Định danh các type gen của Helicobacter pylori và ý nghĩa bệnh học trong ung thư dạ dày ( Bệnh viện Đại học Y Dược Tp.HCM chủ nhiệm đê tài PGS.TS. Trần Thiện Trung )

"Định danh các tuýp gen của Hecolibacter pylori và ý nghĩa sinh bệnh học trong ung thư dạ dày" Cơ quan Đại học Y dược Tp. Hồ Chí Minh Chủ nhiệm đề tài PGS.TS Trần Thiện Trung. - Tp.Hồ Chí Minh; 2011. - 82tr. Tóm tắt : Đề tài nghiên cứu các mục tiêu sau đây: Định danh các týp gene cagA và vacA của vi khuẩn H. pylori trong bệnh ung thư dạ dày (trên bệnh nhân được phẫu thuật cắt bán phần dưới dạ dày do ung thư hang vị). . Đánh giá mối liên quan giữa các týp gene cagA và vacA của vi khuẩn H. pylori với các thương tổn mô bệnh học niêm mạc dạ dày về các mức độ : viêm teo, chuyển sản ruột, nghịch sản và mức độ ác tính (độ biệt hóa) của ung thư dạ dày.Đánh giá và so sánh tỷ lệ giữa các týp gene của vi khuẩn H. pylori trên hai nhóm bệnh nhân ung thư dạ dày và nhóm chứng viêm dạ dày có H. pylori-dương tính.

MỞ ĐẦU

Ung thư dạ dày là một trong các bệnh ung thư được quan tâm nhiều vì là ung thư thường gặp, gây tử vong cao; vì chẩn đoán trễ dù đã có khá nhiều các phương tiện chẩn đoán hình ảnh hiện đại trong đó có nội soi tiêu hóa phát triển khá tốt, và ngoài nội soi đến nay vẫn chưa có các xét nghiệm sinh học, các chẩn đoán về gen giúp phát hiện và chẩn đoán sớm ung thư dạ dày được ứng dụng trong thực hành Hơn nữa ở nước ta hiện chưa có các biện pháp theo dõi, định hướng tầm soát ở cấp độ quốc gia các bệnh nhân

có nguy cơ cao của ung thư dạ dày

Xu thế của các nhà nghiên cứu trên thế giới hiện nay về ung thư dạ dày có ba hướng nghiên cứu chính:

(1) Thứ nhất là tập trung vào tiến trình các thương tổn tiền ung thư dạ dày như viêm teo, chuyển sản ruột và nghịch sản nhằm phát hiện, chẩn đoán và điều trị sớm ung thư

dạ dày Các nghiên cứu đi theo hướng này dựa trên các thương tổn qua nội soi dạ dày và chẩn đoán mô bệnh học theo các phân loại về viêm dạ dày chuẩn mực hiện nay đã được thế giới công nhận như hệ thống Sydney (1990), Sydney cải tiến (1994), Whitehead…

và mới đây là đánh giá giai đoạn viêm dạ dày OLGA (operative link on gastritis assessment) có khả năng giúp tiên lượng nguy cơ mắc phải ung thư dạ dày;

(2) Thứ hai là tập trung nghiên cứu về các týp gene của tác nhân sinh bệnh như vi

khuẩn H pylori, vi khuẩn này được Tổ chức phòng chống ung thư thế giới và Tổ chức y

tế thế giới (WHO) năm 1994 xếp là tác nhân nhóm 1 nguy cơ gây bệnh ung thư dạ dày Nhiều công bố cho thấy một số týp gene của hai gene có liên quan chặt chẽ đến khả

năng gây bệnh của vi khuẩn H pylori là các týp của gene cagA và vacA, trên cơ sở đó đặt ra nhiệm vụ tầm soát những bệnh nhân có nguy cơ cao khi bị nhiễm H pylori với

các týp gene này;

(3) Thứ ba là trong những năm gần đây, một hướng khác tập trung nghiên cứu về gene nhằm tìm ra các marker để chẩn đoán sớm bệnh ung thư, vì sự thay đổi về gene bao giờ cũng là sự thay đổi sớm nhất trước khi xuất hiện hình thái thay đổi tế bào Việc

nghiên cứu tìm hiểu về cơ chế gây ung thư để từ đó tìm ra phương pháp chẩn đoán sớm

và điều trị hiệu quả đang là hướng đi đầy thách thức và đang được các nhà Y-Sinh học hiện đại đặc biệt quan tâm

Như vậy trong ba hướng nghiên cứu chính liên quan đến ung thư dạ dày hiện nay trên thế giới, chúng tôi tập trung nghiên cứu về các týp gene của tác nhân sinh bệnh là vi

khuẩn H pylori

Vi khuẩn H pylori được tìm ra vào tháng 4 năm 1982, kể từ đó đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn này trên nhiều phương diện Nhiễm H pylori được biết là

nhiễm trùng phổ biến nhất ở loài người, gặp ở khắp mọi nơi trên thế giới Tất cả bệnh

nhân nhiễm H pylori đều có viêm dạ dày mô học, tương ứng với viêm dạ dày mạn kinh

điển với đặc điểm là sự thấm nhập của các tế bào đa nhân trung tính và các loại tế bào viêm khác; tuy vậy, số đông suốt đời không có triệu chứng và thực sự chỉ có một số nhỏ

là tiến triển thành loét dạ dày, loét tá tràng, ung thư dạ dày, hay u mô limphô ở niêm mạc dạ dày [6]

Năm 1983, Marshall là một trong hai người tìm ra H pylori lần đầu tiên đưa ra giả thuyết về sự kết hợp giữa ung thư dạ dày và nhiễm H pylori [22] Mặc dù phải hơn 23 năm sau khi tìm ra vi khuẩn H pylori, ngày 3 tháng 10 năm 2005, hai nhà khoa học-bác

sĩ người Úc là Robin Warren và Barry Marshall mới được nhận giải thưởng Nobel về Y học và Sinh lý học Cho đến nay, việc tìm kiếm những chiến lược can thiệp có hiệu quả

để phòng ngừa ung thư dạ dày cũng như điều trị nhiễm H pylori vẫn đang là những vấn

đề còn hết sức thời sự tại nhiều nước trên thế giới [6]

Các yếu tố nguyên nhân và bệnh sinh ung thư dạ dày còn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn như chế độ ăn nhiều muối, thức ăn có chứa chất nitrosamin, nhóm máu và sự đột biến gene Đặc biệt trong hơn hai thập kỷ gần đây, thế giới tập trung nghiên cứu về

vai trò của vi khuẩn H pylori trong bệnh sinh ung thư dạ dày với khả năng gây bệnh của các chủng H pylori khác nhau

Vì vậy việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để định danh các týp gene của vi

khuẩn H pylori trong ung thư dạ dày nhằm hiểu biết về bệnh sinh và các yếu tố nguy cơ

có tầm quan trọng và hết sức cấp thiết để có thể tìm ra các biện pháp phòng ngừa, giúp

chẩn đoán sớm và làm giảm tỷ lệ tử vong của căn bệnh này Đó là lý do của công trình

mà chúng tôi tiến hành nghiên cứu « Định danh các týp gene của H pylori và ý nghĩa

sinh bệnh học trong ung thư dạ dày » với ba mục tiêu:

1 Định danh các týp gene cagA và vacA của vi khuẩn H pylori trong bệnh ung

thư dạ dày (trên bệnh nhân được phẫu thuật cắt bán phần dưới dạ dày do ung thư hang vị)

2 Đánh giá mối liên quan giữa các týp gene cagA và vacA của vi khuẩn H pylori

với các thương tổn mô bệnh học niêm mạc dạ dày về các mức độ : viêm teo, chuyển sản ruột, nghịch sản và mức độ ác tính (độ biệt hóa) của ung thư dạ dày

3 Đánh giá và so sánh tỷ lệ giữa các týp gene của vi khuẩn H pylori trên hai nhóm bệnh nhân ung thư dạ dày và nhóm chứng viêm dạ dày có H pylori-

dương tính

Từ đó có thể ứng dụng để tiếp tục nghiên cứu, để theo dõi và tầm soát những bệnh

nhân viêm dạ dày H pylori-dương tính với các týp gene mắc phải có nguy cơ cao nhằm

góp phần chẩn đoán sớm bệnh ung thư dạ dày

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Ung thư dạ dày

Trong các nguyên nhân gây tử vong, hiện nay ung thư đã vượt qua bệnh tim mạch

để trở thành căn nguyên hàng đầu với tỷ lệ mắc bệnh ngày càng cao mà độ tuổi ngày càng giảm Theo báo cáo năm 2007 của Viện nghiên cứu ung thư Mỹ, trên thế giới có thêm khoảng 12 triệu trường hợp ung thư mới và có khoảng 7,6 triệu bệnh nhân tử vong Tại vùng Đông Á và Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam có thêm khoảng 3,6 triệu trường hợp ung thư mới với khoảng 2,5 triệu bệnh nhân tử vong mà ung thư dạ dày là nguyên nhân đứng hàng thứ hai [24, 26]

Các nước có tỷ lệ mắc ung thư dạ dày cao thuộc vùng Đông Á (Nhật bản, Trung Quốc, Hàn Quốc), các nước thuộc Liên Xô cũ, Nam Mỹ, vùng Caribê và Nam Âu Các nước có tỷ lệ mắc bệnh ung thư dạ dày thấp thuộc vùng Nam Á (Ấn Độ, Pakistan, Thái lan), Bắc Mỹ, Úc và châu Phi [21, 35]

1.1.1 Về điều trị

Năm 1996, Forman [22] cho rằng H pylori là yếu tố nguy cơ cao của ung thư dạ

dày nên việc điều trị tiệt trừ H pylori là điều cần và nên làm, điều trị tiệt trừ H pylori

thành công có thể được coi là biện pháp dự phòng ung thư dạ dày Một điều tra tầm soát ung thư dạ dày ở 100.000 đàn ông tuổi từ 50 đến 59 ở các nước phương Tây, cho thấy

có khoảng 35.000 người có H pylori -dương tính và 1.600 người sẽ tiến triển thành ung

thư dạ dày trong vòng 30 năm Như vậy, người ta có thể ước tính là có khoảng 500 đến

1200 người trong số 1 600 trường hợp ung thư nói trên có thể có nguyên nhân liên quan

đến nhiễm H pylori Về lý thuyết, cần phải điều trị dự phòng cho 35.000 người bị nhiễm H pylori này và giá thành chi phí cho chiến lược điều trị này ở Anh là 5.000-

10.000 bảng để cứu được một người, tương đương với các chương trình tầm soát ung thư cổ tử cung bằng xét nghiệm tế bào học hoặc tầm soát ung thư vú bằng chụp nhũ ảnh Chiến lược này đã thu hút được sự chú ý cao cũng như trả lời được nhiều câu hỏi đặt ra trong thực hành Tuy nhiên, nếu ở nhóm tuổi từ 50 đến 59 này mới được can thiệp thì

có thể coi là chậm trễ Hiện nay, người ta còn chưa rõ giai đoạn nào trong quá trình tiến

triển đến ung thư là còn có thể đảo ngược được Ở những bệnh nhân nhiễm H pylori ,

người ta thấy rằng các thương tổn của viêm niêm mạc dạ dày là có thể phục hồi và trở

lại bình thường sau điều trị tiệt trừ H pylori thành công; nhưng đối với các thương tổn

khác như viêm teo niêm mạc hoặc chuyển sản ruột hoặc nghịch sản thì còn cần phải

nghiên cứu thêm Nếu các thương tổn này có thể hồi phục sau tiệt trừ H pylori thành

công thì vẫn có thể hi vọng dự phòng được ung thư dạ dày trong dân số ở độ tuổi 55

Việc điều trị cho những người nhiễm H pylori trẻ hơn là cần thiết, tuy nhiên cần phải theo dõi lâu dài Tác dụng phụ của thuốc và tái nhiễm H pylori sau điều trị tiệt trừ cũng là những vấn đề cần được quan tâm Liên quan đến cơ chế, nhiễm H pylori ở người có acid HCl bình thường và hậu quả của nhiễm H pylori là thoái hoá mạn tính biểu mô dạ dày sẽ đưa đến viêm teo niêm mạc H pylori có thể được coi là yếu tố nguy

cơ chính về môi trường ở giai đoạn đầu của ung thư dạ dày Forman kết luận là ngày

nay, ngoài những nghi vấn có căn cứ, có sự liên quan giữa nhiễm H pylori và nguyên nhân của ung thư dạ dày Nhiễm H pylori chiếm khoảng 1/3 trong số một triệu trường hợp ung thư dạ dày mới mỗi năm Do đó vấn đề điều trị tiệt trừ H pylori nhằm dự

phòng ung thư dạ dày được đặt ra, và cũng cần xác định xem chương trình tầm soát

nhiễm H pylori ở người lớn nên được thực hiện vào thời điểm nào để không bị chậm trễ

và đạt được hiệu quả cao Vì vậy cần có những công tình nghiên cứu ngẫu nhiên có nhóm chứng, và theo dõi đánh giá ít nhất trong 10 năm

Mới đây, năm 2007, tại Hội thảo chuyên đề quốc tế về chủ đề “Phòng ngừa ung thư

dạ dày bằng tiệt trừ H pylori” trong khuôn khổ Hội nghị lần thứ 92 của Hội Tiêu hóa

Nhật Bản Sugano [39] cho rằng cần phải tiến hành cấp thiết việc điều trị tiệt trừ H

pylori và coi đó là biện pháp đầu tiên để phòng ngừa bệnh ung thư dạ dày ở Nhật Bản

Hàng năm ở Nhật, có gần 50.000 người chết vì ung thư dạ dày và hơn 100.000 trường

hợp ung thư dạ dày mới Điều trị tiệt trừ vi khuẩn H pylori mang lại một lợi ích khiêm

tốn là giảm được khoảng 20% đến 30% hay là ngăn chặn được hơn 20.000 trường hợp ung thư dạ dày mỗi năm, đó là lý do mà chiến lược này được nhanh chóng chấp nhận ở Nhật Thêm vào đó, Nhật là nước có tỷ lệ ung thư dạ dày và tử vong cao nên chương

trình này còn mang ý nghĩa chiến lược về mặt kinh tế-y tế góp phần giảm chi phí điều trị cho người bệnh

1.1.2 Tiên lƣợng

Tỷ lệ sống thêm của ung thư dạ dày được chẩn đoán, điều trị ở giai đoạn sớm có thể hơn 90% và ở các bệnh nhân được cắt dạ dày nhằm điều trị tận gốc vào khoảng 30% Nhìn chung, tiên lượng của ung thư dạ dày rất xấu và tỷ lệ sống thêm 5 năm sau mổ cuả bệnh nhân ung thư dạ dày là khoảng 10% trường hợp tại các nước phương Tây và 40%

ở Nhật Bản và Hàn Quốc [7] Nguyên nhân là phần lớn bệnh nhân ung thư dạ dày do chẩn đoán muộn nên ít còn có khả năng điều trị triệt để, còn các trường hợp ung thư dạ dày ở giai đoạn sớm thì rất khó phát hiện vì bệnh chỉ có ít hoặc không có triệu chứng [18]

Vì vậy việc tầm soát để theo dõi những bệnh nhân có các yếu tố nguy cơ, cũng như chẩn đoán sớm bệnh ung thư dạ dày là hết sức quan trọng và cấp thiết

1.2.3 Các yếu tố nguy cơ trong bệnh ung thƣ dạ dày

Nhiễm H pylori là điều kiện cần cho sự phát sinh ung thư dạ dày và ngoài ra còn có

thêm các yếu tố kết hợp khác trong sự phát triển ung thư dạ dày theo (sơ đồ 1)



Viêm dạ dày do nhiễm H pylori  Ung thƣ dạ dày

Sơ đồ 1.1: Các yếu tố có thể kết hợp trong ung thư dạ dày

Các yếu tố môi trường (muối, các chất sinh ung thư…)

Thời gian nhiễm H pylori (trên 20-80 tuổi)

Tình trạng chế tiết acid dạ dày (tùy theo các loại viêm dạ dày) Yếu tố di truyền của ký chủ (chủng tộc, giới…)

Độc lực của các chủng H pylori Các yếu tố nguy cơ cao của các chủng H pylori (cagA?)

Mối liên quan giữa nhiễm Helicobacter pylori (H pylori) và ung thư dạ dày đã được

xác nhận bằng các thống kê dịch tễ học, các thực nghiệm trên động vật và các nghiên

cứu trên in vivo Các phân tích gộp, các nghiên cứu bệnh-chứng đã xác nhận độ chênh thuận giữa nhiễm vi khuẩn H pylori và ung thư dạ dày Các mô hình thực nghiệm trên con Gerbil Mông cổ cho thấy nhiễm H pylori làm tăng tỷ lệ mắc bệnh ung thư dạ dày

và điều trị tiệt trừ H pylori là cần thiết để có thể ngăn ngừa sự tiến triển thành ung thư

dạ dày [3, 6]

1.2 Vai trò của nhiễm Helicobacter pylori trong ung thƣ dạ dày

Helicobacter pylori (H pylori), trực khuẩn có xoắn Gram âm có trong dạ dày

người (hình 1.1), có liên quan đến các bệnh về dạ dày-tá tràng và ung thư dạ dày Khoảng 90-95% các trường hợp loét tá tràng và 70-75% các trường hợp loét dạ dày

được cho là do nhiễm H pyori [3, 6] Từ năm 1994, H pylori đã được Tổ chức Y tế Thế

giới (WHO) xếp vào nhóm I các tác nhân gây ung thư dạ dày, với hai dạng phổ biến là u lympho (lymphoma) và ung thư biểu mô tuyến (adenocarcinoma) [25]

Hình 1.1 Vi ảnh H pylori chụp bằng kính hiển vi điện tử quét

Các chủng H pylori khác nhau có thể có độc tính khác nhau trong quá trình gây bệnh trên người Nhiều gene của H pylori được chọn để phát hiện sự hiện diện cũng

như để đánh giá độc tính của vi khuẩn này trong bệnh phẩm như các gene urease, rRNA

16S, gene bám (adhesion gene)

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung nghiên cứu hai gene cagA và vacA vì

sản phẩm của chúng được coi là hai yếu tố độc lực chủ yếu có khả năng gây bệnh, và

đặc trưng của vi khuẩn H pylori. Sự kết hợp các týp gene khác nhau giữa hai gene này

có thể liên quan đến biểu hiện lâm sàng khác nhau ở người bệnh Các chủng có biểu

hiện cagA và vacA thể hiện vai trò gây bệnh rõ rệt, và được xem như là những chủng có

độc lực cao, được xếp vào týp I, để phân biệt với các týp khác

1.3 Cơ chế bệnh sinh của nhiễm H pylori trong ung thƣ dạ dày

Các yếu tố nguyên nhân và bệnh sinh ung thư dạ dày còn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn Để giải thích được điều này, các tác giả trên thế giới hiện nay đang tập trung

nghiên cứu các yếu tố gây bệnh chủ yếu của vi khuẩn H pylori, trong đó protein VacA,

protein CagA là những tác nhân chính có khả năng gây bệnh Phần lớn các nghiên cứu

đều cho thấy nhiễm H pylori mang týp gene (genotype) có độc lực cao (sản xuất ra

protein CagA, VacA) kết hợp cùng với yếu tố ký chủ, có các thay đổi về di truyền như thay đổi về gene thì có nguy cơ gây ra ung thư dạ dày rất lớn [9, 20]

1.3.1 Gene cagA

H pylori có thể chia ra hai nhóm: sinh độc tố và không sinh độc tố là do kiểu gene biểu hiện khác nhau, nói cách khác do có hoặc không có gene cagA: chủng có mang gene cagA hay cagA-dương tính và không mang gene cagA hay cagA-âm tính Sự hiện diện của gene cagA ở một chủng thường có liên quan đến những hậu quả lâm sàng

nghiêm trọng cho người bị nhiễm [17]

Protein CagA, có kích thước 128-140 kDa, là gene độc tố trên tế bào ở vùng tiểu

đảo sinh bệnh (cagPAI: cytotoxin associated gene of pathogenicity island) có trong các chuỗi DNA của hệ gene H pylori Protein CagA được chuyển dời vào trong các tế bào

đích thông qua hệ thống cơ cấu bài tiết týp IV Khi vào trong tế bào, protein CagA bị tyrosine phosphoryl hóa, dẫn đến sự tăng sinh bất thường của các tế bào biểu mô dạ

dày., làm hư hại vùng niêm mạc dạ dày bị xâm nhiễm, gây viêm teo dạ dày, và là tiền đề quan trọng cho sự phát triển của ung thư dạ dày [3, 6, 34]

trúc gene gene vacA được phân lập có hai cặp alen ở vùng giữa (middle) gọi là m1 và

m2 và ba cặp alen khác cùng họ có trình tự ký hiệu (signal) là s1a, s1b và s2 Độc lực

cao hay thấp của gene vacA phụ thuộc vào các týp gene của hai vùng này Chủng H pylori với týp gene vacA s1/m1 cảm ứng tạo không bào mạnh hơn, làm gia tăng phản

ứng viêm và có khả năng gây bệnh cao hơn các týp gene khác Protein VacA ngăn chặn

sự tăng sinh các tế bào T và ảnh hưởng đến phản ứng miễn dịch của ký chủ dẫn đến tình trạng nhiễm dai dẳng [9, 10]

Để hiểu rõ hơn về tính đa dạng và vai trò của các týp gene vacA của H pylori liên quan đến các bệnh dạ dày, Rhead và cs [36] đã nêu lên ngoài 2 vùng giữa của gene vacA

có các týp gene là m1 hoặc m2 và vùng tín hiệu có các týp gene là s1 hoặc s2 còn có vùng trung gian (intermediate) ký hiệu là i Ở vùng trung gian có 2 cặp alen khác nhau

gồm i 1 (vacuolating) và i 2 (nonvacuolating) Tất cả các cặp gene vacA s1/m1 thuộc týp

i 1, tất cả các gene vacA s2/m2 thuộc týp i 2, và vacA s1/m2 có thể thuộc týp i 1 hoặc i

2,58 (khoảng tin cậy 95%: 1,19-5,61) Các tác giả kết luận ở các Phương Tây, nguy cơ

bệnh ung thư dạ dày có liên quan đến chủng H pylori với gene cagA EPIYA-C, tỷ số chênh 7,37 (khoảng tin cậy 95%: 1,98-27,48) ; đối với nguy cơ loét dạ dày liên quan đến vùng trung gian của gene vacA týp i 1

Liên quan giữa cagA với cấu trúc gene của vacA như sau: những chủng có dương tính đều có trình tự alen là s1 và những chủng có cagA-âm tính có trình tự alen s2 [16] Nói cách khác, chủng sinh độc tố là những chủng có cagA-dương tính thì có vacA s1và có khả năng gây bệnh cao hơn so với những chủng H pylori có cấu trúc di truyền khác [13, 16] H pylori có thể được phân định ra làm 4 týp: týp I khi có cagA-dương tính vacA-dương tính; týp II khi không có hai gene này; týp III khi cagA-dương tính vacA-âm tính; và týp IV khi cagA-âm tính vacA-dương tính Týp I ở H pylori có thể độc

cagA-hại hơn và phân lập được thường xuyên hơn từ các bệnh nhân ung thư dạ dày ở các nước phương Tây [35] Tại các nước châu Á kể cả Nhật Bản có độ lưu hành ung thư dạ

dày rất cao, hầu hết các chủng H pylori cũng thuộc týp I [6]

Bach và cs [11] nghiên cứu các chủng týp I của H pylori phân lập từ các bệnh nhân

người Áo và người Bồ Đào Nha Ở 41 chủng từ Áo, 8 trong số 14 (57,2%) phân lập từ các bệnh nhân viêm dạ dày, 14 trong số 19 (73,7%) từ các bệnh nhân loét dạ dày, và 8 trong số 8 (100%) từ các bệnh nhân ung thư dạ dày thuộc các chủng týp I Ở 39 chủng

từ Bồ Đào Nha, các số liệu tương ứng của các chủng týp I lần lượt là 8/14 (57,2%),

10/12 (83,3%), và 5/13 (38,5%) Như vậy, ở hai dân số nghiên cứu, tỷ lệ H pylori týp I

thì giống nhau ở các nhóm viêm dạ dày và loét dạ dày Tuy vậy, sự lưu hành của týp I ở các bệnh nhân ung thư dạ dày người Áo thì cao hơn có ý nghĩa (p=0,007) Sau cùng,

thử nghiệm PCR-đặc hiệu cho cagE là đáng tin cậy trong việc phát hiện cagPAI ở các chủng H pylori Tuy vậy, tại các nước châu Á kể cả Nhật Bản có độ lưu hành ung thư

dạ dày rất cao, hầu hết các chủng H pylori cũng thuộc týp I

vi khuẩn và ức chế quá trình thực bào của cơ thể chủ Một số vi sinh vật khác cũng có

thể sản sinh urease như Proteus spp., Morganella spp., Providencia, …

1.3.5 Mối liên quan giữa các gene và cơ chế bệnh sinh

Nhiều nghiên cứu thực nghiệm cho thấy rõ là các yếu tố độc hại của H pylori bao gồm sản phẩm của cagPAI, urease, VacA và lipo-polysaccharide tác động qua lại với tế

bào biểu mô dạ dày, điều này chứng tỏ là có liên quan đến quá trình sinh ung thư của dạ

dày Như đã nói ở trên, cagPAI là cụm gene độc hại chủ yếu và protein CagA được

chuyển dời vào trong các tế bào đích thông qua hệ thống cơ cấu bài tiết týp IV, được tyrosine phosphoryl-hóa và tác động như một yếu tố tăng trưởng Một trong những chức năng quan trọng của CagA là kích hoạt các đáp ứng tế bào kể cả một số lớn các biểu

hiện gene Nhiễm H pylori làm kích hoạt các yếu tố phiên mã di truyền, chẳng hạn

NF-kB (nuclear factor kappa B) kích thích tiết IL-8, IL-10, IL-12 và các phân tử tín hiệu bào

để tạo ra các yếu tố phiên mã AP-1, đưa đến sự biểu hiện của nhiều gene, chẳng hạn các gene sinh u, và các gene của COX-2 (cyclooxygenase-2), các chất kích thích hóa học và các yếu tố kháng-chết tế bào theo chương trình (antiapoptotic) Họ các protein kích hoạt

1 (activating protein 1/AP-1) của các yếu tố phiên mã giữ một vai trò trung tâm trong sự sinh sản tế bào và sự biến đổi thành ung thư Các phức hợp AP-1 gồm có các họ tiền ung thư Fos, Jun và ATF, được kích hoạt do các kích thích ngoại tế bào bao gồm các yếu tố tăng trưởng, các cytokine, và các tín hiệu của stress tế bào Dẫn đến tăng phiên

mã c-fos và tăng phosphoryl-hóa c-Jun, các protein này được coi là những sản phẩm tiền ung thư (Hình 1.2) [6]

Hình1 2 Sinh sản tế bào phụ thuộc cag PAI và sản xuất IL-8 tại các tế bào dạ dày

bị nhiễm H pylori

Dùng kỹ thuật cDNA microarray để phát hiện các dòng tế bào ung thư dạ dày bị

nhiễm H pylori, hơn 300 gene được tìm thấy có mức độ biểu hiện mRNA thay đổi tại

những thời điểm khác nhau, trong số đó 1/4 liên quan đến bộ khung tế bào, 1/3 kết hợp với chu kỳ tế bào, sự chết và phân chia của tế bào, biểu lộ IL-8 cũng được điều hòa

mạnh lên Nhiễm H pylori với cagPAI-dương tính có thể gây ra chết tế bào theo

chương trình chủ yếu là thông qua các ti thể và các tác dụng kháng-chết tế bào theo chương trình bằng kích hoạt NF-kB trong các tế bào ung thư dạ dày Biểu lộ COX-2

được điều hòa mạnh lên trong nhiễm H pylori ở các tế bào biểu mô dạ dày mà có thể

tham gia vào sự sinh ung thư dạ dày Các sản phẩm khác của gene cũng có thể chuyển dời vào trong các tế bào đích và đẩy nhanh sự sinh sản cũng như sự chết theo chương trình của tế bào

Tóm lại khi H pylori tiếp xúc với tế bào dạ dày ở người, sẽ dẫn đến: kích thích tiết

IL-8, IL-10, IL-12 do hoạt hóa yếu tố NF-kB; tiết và chuyển dời protein CagA vào trong

tế bào, rồi protein này bị tyrosine phosphoryl hóa; kích thích tạo ra các yếu tố phiên mã; sau cùng tạo ra các sản phẩm tiền ung thư c-Fos, c-Jun [3] Một số nghiên cứu gần đây

đã cho thấy một số khía cạnh mới về vai trò của nhiễm H pylori trong ung thư dạ dày, chẳng hạn như tính đa dạng của các gene H pylori, tính đa dạng di truyền của IL-1, vấn

đề chết tế bào theo chương trình, các biến đổi thuộc di truyền và thuộc qui trình biểu sinh của một quá trình nhiều bước trong sự sinh ung của dạ dày…

1.3.6 Tính đa dạng gene ở H pylori

Nghiên cứu của Yakoob và cs [43] khảo sát tính đa dạng gene của H pylori, tiến

hành trên các bệnh nhân người Trung Quốc ở bệnh viện Xiangya (Hunan) từ tháng 11/

1998 đến tháng 1/1999 Tính đa dạng DNA của các vi khuẩn được xác định bằng phương pháp “dấu ấn di truyền” theo hai phương pháp PCR-RAPD (polymerase chain reaction - random amplified polymorphic DNA) và PCR-RFLP (polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism) Từ các mẫu bệnh phẩm phân lập

được bốn mươi chủng, cho thấy tính đa dạng về gene của H pylori là hết sức lớn Một

vị trí đơn lẻ trong dạ dày thường có một chủng riêng cư trú và chủng này ngăn chặn sự

tăng trưởng của các chủng khác Tính nhạy cảm với kháng sinh của các chủng H pylori

có thể không giống nhau tại các vị trí khác nhau của dạ dày Tính đề kháng với kháng sinh có thể chuyển cho nhau giữa các chủng Nghiên cứu cho thấy là so với các nước châu Âu, ở người Trung Quốc hay gặp hơn tình trạng nhiễm đồng thời nhiều chủng vi

khuẩn H pylori

1.3.7 Vấn đề chết tế bào theo chương trình

Sugiyama và cs [40] năm 2004, có đề cập đến vấn đề chết theo chương trình của tế bào với sự sinh ung của dạ dày Theo đó, sự toàn vẹn của niêm mạc dạ dày được duy trì

do sự cân bằng giữa tỷ lệ tổn thất tế bào và tỷ lệ tái sinh hay sinh sản của tế bào H pylori có nhiều các yếu tố độc hại có thể gây tổn thất cho các tế bào biểu mô dạ dày Độc tố tạo không bào của H pylori gây độc trực tiếp cho tế bào, và monochloramine (là

sản phẩm phản ứng của các gốc oxy-hóa sinh ra từ các tế bào đa nhân trung tính thâm

nhập trong niêm mạc dạ dày với ammonium của H pylori) cũng như lipase và protease bắt nguồn từ chính H pylori đều có tác dụng gián tiếp làm thương tổn tế bào qua cơ chế

miễn dịch Nghiên cứu hóa mô miễn dịch trên niêm mạc dạ dày tự nhiên cho thấy sự tăng biểu lộ của các thụ thể CD95 (Apo-1/Fas) trong các tế bào biểu mô và trong các limphô bào của lớp cận niêm gây độc hại cho tế bào qua trung gian tế bào T Ngoài ra,

H pylori có khả năng trực tiếp gây ra sự chết theo chương trình của tế bào thông qua sự kích hoạt của họ caspase, nhất là caspase-9 và caspase-3 H pylori còn có thể làm điều hòa mạnh lên sự biểu hiện Smad5, gây ra sự chết theo chương trình của các tế bào biểu

mô dạ dày (Hình 1.3), [31]

Hình 1 3: Động học tế bào biểu mô dạ dày nhiễm H pylori trong ung thư dạ dày

Các tác giả cũng đã xác định là chỉ có các chủng H pylori cagPAI-dương tính mới

có khả năng đem lại Smad5 mRNA cũng như gây ra sự chết theo chương trình của các

tế bào dạ dày ở người CagA là protein của H pylori duy nhất được biết là chuyển vị từ

vi khuẩn vào trong tế bào qua hệ thống bài tiết týp IV và có thể nghĩ rằng sự chuyển vị

này là cần thiết cho sự điều hòa mạnh lên của Smad5 ở các tế bào biểu mô dạ dày Nghiên cứu động học tế bào của niêm mạc dạ dày bị nhiễm vi khuẩn H pylori cho thấy

sự chết theo chương trình và sự sinh sản của các tế bào biểu mô dạ dày cả hai đều tăng nhanh tương xứng với mức độ teo của niêm mạc dạ dày [42]

Tuy vậy, sự chết theo chương trình nói chung bị ức chế ở các tế bào ung thư trong khi sự sinh sản của tế bào biểu mô dạ dày vẫn tiếp tục nhanh và tiến triển thành ung thư

dạ dày Sau khi chuyển sang giai đoạn không thể đảo ngược trong một chuỗi các trình tự viêm dạ dày-viêm teo-ung thư (điểm không thể trở lại) thì việc điều trị tiệt trừ vi khuẩn

H pylori có thể không còn có tác dụng nữa trong việc đề phòng sự tiến triển thành ung

thư

Như vậy, một nghiên cứu về các cơ chế chết tế bào theo chương trình do nhiễm H pylori có thể là đầu mối quan trọng cho việc chọn ra những người nào cần được tiệt trừ

để đề phòng có hiệu quả sự tiến triển thành ung thư, bởi vì đứng về mặt tài chính, không

thể điều trị tiệt trừ cho tất cả mọi người bị nhiễm H pylori không triệu chứng

1.4 Các nghiên cứu về ung thư dạ dày liên quan nhiễm H pylori trong nước

Ở Việt Nam, ước tính mỗi năm có khoảng 15 000-20 000 người bị ung thư dạ dày Tại Hà Nội giai đoạn 1993-1995, theo Đoàn Hữu Nghị, tỷ lệ mắc ung thư dạ dày ở nam

là 25,7/100 000 dân so với 12,5/100 000 dân ở nữ [3] Tại thành phố Hồ Chí Minh năm

1997, theo Nguyễn Chấn Hùng và cs [2] tỷ lệ mắc ung thư dạ dày là 18,8/100 000 dân ở nam và là 7,3/100 000 dân ở nữ

Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ nhiễm H pylori cao, và ung thư dạ dày

hiện đang là một vấn đề lớn trong các bệnh ung thư đường tiêu hoá Cho đến nay, việc nghiên cứu để hiểu rõ hơn về bệnh sinh của ung thư dạ dày và tìm kiếm những chiến lược can thiệp có hiệu quả để phòng ngừa ung thư dạ dày là những vấn đề hết sức quan trọng và cấp thiết tại nước ta

Nguyễn Xuân Vinh [8], trên 118 bệnh nhân ung thư dạ dày, có tỷ lệ chẩn đoán

huyết thanh H pylori-dương tính là 93,2% Nghiên cứu cho thấy ở người nhiễm H pylori, nguy cơ ung thư dạ dày cao gấp 5 lần so với người không bị nhiễm với tỷ suất

chênh là 5,34 (khoảng tin cậy 95%, 2,34-12,1) Tác giả cho rằng có sự liên quan giữa

nhiễm H pylori với ung thư dạ dày, và đưa ra kiến nghị là đối với những người nhiễm

H pylori có các yếu tố nguy cơ cao như lớn tuổi, viêm loét dạ dày, hay trong tiền sử gia đình có người bị ung thư dạ dày thì cần điều trị tiệt trừ vi khuẩn H pylori càng sớm

càng tốt

Tạ Long và cs [4] nghiên cứu mối liên quan giữa ung thư dạ dày và nhiễm H pylori,

trong thời gian từ tháng 3/2003 đến tháng 4/2004, tại các bệnh viện Trung ương Quân đội 108, bệnh viện Bưu điện và bệnh viện Việt Đức-Hà nội Có 208 bệnh nhân, được chia làm 2 nhóm: (1) 104 ung thư dạ dày; và (2) 104 viêm dạ dày mạn tính xác định

bằng mô bệnh học Chẩn đoán H pylori thực hiện bằng nội soi dạ dày-tá tràng và làm các thử nghiệm CLOtest, mô bệnh học, PCR và chẩn đoán huyết thanh Tỷ lệ H pylori-

dương tính trên chẩn đoán huyết thanh ở nhóm ung thư dạ dày và nhóm viêm dạ dày mạn lần lượt là 90,6% và 88,1% (p=0,76), trên CLOtest là 55,1% và 44,5% (p=0,43), và trên mô bệnh học là 71,1% và 57,6% (p=0,04) Trong số 104 trường hợp ung thư dạ dày, týp ruột theo phân loại Lauren là 81,7% và týp lan tỏa chỉ là 18,3% Ba mươi tám

mẫu được gửi làm PCR tại Đại học Fukui (Nhật Bản), cho thấy týp cagA-dương tính Á

đông có khả năng gây bệnh viêm dạ dày chiếm tỷ lệ 82,3%, cao hơn so với 47,6% trong ung thư dạ dày Trong ung thư dạ dày, tỷ lệ gặp viêm dạ dày mạn tính hoạt động ở các mức độ vừa và nặng là 55,7%, cao hơn so với 40,1% gặp viêm dạ dày mạn (p=0,05)

Các tác giả kết luận là có mối liên quan giữa nhiễm H pylori với ung thư dạ dày

Ở Việt Nam, nghiên cứu của Trần Ngọc Ánh [1] năm 2006 cho thấy tỷ lệ H pylori týp I trong ung thư dạ dày là 78,6% cao hơn trong viêm dạ dày là 33,3%, tỷ lệ H pylori

có cagA-dương tính và vacA-dương tính ở nhóm bệnh nhân ung thư dạ dày lần lượt là

80,9% và 97,6%, cao hơn ở nhóm bệnh nhân viêm dạ dày là 47,6% và 52.3% (p<0,05),

nguy cơ ung thư dạ dày cao gấp 4,86 lần với cagA-dương tính và gấp 32,27 lần với vacA-dương tính so với nhiễm H pylori cagA-âm tính vacA-âm tính Tuy nhiên hạn chế

trong nghiên cứu của tác giả là chưa có điều kiện phân tích các phân týp của vacA nhằm đánh giá đầy đủ hơn về vai trò của týp H pylori cagA-dương tính và vacA-dương tính

trong bệnh ung thư dạ dày

Nghiên cứu của Tạ Long và cs [3] cho thấy tỷ lệ nhiễm H pylori týp I trong loét dạ

dày là 73,3%, tương đương với trong ung thư dạ dày là 75%, và cao hơn trong viêm dạ dày là 46,7%

Tóm lại :

Các nghiên cứu dịch tễ học vào cuối thập niên những năm 1990 đã nêu lên mối liên

quan giữa nhiễm H pylori và ung thư dạ dày ở người Các nghiên cứu thực nghiệm trên gerbil Mông Cổ cũng đã chỉ ra mối liên quan này và việc tiến hành điều trị tiệt trừ H pylori là cần thiết để có thể ngăn ngừa sự tiến triển thành ung thư dạ dày

Điều trị tiệt trừ H pylori có nhiều hứa hẹn trong phòng ngừa ung thư dạ dày Cần có

những nghiên cứu tiếp tục và phải được theo dõi lâu dài để làm sáng tỏ nguồn gốc cũng như các điều kiện để viêm dạ dày tiến triển thành các thương tổn tiền ung thư và ung thư như đã được biết đến trong các nghiên cứu của những thập kỷ qua

Các yếu tố sinh ung khác có thể kết hợp với nhiễm H pylori trong bệnh ung thư dạ dày, nhưng các yếu tố độc lực cao của các chủng H pylori có khả năng gây bệnh đóng

vai trò quan trọng trong bệnh sinh của ung thư dạ dày cần được nghiên cứu và làm sáng

tỏ thêm

1.5 Tính cấp thiết của đề tài

Như đã trình bày ở trên, bệnh ung thư dạ dày thường chẩn đoán muộn, chẩn đoán sớm ung thư dạ dày còn rất nhiều khó khăn trong điều kiện và hoàn cảnh ở nước ta hiện nay kể cả ở các nước phát triển Việc chẩn đoán ung thư dạ dày ở giai đoạn muộn dẫn đến ít còn khả năng điều trị triệt để và tiên lượng sống thêm sau mổ ung thư dạ dày rất

xấu Định danh các týp gene của vi khuẩn H pylori và nghiên cứu ý nghĩa bệnh học của

các týp gene này trong ung thư dạ dày nhằm :

1 Góp phần nghiên cứu về bệnh sinh của ung thư dạ dày với các týp gene mắc phải

có nguy cơ cao

2 Liên quan giữa các týp gene với các thương tổn mô bệnh học niêm mạc dạ dày

3 Sự biểu hiện của các týp gene của vi khuẩn H pylori trên nhóm chứng bệnh nhân

viêm dạ dày có H pylori-dương tính

Từ đó có thể ứng dụng để tiếp tục nghiên cứu, theo dõi và tầm soát những bệnh nhân

viêm dạ dày H pylori-dương tính với các týp gene mắc phải có nguy cơ cao nhằm chẩn

đoán sớm bệnh ung thư dạ dày

Là một trong số các Trường Đại học Y khoa trong nước, Đại học Y Dược thành phố

Hồ Chí Minh có một đội ngũ khoa học nhiều kinh nghiệm trong lĩnh vực Y học lâm sàng cùng với việc hợp tác với các Trường Đại học bạn trong nghiên cứu y học cơ sở và ứng dụng những tiến bộ khoa học trong lĩnh vực Y-Sinh học phân tử

Dựa trên định hướng và khả năng phát triển của Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh kết hợp với Trường Đại học Khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, Dựa trên

tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu « Định danh các týp gene của Helicobacter pylori

và ý nghĩa bệnh học trong ung thư dạ dày » Đây là một công trình có tính khoa học và

giá trị thực tiễn cao với việc ứng dụng sinh học phân tử để giải quyết một vấn đề cấp thiết và cụ thể đặt ra trong xu hướng phát triển chung của nền Y học Việt Nam nhằm phục vụ sự nghiệp chăm sóc sức khỏe của người dân

Vì vậy việc Định danh các týp gene của vi khuẩn Helicobacter pylori trong ung thư

dạ dày và nghiên cứu ý nghĩa bệnh học của các týp gene này để từ đó có kế hoạch tầm soát và theo dõi những bệnh nhân có các yếu tố nguy cơ cao, cũng như chẩn đoán sớm bệnh ung thư dạ dày là hết sức quan trọng và cấp thiết

1.6 Ý nghĩa và tính mới về khoa học và thực tiễn

Dựa trên việc ứng dụng sinh học phân tử để định danh các týp gene của vi khuẩn

Helicobacter pylori trong ung thư dạ dày Việc định danh các týp gene, đặc biệt là gene cagA-dương tính hoặc âm tính kết hợp với các týp gene vacA mà sự xuất hiện của các

týp này có liên quan đến biểu hiện lâm sàng khác nhau của bệnh viêm, loét hoặc ung thư

dạ dày Đó là tiền đề hết sức quan trọng mở ra hướng nghiên cứu mới nhằm tìm hiểu chủng có nguy cơ cao trong đặc điểm bệnh tật-ung thư dạ dày ở người bệnh Việt Nam Công trình nghiên cứu ngoài tính khoa học còn có giá trị thực tiễn dựa trên các týp gene có độc lực cao với mối liên quan đến ung thư dạ dày, trên cơ sở đó đặt ra kế hoạch

theo dõi và tầm soát ở các nhóm bệnh nhân khác nhau để giúp chẩn đoán và phát hiện sớm bệnh ung thư dạ dày Đó cũng chính là việc áp dụng những tiến bộ của khoa học trong lĩnh vực sinh học phân tử vào thực tiễn lâm sàng để phục vụ công tác chăm sóc sức khỏe người bệnh Vì vậy công trình ngoài ý nghĩa khoa học và thực tiễn còn mang tính xã hội và nhân văn

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP

VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2 1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Trong khoảng thời gian từ tháng 12/2008 đến tháng 8/2010, tại Bệnh viện Đại học

Y Dược TP Hồ Chí Minh kết hợp với Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình multiplex PCR ; và nghiên

cứu định danh các týp gene của vi khuẩn H pylori ở 2 nhóm bệnh nhân viêm dạ dày và

ung thư dạ dày Bệnh nhân được đưa vào nghiên cứu cư ngụ tại thành phố Hồ Chí Minh

và các tỉnh thành thuộc khu vực miền Nam Việt Nam

2 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Như vậy : Trong tiêu chuẩn chọn bệnh phải đáp ứng đủ 2 điều kiện : (1) ung

thư dạ dày biểu mô tuyến ; và (2) H pylori-dương tính

Tiêu chuẩn loại trừ

Không đủ dữ liệu, bệnh phẩm không đạt về kích thước và yêu cầu bảo quản đặt

ra; Các trường hợp loại trừ khác như ung thư dạ dày có H pylori-âm tính

Tiêu chuẩn chẩn đoán nhiễm vi khuẩn H pylori

- Hai mẫu mô (1 ở hang vị và 1 thân vị) làm CLO test chẩn đoán H pylori

- Hai mẫu mô làm mô bệnh học (1 mô bệnh và 1 mô lành- thân vị, cách thương tổn u ít nhất 5 cm) Mô bệnh xác định ung thư biểu mô tuyến; mô lành chẩn

đoán nhiễm vi khuẩn H pylori và xác định các thương tổn mô bệnh học niêm

mạc dạ dày: viêm teo, chuyển sản ruột, nghịch sản và mức độ biệt hóa (ác tính) của ung thư dạ dày

- Hai mẫu mô (1 mô bệnh và 1 mô lành- thân vị, cách thương tổn u ít nhất 5 cm)

được gửi làm Multiplex PCR để chẩn đoán H pylori và định týp gene

- Như vậy, H pylori-dương tính được định nghĩa khi cả ba thử nghiệm hoặc 2

trong 3 thử nghiệm nói trên dương tính, trong đó điều kiện bắt buộc là thử

nghiệm PCR-dương tính

2.2.2.2 Nhóm chứng -Viêm dạ dày

- Bệnh nhân được nội soi dạ dày, sinh thiết từ 3-6 mẫu mô ở vùng hang vị

- Một mẫu (nếu không đủ kích thước lấy 2 mẫu mô) làm CLOtest chẩn đoán

nhiễm vi khuẩn H pylori

- Một mẫu (nếu không đủ kích thước lấy 2 mẫu mô) gửi làm mô bệnh học chẩn

đoán nhiễm vi khuẩn H pylori và xác định các thương tổn mô bệnh học niêm

mạc dạ dày: viêm teo, chuyển sản ruột, nghịch sản Kết quả mô bệnh học được đọc do một bác sĩ Bộ môn giải phẫu bệnh-Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh sau khi đã thống nhất các tiêu chuẩn chẩn đoán các thương tổn nêu trên

- Một mẫu (nếu không đủ kích thước lấy 2 mẫu mô) của nhóm bệnh nhân viêm dạ dày gửi phát hiện týp gene bằng Multiplex PCR và định týp gene

- Để đáp ứng tiêu chuẩn và qui cách lấy mẫu chính xác, chúng tôi tập huấn và chọn

2-3 bác sĩ nội soi lấy mẫu Số lượng mẫu viêm dạ dày có H pylori-dương tính

chỉ lấy cho đến khi đủ theo thiết kế nghiên cứu

2.2.3 Cỡ mẫu trong nghiên cứu được tính dựa vào Statcalc trong phần mềm EPI-IFNO

phiên bản 3.5.1 Công thức tính cỡ mẫu dùng trong nghiên cứu bệnh – chứng:

- p1: tỉ lệ tiếp xúc với yếu tố nguy cơ trong nhóm bệnh, chọn p1 = 81%

- P2: tỉ lệ tiếp xúc với yếu tố nguy cơ trong nhóm chứng, chọn p2 = 48%

Suy ra tỷ số độ chênh OR = 4,62

– r: tỉ số giữa nhóm bệnh và nhóm chứng, để nghiên cứu khả thi chọn r = 1:1

Như vậy cỡ mẫu cần thu thập tính cho cả 2 nhóm là 156 trường hợp, trong đó

- 78 trường hợp thuộc nhóm bệnh-ung thư dạ dày, và

- 78 trường hợp nhóm chứng-viêm dạ dày

2 3 NỘI DUNG TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU

2.3.1 Xây dựng quy trình Multiplex PCR định danh các týp gen của H.pylori

2.3.1.1 Các chủng vi khuẩn chứng

- H pylori gồm 2 chủng :

(1) J99 (ATCC 700824) có kiểu gene cagA+, vacA s1m1, urease+

(2) Tx30a (ATCC 51932) có kiểu gene cagA-, vacA s2m2, urease+

- E coli (ATCC 25922 và ATCC 35218)

- Klebsiella pneumoniae (ATCC 700603)

- Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853)

- Salmonella typhimurium (ATCC 13311)

- Clostridium perfringens : mẫu thực địa đã giải trình tự

2.3.1.2 Mồi

Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu được tổng hợp tại công ty IDT (Integrated DNA Technologies - Hoa kỳ-xem trong quy trình)

2.3.1.3 Xử lý mẫu sinh thiết

Mẫu sinh thiết dạ dày được xử lý để : (1) bảo quản trong thời gian vận chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm, (2) tạo thuận lợi cho quá trình tách chiết DNA tiếp theo

Mẫu sinh thiết, có kích thước khoảng 3-5 mm, được cho vào các eppendorf 1,5

ml chứa sẵn dung dịch PBS 1X Sau đó bổ sung 1 trong 3 loại dung dịch xử lý mô : (1)

10 µl proteinase K (10 µg/ml); (2) 200 µl TE, 40 µl SDS 10%, 10 µl proteinase K (10 µg/ml); và (3) 200 µl TE và 40 µl SDS 10% Mô sau đó được cắt thật nhỏ, vortex mạnh trong 10-15 giây và ủ ở nhiệt độ 700C trong 1-2 giờ Sau giai đoạn này, có thể tiến hành tách chiết DNA ngay hoặc giữ ở âm 200C cho đến khi tách chiết

2.3.1.4.T ách chiết DNA H pylori

Hai phương pháp tách chiết DNA được khảo sát là tách chiết dựa trên dung môi hữu cơ phenol-chloroform (gọi tắt là tách chiết tủa) và tách chiết dựa trên sự hấp phụ DNA lên màng silica (gọi tắt là tách chiết cột)

Quy trình tách chiết tủa : 100 µl dung dịch xử lý mẫu sinh thiết được cho vào

eppendorf 1,5 ml ; thêm vào 900 µl Trizol (phenol pH8), vortex mạnh và ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng; tiếp đến cho vào 200 µl chloroform và lắc đều; ly tâm 13.000

vòng/10 phút ; 600 µl dịch nổi được chuyển vào một eppendorf 1,5 ml mới; thêm vào

900 µl ethanol tuyệt đối và ủ trong 10 phút ở nhiệt độ âm 20oC ; ly tâm 13.000 vòng/10 phút để thu tủa DNA ; rửa tủa bằng 600 µl dung dịch ethanol 70o ; làm khô 10 phút ởnhiệt độ 60oC ; hòa tan tủa trong 50 µl TE và giữ ở 4oC hoặc âm 20oC tùy theo thời gian bảo quản

Quy trình tách chiết cột : 100 µl dung dịch xử lý mẫu sinh thiết được cho vào

eppendorf 1,5 ml; thêm vào 100 µl dung dịch ly giải tế bào (guanidinium hydrochloride 6M), vortex mạnh và ủ trong 10 phút ở nhiệt độ 70oC ; thêm vào 50 µl isopropanol và chuyển toàn bộ hỗn hợp vào cột tách chiết ; ly tâm 8.000 vòng/1 phút; rửa cột lần 1 bằng dung dịch rửa (guanidinium hydrochloride 3M), rửa cột lần 2 bằng ethanol 70o

; dung giải bằng 50 µl TE ở nhiệt độ 70oC trong 20 phút và giữ ở 4oC hoặc âm 20oC tùy theo thời gian bảo quản

2.3.1.5 Quy trình PCR

Kỹ thuật PCR sử dụng trong nghiên cứu bao gồm PCR monoplex (sử dụng mộtcặp mồi đặc hiệu cho một trình tự mục tiêu), và PCR multiplex (sử dụng nhiều cặp mồi nhân bản cho nhiều trình tự mục tiêu trong một phản ứng)

DNA bộ gene H pylori sau khi tách chiết được dùng để tiến hành phản ứng PCR

monoplex và multiplex trong hệ thống PCR CFX96TM

Real-Time (BioRad)

Quy trình PCR monoplex: Hỗn hợp phản ứng monoplex PCR bao gồm 1U Taq

DNA polymerase (Bio-Rad), 200 µM dNTP, 2 mM MgCl2, 1X PCR Buffer, 200 nM mỗi loại mồi xuôi và ngược (IDT) là một trong những cặp mồi đặc hiệu cho các gene

cagA, vacA s1/s2, vacA m1/m2, chứng nội hGST (glutathione-S-transferase) và 5 µl

DNA tách chiết trong tổng thể tích phản ứng là 25 µl

Quy trình PCR multiplex : Hỗn hợp phản ứng multiplex PCR bao gồm 1U Taq

DNA polymerase (Bio-Rad), 200 µM dNTP, 2 mM MgCl2, 1X PCR Buffer, 200 nM

mỗi loại mồi xuôi và ngược (IDT) gồm các cặp mồi đặc hiệu cho các gene cagA, vacA s1/s2, vacA m1/m2, 50 nM mồi chứng nội hGST và 5 µl DNA tách chiết trong tổng thể

tích là 25 µl

Chương trình nhiệt cho phản ứng monoplex và multiplex PCR : 3 phút 30 giây

ở 950C, 40 chu kỳ lặp lại gồm 20 giây ở 940C, 40 giây ở 600C và 40 giây ở 720C, và cuối cùng là 6 phút ở 720C Chứng dương trong các phản ứng PCR là DNA tách chiết từ

các chủng H pylori ATCC, với các sản phẩm nhân bản có týp gene cagA (+), vacA s1m1 và cagA (+), vacA s2m2 Chứng âm trong các phản ứng PCR là nước cất hai lần

đã khử trùng

2.3.1.6 Thiết kế mồi

Chúng tôi thiết kế các cặp mồi HP4-F/R, HP6-F/R, HP7-F/R, HP8-F/R,

HP10-F/R lần lượt dựa trên các vùng gene urease, cagA, vacA s1/s2, vacA m1/m2, smad4

Việc thiết kế được thực hiện bằng các phần mềm chuyên dụng như ClustalX, Primer3, Bioedit, Annhyb, Oligo Analyzer, BLAST và Primer-BLAST

Trước tiên, các trình tự chứng NCBI của các gene mong muốn (Phụ lục 1) được

nạp xuống máy và sắp gióng cột để xác định các trình tự bảo tồn bằng ClustalX Sau khi xác định được vùng trình tự mong muốn, chọn trình tự đó để thiết kế mồi bằng công cụ Primer-BLAST của NCBI và Primer3 Mồi được chọn theo các chỉ tiêu mong muốn với phần mềm Oligo Analyzer Đánh giá khả năng bắt cặp của mồi đã thiết kế với các trình

tự chứng NCBI bằng phần mềm Annhyb, Bioedit và BLAST

2.3.1.7 Phương pháp điện di trên gel agarose

Sản phẩm nhân bản được quan sát qua điện di trên gel agarose 5% nhuộm ethidium bromide (0,2 mg/mL) với thang phân tử 100 bp (Bio-Rad)

2.3.1.8 Giải trình tự

Mẫu DNA H pylori chứng trong các phản ứng PCR là các sản phẩm nhân bản có týp gen cagA (+) vacA s1m1 và cagA (+) vacA s1m2 được xác định giải trình tự Các

sản phẩm này được gửi đi giải trình tự tại công ty Macrogene (Hàn Quốc)

2.3.2 Xác định các týp gene của H pylori

Việc phát hiện và định týp H pylori có thể được thực hiện bằng nhiều phương

pháp như giải trình tự, PCR và lai phân tử với mẫu dò đặc hiệu Trong nghiên cứu này,

chúng tôi xây dựng quy trình (Sơ đồ 2.1) phát hiện và định týp gene cagA và vacA của

H pylori từ mẫu sinh thiết dạ dày của bệnh nhân viêm và ung thư dạ dày có H

pylori-dương tính bằng kỹ thuật multiplex PCR, cho phép phát hiện và định týp đồng thời các

gene vacA và cagA chỉ trong một phản ứng Quy trình này nhằm tìm hiểu mối liên quan giữa các týp gene cagA và vacA với các biểu hiện lâm sàng ở bệnh nhân ung thư và

viêm dạ dày Bên cạnh đó, quy trình còn là cơ sở để phát triển một phương pháp chaån

đoán nhanh và chính xác tình trạng nhiễm H pylori

Kết quả áp dụng quy trình trên một số bệnh phẩm của bệnh nhân viêm và ung thư dạ

dày trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy ưu thế của týp gene cagA (+), vacA s1m1;

và cagA (+), vacA s1m2

2.4 XỬ LÝ SỐ LIỆU VÀ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ

Dữ liệu thu thập được nhập, xử lý và phân tích bằng phần mềm SPSS 15.0 Các phép kiểm T-test, Fisher’s exact, chi bình phương (χ2 ) được dùng trong nghiên cứu có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05 Xác định các yếu tố nguy cơ bằng tỷ số chênh (Odds Ratio) với khoảng tin cậy 95%

Sơ đồ 2.2 Quy trình định týp gen bao gồm các bước

Xử lý mẫu sinh thiết:

Tách chiết DNA H pylori:

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Trong khoảng thời gian từ tháng 12/2008 đến tháng 8/2010, tại Bệnh viện Đại học

Y Dược TP Hồ Chí Minh kết hợp với Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình multiplex PCR ; và nghiên

cứu định danh các týp gen của vi khuẩn H pylori ở 2 nhóm bệnh nhân ung thư dạ dày

và viêm dạ dày

Kết quả nghiên cứu và thảo luận được trình bày với 3 nội dung chính sau đây :

3 1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH MULTIPLEX PCR

ĐỊNH DANH TÝP GENE CỦA VI KHUẨN H PYLORI

Để xây dựng quy trình phát hiện và định týp H pylori, chúng tôi đã tiến hành các

nội dung như sau:

(1) Khảo sát các điều kiện thu và xử lý mẫu bao gồm: khảo sát vị trí lấy mẫu và các loại dung dịch xử lý mẫu

(2) Khảo sát các phương pháp tách chiết DNA

(3) Xây dựng quy trình monoplex PCR gồm: đánh giá hiệu quả nhân bản của các cặp mồi, khảo sát sự đặc hiệu của các mồi và hoạt động phản ứng monoplex PCR với từng cặp mồi riêng biệt

(4) Xây dựng quy trình multiplex PCR gồm: khảo sát nồng độ các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR, nồng độ MgCl2 và nhiệt độ lai cho kết quả nhân bản tốt nhất (5) Đánh giá độ nhạy của quy trình và so sánh kết quả với kit thương mại

(6) Áp dụng quy trình trên một số mẫu lâm sàng

3.1 1 Khảo sát các điều kiện thu và xử lý mẫu

3.1.1.1 Khảo sát vị trí lấy mẫu

Hai mẫu, một thu nơi mô lành và một thu nơi mô bệnh của mỗi bệnh nhân, được

khảo sát nhằm xác định vị trí lấy mẫu cho xác suất phát hiện H pylori cao nhất Mỗi vị

trí được lấy lặp lại 2 lần Kết quả được thể hiện ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát sự hiện diện của H pylori ở hai vị trí lấy mẫu

Kết quả cho thấy trên tổng số 36 mẫu được khảo sát từ 18 bệnh nhân, tỉ lệ phát

hiện H pylori trên mô lành cao hơn so với mô bệnh Bên cạnh đó, trên cùng một bệnh

nhân có thể có kết quả khác nhau trên hai mẫu lặp lại, cả ở mô lành và mô bệnh nhưng khác biệt giữa hai lần thu mẫu lớn hơn ở mô bệnh Hiện tượng này đã được ghi nhận trong các nghiên cứu trước đây về tình trạng nhiễm “khảm” thấy ở các trường hợp

nhiễm H pylori Kết quả (Phụ lục 2) cho thấy 6 trường hợp cho kết quả khác biệt giữa

hai lần lấy mẫu trên mô bệnh, 3 trường hợp cho kết quả tương tự trên mô lành

3.1.1.2 Khảo sát các loại dung dịch xử lý mẫu

Sáu mẫu sinh thiết ung thư dạ dày, có kết quả H pylori dương tính bằng thử

nghiệm CLO test và giải phẫu bệnh được xử lý với ba loại dung dịch xử lý mẫu khác nhau DNA được tách chiết lần lượt từ các dịch xử lý mẫu bằng phương pháp tủa, định lượng bằng phương pháp đo mật độ quang, và nhân bản bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu

cho gene urease Cả 6 mẫu đều cho kết quả dương tính với H pylori Kết quả minh họa

được trình bày trong hình 3.4

Hình 3.4 Điện di sản phẩm PCR từ 2 mẫu sinh thiết được xử lý bằng 3 dung

dịch xử lý (1) Proteinase K (10 µg/ml); (2) SDS 10%, proteinase K (10 µg/ml); (3) SDS 10%.Giếng 1, 2 và 3 : mẫu 1 xử lý với 3 dung dịch ; giếng 4, 5 và 6 : mẫu 2 xử lý tương

tự mẫu 1 ; giếng 7 : chứng âm ; giếng 8 : chứng dương

Kết quả từ hình 3.4 cho thấy 3 dung dịch tiền xử lý mẫu cho kết quả định tính không khác biệt Tuy nhiên, sử dụng dung dịch (3) sẽ cho phép giảm chi phí và tạo sự

ổn định tốt hơn cho việc triển khai ứng dụng thực tế Chúng tôi chọn điều kiện xử lý mẫu bằng dung dịch (3) cho các bước nghiên cứu tiếp theo

3.1.2 Khảo sát các phương pháp tách chiết DNA

Sáu mẫu nêu trong nội dung 3.1.2 được sử dụng để khảo sát 2 phương pháp tách chiết tủa và cột Một thể tích tương đương dịch xử lý các mẫu được sử dụng cho 2 quy trình tách chiết Kết quả minh họa được trình bày trong hình 3.5

Hình 3.5 Điện di sản phẩm PCR từ DNA tách chiết bằng 2 phương pháp trên

dịch xử lý của một số mẫu Giếng 1, 2, 3 : mẫu 1, 2, 3 tách chiết cột ; giếng 4, 5, 6 : mẫu 1, 2, 3 tách chiết tủa ; giếng 7 : chứng âm ; giếng 8 : chứng dương

Kết quả từ hình 3.5 cho thấy cả hai phương pháp tách chiết đều cho hiệu quả tương đương về mặt định tính Mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm Phương pháp tách chiết tủa là phương pháp truyền thống, dễ sử dụng, hiệu quả thu hồi cao, nhưng độ sạch của mẫu không cao Trong một số trường hợp có thể giữ lại một số tạp chất ức chế phản ứng PCR, ngoài ra còn có bất lợi là sử dụng hóa chất độc Phương pháp tách chiết cột cho phép thu mẫu với độ sạch cao và không sử dụng hóa chất độc nhưng chi phí cao hơn

3.1.3 Xây dựng quy trình PCR monoplex

3.1.3.1 Đánh giá hiệu quả nhân bản của các cặp mồi

Chúng tôi so sánh hiệu quả nhân bản của 2 cặp mồi cho mỗi gene Tiêu chí để chọn cặp mồi phù hợp là cho sản phẩm nhân bản đặc hiệu có hàm lượng cao, không có sản phẩm ký sinh

Các mẫu dùng cho khảo sát này là DNA từ 2 chủng H pylori J99 (ATCC 700824) có kiểu gene cagA (+), vacA s1m1; urease (+), và chủng Tx30a (ATCC 51932)

có kiểu gene cagA (-), vacA s2m2; urease (+) ; và DNA từ 2 chủng lâm sàng đã được giải trình tự, có kiểu gene là cagA (+), vacA s1m1, urease (+); và cagA (+), vacA s1m2, urease (+) Hai cặp mồi nhân bản hai gene chứng nội cũng được so sánh

Hình 3.6 Điện di sản phẩm PCR trên 2 chủng H pylori ATCC với từng cặp mồi

Hình 3.6A Sản phẩm PCR với 2 cặp mồi đặc hiệu cho vacA s1/s2, HP2-F/R và F/R Hình 3.6 B Sản phẩm PCR với 2 cặp mồi đặc hiệu cho vacA m1/m2, HP3-F/R và HP8-F/R Hình 3.6 C Sản phẩm PCR với 2 cặp mồi đặc hiệu cho gene urease, HP-4F/R

HP7-và HP9-F/R Hình 3.6 D Sản phẩm PCR với 2 cặp mồi đặc hiệu cho cagA, HP1-F/R HP7-và HP6-F/R Hình 3.6 E Sản phẩm PCR với 2 cặp mồi đặc hiệu cho 2 gene chứng nội h- GST và smad4, HP5-F/R và HP10-F/R

Đối với vùng gene cagA và vacA s1/s2 và m1/m2 thì các cặp mồi HP1-F/R, F/R, HP3-F/R cho kết quả đúng theo tiêu chí chọn lựa Đối với gene urease và 2 gene

HP2-chứng nội các cặp mồi khảo sát cho hiệu quả nhân bản như nhau

Chúng tôi chọn các cặp mồi sau cho các nội dung tiếp theo: HP1-F/R, HP2-F/R, HP3-F/R, HP4-F/R, HP5-F/R

E

3.1.3.2 Khảo sát sự đặc hiệu của phản ứng nhân bản

Sự đặc hiệu của phản ứng PCR được xác định thông qua hai tiêu chí: (1) sự đặc hiệu của mồi thể hiện qua khả năng nhân bản và chỉ nhân bản trình tự mục tiêu trên chủng vi khuẩn xác định; (2) sự đặc hiệu của sản phẩm nhân bản thể hiện qua mức độ tương đồng cao với các trình tự gene tương ứng trong Ngân hàng dữ liệu gene

Để xác định độ đặc hiệu của các cặp mồi sử dụng, chúng tôi thực hiện phản ứng

PCR trên DNA từ 2 chủng H pylori ATCC J99 vàTx30a ; đồng thời trên DNA từ E coli, Salmonella typhimurium, Clostridium perfringens, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa

Hình 3.7 Điện di sản phẩm PCR từ DNA H pylori và DNA từ các vi khuẩn khác

Hình 3.7A Sản phẩm PCR từ DNA H pylori và từ DNA các vi khuẩn khác với các cặp mồi đặc trưng cho H pylori ; Hình 3.7B Sản phẩm PCR từ DNA vi khuẩn E coli, Salmonella typhimurium, Clostridium perfringens với các cặp mồi đặc trưng cho các vi khuẩn này

A

B

Kết quả từ hình 3.7A cho thấy các cặp mồi khảo sát chỉ nhân bản những trình tự

gene mục tiêu của H pylori, không cho phép nhân bản DNA của các loại vi khuẩn khác

mặc dù chất lượng các DNA này vẫn cho phép quá trình nhân bản với các cặp mồi phù hợp trong hình 3.7B

Tính đặc hiệu của sản phẩm nhân bản được xác định bằng cách đem giải trình tự

và so sánh với các trình tự công bố trên Ngân hàng dữ liệu gene NCBI (Phụ lục 3) Kết

quả minh họa được trình bày trong hình 3.8 cho thấy sản phẩm PCR chúng tôi thu được

có độ tương đồng cao với trình tự trên vùng gene tương ứng công bố trên NCBI

Hình 3.8 Trình tự nucleotide của sản phẩm PCR với cặp mồi vacA m1/m2 so sánh với

trình tự công bố trên NCBI

3.1.3.3 Phản ứng PCR monoplex với các cặp mồi riêng biệt

Chúng tôi xây dựng phản ứng PCR monoplex với từng cặp mồi Thành phần phản ứng PCR là thành phần cơ bản thường được sử dụng trong các công trình trước đây Trong chương trình nhiệt, chúng tôi khảo sát nhiệt độ lai để tìm nhiệt độ lai tối ưu cho từng cặp mồi Nhiệt độ lai tối ưu là nhiệt độ ở đó sản phẩm nhân bản đặc hiệu cho tín hiệu rõ nhất và không có sản phẩm ký sinh

Hình 3.9 Điện di sản phẩm PCR với các cặp mồi đặc trưng cho các vùng gene cagA,

vacA s1/s2 và vacA m1/m2 với nhiệt độ lai thay đổi theo gradient từ 50 đến 60 0

C

Kết quả cho thấy khoảng nhiệt độ lai phù hợp với tiêu chí chọn lựa cho các phản ứng PCR monoplex là từ 56,30C đến 600C Ở những nhiệt độ lai thấp hơn có xuất hiện thêm những sản phẩm nhân bản không đặc hiệu

Chúng tôi chọn thành phần và chương trình PCR với nhiệt độ lai là 580C trong khoảng 56,30C đến 600C cho các phản ứng PCR monoplex để phát hiện và định type

gene cagA và vacA của H pylori

3.1.4 Xây dựng quy trình PCR multiplex

Việc sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi trong phản ứng PCR multiplex có một số thuận lợi về chi phí, thao tác, thời gian nhưng lại gặp phải một số vấn đề: (1) sự tương tác giữa các cặp mồi trong cùng phản ứng có thể làm giảm hiệu quả nhân bản tổng thể; (2) một hoặc vài cặp mồi có thể có hiệu quả nhân bản cao hơn những cặp mồi còn lại, dẫn đến sự “thiên lệch” (PCR drift) trong quá trình nhân bản các trình tự mục tiêu khác nhau Để hạn chế các vấn đề nêu trên, chúng tôi khảo sát một số điều kiện để tối ưu hóa phản ứng PCR multiplex với 4 cặp mồi Các điều kiện khảo sát bao gồm: (1) nồng độ 4 cặp mồi sử dụng trong phản ứng nhằm đạt được hiệu quả nhân bản tương đương giữa 4 trình tự mục tiêu; (2) nồng độ MgCl2 cho hiệu quả nhân bản tổng thể tốt nhất; và (3) nhiệt độ lai cho hiệu quả nhân bản đồng đều giữa các cặp mồi

Các mẫu dùng trong khảo sát này là 2 chủng H pylori ATCC và 3 mẫu lâm sàng

đã được giải trình tự như trên

Trước tiên, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR multiplex sử dụng thành phần cơ

bản và nồng độ 4 cặp mồi như nhau (200 nM), cùng với chương trình nhiệt sử dụng cho phản ứng PCR monoplex Kết quả được trình bày trong hình 3.10

Hình 3.10 Điện di sản phẩm PCR multiplex kết hợp 4 cặp mồi trên DNA của 2 chủng

H pylori ATCC và 3 mẫu lâm sàng Giếng 1, 2, 3 gồm 3 mẫu lâm sàng; giếng 4: chủng J99; giếng 5: chủng Tx30a IC : chứng nội

Kết quả cho thấy, ở tất cả các mẫu, sản phẩm nhân bản từ mồi chứng nội cho tín hiệu mạnh hơn so với tín hiệu sản phẩm nhân bản từ các cặp mồi khác Như vậy, đã có

sự “thiên lệch” trong quá trình nhân bản 4 trình tự mục tiêu, với cặp mồi dùng cho chứng nội có ưu thế hơn hẳn các cặp mồi khác

Bước tiếp theo khảo sát các nồng độ khác nhau của cặp mồi chứng nội

3.1.4.1 Khảo sát nồng độ các cặp mồi

Nhiều kết quả thực nghiệm cho thấy rằng nồng độ mồi cho PCR nằm trong khoảng 100 đến 1000 nM Nồng độ mồi quá cao có khả năng gây tạo những mồi nhị phân (primer dimer) mà không làm gia tăng hiệu quả nhân bản của phản ứng Việc tăng nồng độ mồi còn có thể làm xuất hiện các sản phẩm kí sinh trong phản ứng

Nồng độ mồi trong thành phần PCR cơ bản là 200 nM Trong thí nghiệm này, nồng độ mồi chứng nội được khảo sát theo chiều hướng giảm dần là 100, 75, 50 và 25

nM tương ứng với các nghiệm thức IC1, IC2, IC3 và IC4 Mẫu thử là 3 mẫu lâm sàng đã được giải trình tự nêu trên

Hình 3.11 Điện di sản phẩm PCR multiplex với các nồng độ mồi chứng nội trên 3

mẫu Các nồng độ mồi chứng nội gồm 100 nM (IC1), 75 nM (IC2), 50 nM (IC3) và 25 nM (IC4)

Kết quả cho thấy với nồng độ mồi chứng nội trong khoảng 50 nM (IC3) – 100

nM (IC1), 3 cặp mồi đặc hiệu hoạt động hiệu quả hơn trên các mẫu khảo sát so với khi

nồng độ mồi chứng nội là 200 nM Tuy nhiên, sản phẩm nhân bản với cặp mồi vacA

s1/s2 lại cho tín hiệu yếu

Chúng tôi tiến hành khảo sát các nồng độ mồi vacA s1/s2 tăng dần là 200, 300,

400 và 500 nM

Hình 3.12 Điện di sản phẩm PCR multiplex với các nồng độ mồi vacA s1/s2 từ 200 đến

500 nM trên 3 mẫu

Kết quả từ hình 3.12 cho thấy trong khoảng nồng độ mồi vacA s1/s2 từ 300 đến

500 nM thì tín hiệu các sản phẩm nhân bản từ các mồi khác bị giảm, đặc biệt là sản

phẩm từ mồi cagA Vì thế, chúng tôi chọn nồng độ 200 nM của mồi vacA s1/s2 cho các

nội dung tiếp theo

3.1.4.2 Khảo sát nồng độ MgCl 2

MgCl2 cần thiết cho hoạt động của enzyme DNA polymerase vì là cofactor của enzyme này Nếu thành phần MgCl2 không đủ sẽ làm cho enzyme polymerase hoạt động không hiệu quả, giảm độ nhạy của phản ứng Nếu thành phần MgCl2 quá cao có thể làm enzyme hoạt động không còn đặc hiệu và kết quả là các sản phẩm kí sinh xuất hiện

Nồng độ MgCl2 sử dụng trong thành phần PCR multiplex cơ bản là 2 mM. Trong quy trình này, MgCl2 được khảo sát ở 3 nồng độ là 2, 3 và 4 mM, các thành phần khác của phản ứng được giữ nguyên

Hình 3.13 Điện di sản phẩm PCR multiplex với các nồng độ MgCl 2; 1, 2, 3 và 4 là số thứ tự của mẫu Ba nồng độ MgCl 2 được khảo sát là 2, 3 và 4 mM

Kết quả từ hình 3.13 cho thấy nồng độ MgCl2 2 mM cho hiệu quả nhân bản tốt và đặc hiệu Khi tăng nồng độ MgCl2 lên thì xuất hiện nhiều sản phẩm không đặc hiệu Do

đó, chúng tôi chọn sử dụng nồng độ MgCl2 2 mM cho các nội dung tiếp theo

3.1.4.3 Khảo sát nhiệt độ lai

Vì phản ứng PCR multiplex sử dụng nhiều cặp mồi với Tm không hoàn toàn giống nhau nên cần xác định một nhiệt độ lai phù hợp cho tất cả các cặp mồi, cho hiệu quả nhân bản đồng đều và tốt nhất có thể trên mọi trình tự mục tiêu Khoảng nhiệt độ lai được khảo sát là 55-650C, là khoảng nhiệt độ lai tương ứng với các cặp mồi theo tính toán lý thuyết

Hình 3.14 Điện di sản phẩm PCR multiplex với các nhiệt độ lai từ 55-65 0 C trên 2 mẫu

Kết quả minh họa ở hình 3.14 cho thấy khoảng nhiệt độ lai cho hiệu quả nhân bản tương đối đồng đều và tốt trên mọi trình tự mục tiêu là 55 đến 61,40

C Vượt khỏi nhiệt độ 61,40C, một số cặp mồi hoạt động kém hiệu quả hoặc không hoạt động Trong phổ nhiệt độ này, chúng tôi chọn sử dụng nhiệt độ 580C cho các nội dung tiếp theo

3.1.5 Đánh giá độ nhạy của quy trình và so sánh kết quả với kit thương mại

Để xác định độ nhạy của phương pháp multiplex PCR, trước tiên chúng tôi định

lượng DNA bộ gene của H pylori trong 3 mẫu lâm sàng dương tính với H pylori bằng kit thương mại định lượng H pylori (Primer design)

Sau đó chúng tôi pha loãng các mẫu theo bậc mười tới mức pha loãng 10.000 lần

và xác định giới hạn phát hiện của phương pháp cho từng mẫu dựa trên kết quả định lượng nêu trên

Hình 3.15 Điện di sản phẩm PCR multiplex từ các nồng độ DNA H pylori (hình 3.15

A) và kết quả tương ứng sử dụng kit định lượng thương mại (hình 3.15 B)

Kết quả trên 3 mẫu (hình 3.15 A) cho thấy phương pháp multiplex PCR cho phép

phát hiện H pylori trong các mẫu khảo sát lần lượt ở độ pha loãng 10, 100 và 1000 lần,

mức pha loãng 10.000 lần cho kết quả âm tính

Kết quả định lượng tại những độ pha loãng 10, 100 và 1000 lần tương ứng với số lượng bản sao tính theo lý thuyết lần lượt là 48 bản sao/phản ứng (10 bản sao/µl DNA tách chiết); 132 bản sao/phản ứng (26 bản sao/µl DNA tách chiết); và 64 bản sao/phản ứng (12 bản sao/ µl DNA tách chiết)

Như vậy, ngưỡng phát hiện của phản ứng PCR multiplex mà chúng tôi xây dựng

là 10 bản sao/µl DNA tách chiết hoặc 50 bản sao/phản ứng so với ngưỡng 20 bản sao/phản ứng của kit thương mại Độ nhạy cao hơn của kit thương mại chủ yếu dựa trên

sự phát hiện tín hiệu huỳnh quang vốn nhạy hơn việc nhận định bằng mắt thông qua điện di trên gel agarose

Chúng tôi tiến hành so sánh hoạt động của quy trình PCR multiplex đã xây dựng

và kit thương mại trên 30 mẫu bệnh phẩm (Phụ lục 4) Kết quả ở bảng 3.2

A

B

Bảng 3.2 Kết quả phát hiện H pylori bằng kit thương mại và so với quy trình

PCR multiplex đã xây dựng

Kết quả so sánh Quy trình PCR multiplex Kit thương mại PrimerDesign

Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy kết quả phát hiện H pylori giữa quy trình multiplex

PCR đã xây dựng so với kit thương mại tương đương nhau Tuy nhiên, mỗi qui trình có

ứng dụng riêng, quy trình multiplex PCR đã xây dựng cho phép định týp gene cagA (+) hoặc cagA (-); vacA s1/s2 và vacA m1/m2 của H pylori Trong khi quy trình của kit thương mại thì cho phép định lượng H pylori trong mẫu

3.1.6 Áp dụng quy trình PCR multiplex trên một số mẫu lâm sàng

Chúng tôi áp dụng quy trình PCR multiplex để phát hiện và định týp gene H pylori

trên 204 bệnh phẩm viêm và ung thư dạ dày Kết quả được trình bày trong bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả phát hiện và định týp H pylori trên mẫu lâm sàng

Kết quả cho thấy trong 93 mẫu viêm dạ dày, quy trình phát hiện được 91 mẫu

(97,85 %) dương tính với H pylori Trong số các mẫu dương tính, có 37 mẫu (39,8 %)

có týp gene là cagA (+) vacA s1m1; 47 mẫu (50,5 %) có týp gene là cagA (+) vacA s1m2; 4 mẫu (4,3 %) có týp gene là cagA (-) vacA s1m2; và 3 mẫu (3,2 %) có týp gene

là cagA (-) vacA s2m2

Trong nhóm mẫu ung thư dạ dày, quy trình phát hiện được 78 mẫu (70,3 %)

dương tính với H pylori, tập trung vào hai loại týp gene chính là cagA (+) vacA s1m1 (51 mẫu) chiếm 65,38 %; và cagA (+) vacA s1m2 (27 mẫu) chiếm 34,6 % Kết quả về tỉ

lệ các týp gene phù hợp với một số nghiên cứu trước đây cho thấy “tính độc” của các

kiểu gene giảm dần theo thứ tự cagA (+) vacA s1m1 cagA (+) vacA s1m2 cagA (+) hoặc cagA (-) với vacA s2m2 [9, 29] Sự xuất hiện các mẫu âm tính trong nhóm ung thư

khác biệt so với nhóm viêm có thể có nhiều nguyên nhân cần được làm rõ thêm mặc dù tất cả các mẫu khảo sát đều cho kết quả dương tính với thử nghiệm CLO test

Như kết quả trình bày trong mục 3.1.1, do sự hiện diện của H pylori không đồng

đều trong các mẫu, ngay cả khi lấy từ cùng một bệnh nhân, nhất là trên nhóm mẫu ung thư, kết quả khác biệt chúng tôi nhận được trên các mẫu khảo sát cũng phản ánh điều

này Như vậy một số mẫu âm tính với H pylori có thể là âm tính giả Bên cạnh đó, một

số công bố trước đây cho thấy một số vi sinh vật có khả năng sản sinh urease, dẫn đến kết quả CLO test dương tính Một kết quả kiểm tra sơ bộ của chúng tôi cũng cho thấy sự

hiện diện của DNA vi khuẩn Streptococcus và Prevotella trong mẫu sinh thiết dạ dày có CLO test dương tính (kết quả không trình bày ở đây) nhưng định týp gene cagA và vacA của H pylori không cho kết quả Như vậy không loại trừ khả năng kết quả CLO test dương tính có thể là do sự hiện diện của những vi sinh vật khác không phải vi khuẩn H pylori

ĐỊNH DANH TÝP GENE CỦA VI KHUẨN H PYLORI

3.1.7.1 Quy trình xây dựng dựa trên phương pháp PCR multiplex sử dụng 4 cặp

mồi HP1-F/R, HP2-F/R, HP3-F/R và HP5-F/R với các nồng độ lần lượt là

200 nM cho 3 cặp mồi đầu và 50 nM cho cặp mồi cuối Nồng độ MgCl2 là 2

mM và nhiệt độ lai là 58 C

3.1.7.2 Độ nhạy của quy trình PCR multiplex là 10 bản sao/µl DNA tách chiết

hoặc 50 bản sao/phản ứng

3.1.7.3 Áp dụng quy trình PCR multiplex trên 204 mẫu mô viêm dạ dày và ung

thư dạ dày, chúng tôi phát hiện 91 mẫu dương tính với H pylori trong nhóm

viêm dạ dày và 78 trong nhóm bệnh nhân ung thư dạ dày

3.2 KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CÁC TÝP GENE cagA VÀ vacA

CỦA VI KHUẨN HELICOBACTER PYLORI

Ở 2 NHÓM BỆNH NHÂN UNG THƢ VÀ VIÊM DẠ DÀY

Trong khoảng thời gian từ tháng 12/2008 đến tháng 8/2010, tại Bệnh viện Đại học

Y Dược TP Hồ Chí Minh Minh kết hợp với Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu 169 bệnh nhân định các týp gen của vi khuẩn

H pylori

Thiết kế nghiên cứu bệnh chứng gồm 2 nhóm: nhóm bệnh gồm 78 bệnh nhân ung

thư dạ dày và nhóm chứng gồm 91 viêm dạ dày có H pylori-dương tính Trong đó tiêu chuẩn chọn bệnh và chúng tôi chỉ đưa vào nghiên cứu khi ít nhất có 2 thử nghiệm chẩn đoán H pylori-dương tính, trong đó điều kiện bắt buộc là thử nghiệm PCR-dương tính;

và ung thư dạ dày biểu mô tuyến

1 Ở nhóm bệnh nhân ung thƣ dạ dày, chúng tôi đã phẫu thuật cho 141 bệnh nhân

ung thư dạ dày (hang vị) được cắt 2/3 dạ dày, nạo hạch R2, trong số này:

(1) 30 trường hợp ung thư dạ dày có H pylori-âm tính từ đầu với cả 2 thử nghiệm urease (CLO test) và giải phẫu bệnh nên không được làm thử nghiệm PCR Ở

30 trường hợp này, lý do loại khỏi nghiên cứu là do bệnh nhân đã điều trị thuốc kháng tiết và kháng sinh trước khi nhập viện phẫu thuật nên có thể ảnh hưởng

đến độ nhạy của các thử nghiệm Vì về nguyên tắc chẩn đoán nhiễm H pylori

và theo qui ước quốc tế phải ngưng các thuốc nói trên ít nhất 4 tuần trước khi tiến hành các thử nghiệm

(2) Trong 111 ung thư dạ dày trường hợp còn lại, có 33 trường hợp tiếp tục loại khỏi nghiên cứu vì không đáp ứng đủ các yêu cầu và điều kiện của nghiên cứu với các lý do:

- 26 trường hợp H pylori-dương tính với CLO test nhưng giải phẫu bệnh và PCR

âm tính Ở 26 trường hợp này có thể (1) vị trí lấy mẫu mô bệnh khác nhau giữa CLO test với giải phẫu bệnh và PCR; (2) vi khuẩn H pylori không hiện diện ở

mô bệnh, và ngay cả ở mô lành, H pylori có thể có các vị trí cư trú khác nhau;

(3) có thể CLO test dương giả do quá trình lấy và bảo quản mẫu thử; (4) chúng

tôi chỉ đưa vào nghiên cứu khi ít nhất có 2 thử nghiệm chẩn đoán H

pylori-dương tính, trong đó điều kiện bắt buộc là thử nghiệm PCR-pylori-dương tính

- 04 trường hợp ung thư dạ dày có H pylori-âm tính với cả 3 thử nghiệm CLO test,

giải phẫu bệnh và PCR Ở 4 trường hợp này chúng tôi muốn kiểm tra đối chiếu 3

thử nghiệm với nhau và có thể tạm kết luận 4 trường hợp này không do nhiễm H pylori

- 02 trường hợp u lymphoma; và

- 01 lấy mẫu thử không đạt yêu cầu

Như vậy: có 78 trường hợp ung thư dạ dày được đưa vào nghiên cứu khi có ít nhất 2

trong 3 thử nghiệm H pylori-dương tính (trong đó điều kiện bắt buộc là thử nghiệm

PCR-dương tính); hoặc cả 3 đều dương tính

2 Nhóm chứng viêm dạ dày có H pylori-dương tính

94 viêm dạ dày có H pylori-dương tính được đưa vào nghiên cứu, trong số này có 3

trường hợp loại ra ngoài nghiên cứu:

(1) Một trường hợp CLO test-dương tính nhưng mẫu bị loại khi làm PCR;

(2) Hai trường hợp CLO test-dương tính nhưng giải phẫu bệnh và PCR-âm tính

Như vậy: ở nhóm chứng 91 viêm dạ dày được đưa vào nghiên cứu khi có ít nhất 2

trong 3 thử nghiệm H pylori-dương tính (trong đó điều kiện bắt buộc là thử nghiệm

PCR-dương tính); hoặc cả 3 đều dương tính

3.2.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU-ĐẶC ĐIỂM BỆNH NHÂN

3.2.1.1 Đặc điểm bệnh nhân xác định týp gen

169 bệnh nhân được đưa vào nghiên cứu phân tích và xác định týp gen gồm 78 ung

thư dạ dày và nhóm chứng 91 viêm dạ dày có H pylori-dương tính

Tuổi của bệnh nhân

Bảng 3.4 Tuổi trung bình của bệnh nhân

Nhận xét:

Tuổi trung bình của bệnh nhân ở 2 nhóm bệnh nhân ung thư và viêm dạ dày khác biệt có ý nghĩa với p< 0,001 (T test)