 15-20 bào tử. Bào tử có dạng hình trụ, hình trứng, kích thƣớc 0,5-1 x 2-3 μm, bề mặt bào tử xù xì (kiểu Wa). Quan sát bằng mắt thƣờng thì thấy đó là các đám màu vàng xám.
3.2. KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH CỦA CHỦNG
Streptomyces orientalis 4912
Thử nghiệm lên men chủng 4912 với 6 loại MT cơ sở có các nguồn dinh dƣỡng khác nhau là A-4, A-4H, A-9, A-12, Gauze 1 và 48. Kết quả kiểm tra HTKS của chủng S. orientalis 4912 cho thấy, chủng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh. Phổ kháng khuẩn của xạ khuẩn cũng là một trong những chỉ tiêu phân loại cần đƣợc nghiên cứu. Hoạt tính kháng khuẩn của chủng 4912 đƣợc kiểm tra với 5 loại vi khuẩn kiểm định là Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacillus cereus ATCC 21778,
Sarcina lutea M5 và Staphylococcus aureus 209P thuộc nhóm vi khuẩn Gram dƣơng và Escherichia coli PA2 thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm.
Kết quả trên bảng 3.2 và hình 3.4 cho thấy, chủng S. orientalis 4912 có khả năng ức chế đƣợc cả vi khuẩn Gram dƣơng và vi khuẩn Gram âm. Mặc dầu số lƣợng chủng vi sinh vật kiểm định đƣợc sử dụng ở đây chỉ có tính đại diện, nhƣng kết quả thu đƣợc cũng phù hợp với các công trình nghiên cứu khác là các chủng S. orientalis có phổ kháng khuẩn khá rộng và mạnh. Trên các MT, chủng S. orientalis
46
Hình 3.4. Hoạt tính kháng sinh kháng B. subtilis ATCC 6633 của chủng S. orientalis 4912
trên MT Gauze 1, chủng có sinh trƣởng nhƣng lại không sinh ra CKS ức chế vi sinh vật kiểm định. Ở các MT còn lại, xạ khuẩn sinh trƣởng tốt và sinh ra CKS ức chế vi sinh vật kiểm định, tuy nhiên CKS sinh ra không nhiều.
Bảng 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của chủng S. orientalis 4912
MT Hoạt tính kháng khuẩn (ĐKVVK, mm) B. subtilis ATCC 6633 E. coli PA2 S. aureus 208P S. lutea M5 B. cereus ATCC 21778 Gauze 1 0 0 0 0 0 A-4 12,5 11,5 14,0 10,5 12,5 A-4H 13,0 13,0 14,0 13,2 12,5 A-12 11,5 9,0 11,5 9,0 9,0 A- 9 14,2 12,0 13,5 13,4 10,1 48 16,0 14,5 15,4 14,5 12,8
3.3. NÂNG CAO HOẠT TÍNH KHÁNG SINH CỦA CHỦNG S. orientalis 4912
Yếu tố quan trọng hàng đầu cho mọi quá trình lên men sinh tổng hợp hoạt chất sinh học là chủng giống vi sinh vật. Để đảm bảo chủng giống luôn có hoạt tính cao,
47
ngoài việc bảo quản tốt chủng giống bằng các phƣơng pháp giữ giống, ngƣời ta còn thƣờng xuyên tuyển chọn nâng cao hiệu suất bằng các kĩ thuật di truyền.
Với mục đích tuyển chọn chủng giống có hiệu suất cao và bền vững, chủng
S. orientalis 4912 đƣợc tiến hành nghiên cứu chọn lọc, gây đột biến TBT và bào tử bằng tia UV và N-metyl-N‟-nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG).
Mặt khác, chủng S. orientalis 4912 đƣợc nuôi cấy và đƣa vào máy siêu âm phá màng tế bào sau đó đƣa vào đột biến bằng MNNG. Từ các kết quả nghiên cứu có thể lựa chọn đƣợc phƣơng pháp gây đột biến thích hợp tạo chủng sản có năng suất cao.
3.3.1. Thu nhận bào tử và tế bào trần từ chủng S. orientalis 4912
Để thu đƣợc bào tử cho xử lý đột biến, chủng S. orientalis 4912 đƣợc nuôi trong ống thạch nghiêng chứa MT 48 từ 8-10 ngày. Nhỏ nƣớc cất vô trùng theo mặt thạch, cạo nhẹ trên bề mặt để gạt bào tử vào nƣớc và đổ qua dụng cụ lọc để lấy bào tử. Để thu đƣợc TBT, chủng 4912 đƣợc nuôi trong MT YEME dịch thể, sau đó sinh khối đƣợc xử lý với lysozym . Tuy nhiên, việc tạo TBT phụ thuộc chủ yếu vào thời gian nuôi cấy chủng giống, nồng độ và thời gian xử lý với lysozym, nồng độ glyxin trong MT nuôi cấy. Cần xác định giá trị các yếu tố này để thu đƣợc kết quả tốt nhất.
Hình 3.5: Tế bào trần chủng Streptomyces orientalis 4912 trên kính hiển vi (x 50000)
3.3.3.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng hình thành tế bào trần của chủng S. orientalis 4912
Thời gian nuôi cấy giống có ảnh hƣởng rất lớn tới quá trình hình thành tế bào trần. Kiểm tra sự tạo thành tế bào trần của chủng S. orientalis 4912 tại các thời điểm
48
sinh trƣởng khác nhau 24, 36, 48, 60 và 72 giờ. Sau 60 phút xử lý sinh khối với lysozym (1 mg/ml), làm tiêu bản soi kính hiển vi thấy các khuẩn ty bị cắt nhỏ và hình thành tế bào trần. Sử dụng buồng đếm hồng cầu, đếm số lƣợng TBT tạo thành, kết quả thể hiện trên hình 3.6 cho thấy, quá trình tạo tế bào trần từ khuẩn ty ở 48 giờ nuôi cấy diễn ra khá nhanh và có hiệu quả nhất.
3.3.3.2. Ảnh hưởng của thời gian xử lý lysozym tới khả năng hình thành tế bào trần của chủng S. orientalis 4912
Giống nuôi 48 giờ, sau đó xử lý bằng lysozym với nồng độ 1 mg/ml từ 30 đến 120 phút. Trong quá trình thí nghiệm, làm tiêu bản soi kính hiển vi thấy sau 30 phút các đoạn khuẩn ty bị cắt, tế bào trần cũng đƣợc tạo thành, sau 60 phút lƣợng tế bào trần tạo thành rất nhiều, sau 90 phút số lƣợng tế bào trần ít đi, có thể một số tế bào trần đã bắt đầu bị phá hủy. Kết quả trên cho thấy khả năng tạo tế bào trần và khả năng bền vững của tế bào trần phụ thuộc nhiều vào thời gian xử lý lysozym. Tại thời điểm trƣớc 60 phút lƣợng tế bào trần tạo ra là chƣa đáng kể, sau 90 phút thì các tế bào trần tạo ra bắt đầu bị phá huỷ, do đó thời gian xử lý thích hợp nhất là từ 60- 70 phút, lƣợng tế bào trần tạo ra nhiều nhất và ổn định nhất. Nếu kéo dài thời gian xử lý hơn nữa, lysozym sẽ phá hủy các TBT vừa tạo thành. Làm tiêu bản soi kính hiển vi, dùng buồng đếm hồng cầu đếm số lƣợng TBT tạo thành, kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.7.
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng tạo thành TBT
của chủng S. orientalis 4912
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của thời gian xử lý lysozym tới khả năng tạo thành TBT của chủng S. orientalis 4912 0 2 4 6 8 10 12 14 16 24 36 48 60 72
Thời gian (giờ)
Số lư ợn g T B T /m l ( x1 0 5) 0 2 4 6 8 10 12 14 30 45 60 75 90 105 120 Thời gian (phút) Số lư ợn g T B T /m l ( x1 0 5)
49
3.3.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ lysozym tới khả năng hình thành tế bào trần của chủng S. orientalis 4912
Giống nuôi 48 giờ, sau đó xử lý lysozym với nồng độ từ 0,5 đến 4 mg/ml trong 60 phút. Kết thúc thí nghiệm, làm tiêu bản soi kính hiển vi và đếm số lƣợng TBT. Kết quả trên bảng 3.3 cho thấy, khả năng tạo tế bào trần và khả năng bền vững của tế bào trần tốt nhất khi xử lý với lysozym ở nồng độ 1 mg/ml. Tại nồng độ 0,5 mg/ml, do ít enzym nên lƣợng tế bào trần tạo ra chƣa đáng kể. Sau 60 phút xử lý ở nồng độ 2 mg/ml trở lên, do nồng độ lysozym cao nên các tế bào trần tạo ra bị enzym phá huỷ gần nhƣ hoàn toàn.
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nồng độ lysozym tới khả năng tạo TBT của chủng S. orientalis 4912 Nồng độ lysozym (mg/ml) Số lƣợng TBT/ml (x105) 0,5 0,05 1,0 12 1,5 10 2,0 0,7 2,5 0,0004 3,0 0,00002 4,0 0
3.3.3.4. Ảnh hưởng của nồng độ glyxin tới khả năng hình thành tế bào trần của chủng S. orientalis 4912
Khi nuôi xạ khuẩn trong MT có chứa glyxin thì sự sinh trƣởng sẽ bị ức chế. Theo Baltz, sự sinh trƣởng của chủng xạ khuẩn S. fradiae trong MT có 0,4% glyxin bị chậm lại, cụ thể là thời gian nhân đôi của tế bào kéo dài từ 1,6 giờ lên tới 2,7 giờ. Mặc dù vậy nhƣng glyxin có tác dụng làm cho thành tế bào của xạ khuẩn mẫn cảm hơn với lysozym. Đó là do glyxin đã thay thế D-alanin trong phân tử peptidoglycan của thành tế bào làm cho lysozym dễ tác động vào mối liên kết glycozit. Vì vậy, khi muốn tạo tế bào trần ở xạ khuẩn, glyxin thƣờng đƣợc lựa chọn để bổ sung vào MT
50
nuôi cấy. Để quá trình tạo tế bào trần diễn ra nhanh và hiệu quả thì việc tìm ra nồng độ glyxin thích hợp là rất cần thiết. Theo nhiều tài liệu nghiên cứu thì thành tế bào của các loài xạ khuẩn mẫn cảm với lysozym khác nhau [24]. Vì thế, nồng độ glyxin thích hợp cho tạo tế bào trần mà không ảnh hƣởng tới sự sinh trƣởng của các loài xạ khuẩn cũng khác nhau.
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nồng độ glyxintới khả năng tạo TBT của chủng S. orientalis 4912 Nồng độ glyxin (%) Số lƣợng TBT/ml (x 105) 0 0,4 0,1 0,6 0,2 2,0 0,3 7,0 0,4 12 0,5 5,6 0,6 1,5 0,7 0,5 0,8 0,2 0,9 0,1 1,0 0,1
Theo kết quả ở bảng 3.4 thì nồng độ glyxin thích hợp cho chủng S. orientalis
4912 là 0,4 %. Ở nồng độ glyxin 0,8-1% thì ức chế gần nhƣ hoàn toàn sự sinh trƣởng cũng nhƣ quá trình tạo TBT. Ở nồng độ glyxin thấp hơn 0,4% số lƣợng TBT tạo thành ít do thành tế bào xạ khuẩn kém mẫn cảm với lysozym hơn.
Kết quả nghiên cứu thu nhận TBT ở xạ khuẩn S. orientalis 4912 cho thấy, quá trình tạo TBT hiệu quả nhất khi giống đang phát triển ở đầu pha logarit tức là khoảng 48 giờ nuôi cấy, trong MT có bổ sung 0,4% glyxin, nồng độ lysozym và thời gian xử lý tế bào thích hợp nhất là 1 mg/ml và 60-70 phút.
51
3.3.2. Nâng cao HTKS của chủng S. orientalis 4912 bằng phƣơng pháp gây đột biến dùng tia UV và N-metyl-N’-nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG) biến dùng tia UV và N-metyl-N’-nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG)
3.3.2.1. Xác định tỷ lệ sống sót của chủng S. orientalis 4912 sau khi chiếu tia UV và xử lý bằng MNNG
Để xây dựng đƣờng cong sống sót khi xử lý với tia UV, dịch bào tử và TBT đƣợc xử lý với khoảng cách 20 cm. Sau thời gian xử lý từ 0 - 80 giây, cấy lên đĩa thạch MT 48 (với bào tử) và R2YE (với TBT), nuôi trong tủ ấm ở 28-30oC trong 5 ngày. Đồ thị sống sót của tế bào trần và bào tử chủng S. orientalis 4912 sau khi gây đột biến cho thấy (Hình 3.8), thời gian chiếu UV càng lâu thì tỷ lệ sống sót càng giảm. Thời gian chiếu là 30 giây, tỷ lệ bào tử sống sót là 26,8% và TBT là 12,6%. Thời gian chiếu là 40 giây tỷ lệ sống sót của bào tử còn 10,10% và tế bào trần là 8,6%; thời gian chiếu 50 và 60 giây tỷ lệ TBT sống sót là 3,2% và 0,03%; bào tử là 4,22 và 0,1%. Thời gian chiếu là 70 giây số cá thể sống không tồn tại. Rõ ràng khả năng tác động của tia UV lên tế bào trần của chủng 4912 mạnh hơn lên bào tử. Điều này phù hợp với quy luật tự nhiên.
Hình 3.8. Khả năng sống sót của tế bào sau siêu âm, tế bào trần và bào tử của chủng 4912 sau khi xử lý UV và MNNG
52
Bên cạnh việc sử dụng tác nhân vật lý là tia UV, tế bào sau khi phá bằng siêu âm, BT và TBT của chủng 4912 còn đƣợc xử lý với MNNG. MNNG là hóa chất đƣợc dùng phổ biến trong các thí nghiệm gây đột biến tế bào vi sinh vật. Để tìm điều kiện thích hợp cho quá trình gây đột biến, tế bào sau siêu âm, TBT và BT của chủng 4912 đƣợc xử lý với MNNG ở các nồng độ từ 0-3 mg/ml và pH 6-9 trong thời gian 0-80 phút (Bảng 3.5, 3.6 và 3.7).
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của nồng độ MNNG tới khả năng sống sót của chủng S. orientalis 4912 Nồng độ MNNG (mg/ml) Tỷ lệ sống sót của BT (%) Tỷ lệ sống sót của TBT (%) Tỷ lệ sống sót của tế bào sau siêu âm (%)
0 100 100 100 0,01 100 65 88 0,05 98 33 64 0,1 78,7 23,3 58 0,3 47 3,19 22 0,5 23 0,11 15,2 1,0 10,9 0,03 8,05 1,5 0,7 0 0,06 2,0 0 0 0 3,0 0 0 0
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của pH khi xử lý bằng MNNG tới khả năng sống sót của chủng S. orientalis 4912 pH Tỷ lệ sống sót của BT (%) Tỷ lệ sống sót của TBT (%) Tỷ lệ sống sót của tế bào sau siêu âm (%)
8 (Đối chứng) 100 100 100
6 22,2 34 29,4
7 20,9 31 26
8 10,9 3,19 12,7
53
Kết quả ghi ở các bảng 3.5, 3.6 và 3.7 cho thấy, TBT của chủng 4912 mẫn cảm với MNNG hơn bào tử rất nhiều, điều này cũng phù hợp với quy luật tự nhiên và kết quả của nhiều nghiên cứu trên thế giới. Theo Kim và cộng sự (1983), tỷ lệ sống sót của BT xạ khuẩn M. rosaria sau khi xử lý với MNNG có nồng độ 0,5 mg/ml trong thời gian 20 phút là 10% trong khi tỷ lệ sống sót của TBT khi xử lý MNNG ở nồng độ 0,1 mg/ml trong cùng thời gian 20 phút là 11% [32].
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của thời gian xử lý bằng MNNG tới khả năng sống sót của chủng S. orientalis 4912 Thời gian (Phút) Tỷ lệ sống sót của BT (%) Tỷ lệ sống sót của TBT (%) Tỷ lệ sống sót của tế bào sau siêu âm (%)
0 100 100 100 10 68 20,75 80 20 51,4 16,38 72,5 30 22 7,8 30,2 40 10,9 3,19 12,8 50 3,8 0,82 4,1 60 2,9 0,15 2,5 70 0,19 0 0,53 80 0 0 0
Khi xử lý BT và TBT của chủng 4912 với MNNG ở các nồng độ khác nhau tại pH 8 trong thời gian 40 phút thì thấy ở nồng độ 1 mg/ml tỷ lệ sống sót của BT là 10,9 %. Ở các nồng độ MNNG thấp hơn 1 mg/ml tỷ lệ sống sót của BT cao trên 20 %, ở các nồng độ cao hơn 1 mg/ml tỷ lệ sống sót của BT quá thấp, dƣới 1 %, nhƣ vậy sẽ không thu đƣợc các đột biến có ý nghĩa. Từ đó lựa chọn nồng độ MNNG cho tỷ lệ sống sót gần 10% nhất cho nghiên cứu tiếp theo để tìm pH và thời gian xử lý