Để thu đƣợc bào tử cho xử lý đột biến, chủng S. orientalis 4912 đƣợc nuôi trong ống thạch nghiêng chứa MT 48 từ 8-10 ngày. Nhỏ nƣớc cất vô trùng theo mặt thạch, cạo nhẹ trên bề mặt để gạt bào tử vào nƣớc và đổ qua dụng cụ lọc để lấy bào tử. Để thu đƣợc TBT, chủng 4912 đƣợc nuôi trong MT YEME dịch thể, sau đó sinh khối đƣợc xử lý với lysozym . Tuy nhiên, việc tạo TBT phụ thuộc chủ yếu vào thời gian nuôi cấy chủng giống, nồng độ và thời gian xử lý với lysozym, nồng độ glyxin trong MT nuôi cấy. Cần xác định giá trị các yếu tố này để thu đƣợc kết quả tốt nhất.
Hình 3.5: Tế bào trần chủng Streptomyces orientalis 4912 trên kính hiển vi (x 50000)
3.3.3.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng hình thành tế bào trần của chủng S. orientalis 4912
Thời gian nuôi cấy giống có ảnh hƣởng rất lớn tới quá trình hình thành tế bào trần. Kiểm tra sự tạo thành tế bào trần của chủng S. orientalis 4912 tại các thời điểm
48
sinh trƣởng khác nhau 24, 36, 48, 60 và 72 giờ. Sau 60 phút xử lý sinh khối với lysozym (1 mg/ml), làm tiêu bản soi kính hiển vi thấy các khuẩn ty bị cắt nhỏ và hình thành tế bào trần. Sử dụng buồng đếm hồng cầu, đếm số lƣợng TBT tạo thành, kết quả thể hiện trên hình 3.6 cho thấy, quá trình tạo tế bào trần từ khuẩn ty ở 48 giờ nuôi cấy diễn ra khá nhanh và có hiệu quả nhất.
3.3.3.2. Ảnh hưởng của thời gian xử lý lysozym tới khả năng hình thành tế bào trần của chủng S. orientalis 4912
Giống nuôi 48 giờ, sau đó xử lý bằng lysozym với nồng độ 1 mg/ml từ 30 đến 120 phút. Trong quá trình thí nghiệm, làm tiêu bản soi kính hiển vi thấy sau 30 phút các đoạn khuẩn ty bị cắt, tế bào trần cũng đƣợc tạo thành, sau 60 phút lƣợng tế bào trần tạo thành rất nhiều, sau 90 phút số lƣợng tế bào trần ít đi, có thể một số tế bào trần đã bắt đầu bị phá hủy. Kết quả trên cho thấy khả năng tạo tế bào trần và khả năng bền vững của tế bào trần phụ thuộc nhiều vào thời gian xử lý lysozym. Tại thời điểm trƣớc 60 phút lƣợng tế bào trần tạo ra là chƣa đáng kể, sau 90 phút thì các tế bào trần tạo ra bắt đầu bị phá huỷ, do đó thời gian xử lý thích hợp nhất là từ 60- 70 phút, lƣợng tế bào trần tạo ra nhiều nhất và ổn định nhất. Nếu kéo dài thời gian xử lý hơn nữa, lysozym sẽ phá hủy các TBT vừa tạo thành. Làm tiêu bản soi kính hiển vi, dùng buồng đếm hồng cầu đếm số lƣợng TBT tạo thành, kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.7.
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng tạo thành TBT
của chủng S. orientalis 4912
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của thời gian xử lý lysozym tới khả năng tạo thành TBT của chủng S. orientalis 4912 0 2 4 6 8 10 12 14 16 24 36 48 60 72
Thời gian (giờ)
Số lư ợn g T B T /m l ( x1 0 5) 0 2 4 6 8 10 12 14 30 45 60 75 90 105 120 Thời gian (phút) Số lư ợn g T B T /m l ( x1 0 5)
49
3.3.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ lysozym tới khả năng hình thành tế bào trần của chủng S. orientalis 4912
Giống nuôi 48 giờ, sau đó xử lý lysozym với nồng độ từ 0,5 đến 4 mg/ml trong 60 phút. Kết thúc thí nghiệm, làm tiêu bản soi kính hiển vi và đếm số lƣợng TBT. Kết quả trên bảng 3.3 cho thấy, khả năng tạo tế bào trần và khả năng bền vững của tế bào trần tốt nhất khi xử lý với lysozym ở nồng độ 1 mg/ml. Tại nồng độ 0,5 mg/ml, do ít enzym nên lƣợng tế bào trần tạo ra chƣa đáng kể. Sau 60 phút xử lý ở nồng độ 2 mg/ml trở lên, do nồng độ lysozym cao nên các tế bào trần tạo ra bị enzym phá huỷ gần nhƣ hoàn toàn.
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nồng độ lysozym tới khả năng tạo TBT của chủng S. orientalis 4912 Nồng độ lysozym (mg/ml) Số lƣợng TBT/ml (x105) 0,5 0,05 1,0 12 1,5 10 2,0 0,7 2,5 0,0004 3,0 0,00002 4,0 0
3.3.3.4. Ảnh hưởng của nồng độ glyxin tới khả năng hình thành tế bào trần của chủng S. orientalis 4912
Khi nuôi xạ khuẩn trong MT có chứa glyxin thì sự sinh trƣởng sẽ bị ức chế. Theo Baltz, sự sinh trƣởng của chủng xạ khuẩn S. fradiae trong MT có 0,4% glyxin bị chậm lại, cụ thể là thời gian nhân đôi của tế bào kéo dài từ 1,6 giờ lên tới 2,7 giờ. Mặc dù vậy nhƣng glyxin có tác dụng làm cho thành tế bào của xạ khuẩn mẫn cảm hơn với lysozym. Đó là do glyxin đã thay thế D-alanin trong phân tử peptidoglycan của thành tế bào làm cho lysozym dễ tác động vào mối liên kết glycozit. Vì vậy, khi muốn tạo tế bào trần ở xạ khuẩn, glyxin thƣờng đƣợc lựa chọn để bổ sung vào MT
50
nuôi cấy. Để quá trình tạo tế bào trần diễn ra nhanh và hiệu quả thì việc tìm ra nồng độ glyxin thích hợp là rất cần thiết. Theo nhiều tài liệu nghiên cứu thì thành tế bào của các loài xạ khuẩn mẫn cảm với lysozym khác nhau [24]. Vì thế, nồng độ glyxin thích hợp cho tạo tế bào trần mà không ảnh hƣởng tới sự sinh trƣởng của các loài xạ khuẩn cũng khác nhau.
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nồng độ glyxintới khả năng tạo TBT của chủng S. orientalis 4912 Nồng độ glyxin (%) Số lƣợng TBT/ml (x 105) 0 0,4 0,1 0,6 0,2 2,0 0,3 7,0 0,4 12 0,5 5,6 0,6 1,5 0,7 0,5 0,8 0,2 0,9 0,1 1,0 0,1
Theo kết quả ở bảng 3.4 thì nồng độ glyxin thích hợp cho chủng S. orientalis
4912 là 0,4 %. Ở nồng độ glyxin 0,8-1% thì ức chế gần nhƣ hoàn toàn sự sinh trƣởng cũng nhƣ quá trình tạo TBT. Ở nồng độ glyxin thấp hơn 0,4% số lƣợng TBT tạo thành ít do thành tế bào xạ khuẩn kém mẫn cảm với lysozym hơn.
Kết quả nghiên cứu thu nhận TBT ở xạ khuẩn S. orientalis 4912 cho thấy, quá trình tạo TBT hiệu quả nhất khi giống đang phát triển ở đầu pha logarit tức là khoảng 48 giờ nuôi cấy, trong MT có bổ sung 0,4% glyxin, nồng độ lysozym và thời gian xử lý tế bào thích hợp nhất là 1 mg/ml và 60-70 phút.
51