Protein CagA xâm nhập tế bào ung thư dạ dày AGS qua con đường dịch thể của Helicobacter pylori doc

TCNCYH 23 (3) 2003 Protein CagA xâm nhập tế bào ung th dạ dày AGS qua con đờng dịch thể của Helicobacter pylori Juanita. L. M 1 , Nguyễn Thị Hồng Hạnh 2 1 Trờng Đại học tổng hợp Michigan (Mỹ) 2 Viện Công nghệ Sinh học Các dịch thể của vi khuẩn Helicobacter pylori chứa các protein độc chất đợc hình thành từ lớp màng ngoài của vi khuẩn Helicobacter pylori. Sự xâm nhập của chúng vào tế bào ung th dạ dày AGS C120 đã làm tăng tổng hợp của interleukin IL-8. I. Đặt vấn đề Vi khuẩn Helicobacter pylori sống trong lớp niêm mạc dạ dày của ngời và của một số động vật. Chúng là các vi khuẩn chậm, vì không có xu hớng tấn công vật chủ. Các bệnh nh viêm loét và ung th dạ dày, loét hành tá tràng là kết quả tơng tác giữa vi khuẩn và vật chủ kéo dài tới hàng chục năm [3]. Các nghiên cứu cho thấy, 90% vi khuẩn H. pylori bơi trong lớp niêm mạc của dạ dày mà không tơng tác trực tiếp với dạ dày. Năm 1999, Fiocca phát hiện: vi khuẩn Helicobacter pylori có thể tiết ra thể dịch chứa protein toxin vacA [5]. ít nhất hai protêin nữa là CagA và HP1125 [7] cũng đợc tìm thấy trong các dịch thể [Nguyễn Thị Hồng Hạnh và cs các kết quả cha công bố]. Helicobacter pylori đợc chia thành hai loại: Loại I mang đảo bệnh lý cag dài ~ 40 kb và loại II không mang cag. Các chủng vi khuẩn thuộc loại I thờng làm tăng tổng hợp interleukin IL-8 trong tế bào dạ dày [10]. Stefano tìm thấy protein cagA đợc mã hoá bởi gien cagA nằm trong đảo bệnh lý cag đã thâm nhập vào trong tế bào chủ qua một cầu tiếp hợp. Bên trong tế bào, protein đợc phospho hoá bởi các Kinase [4] Không rõ, sự tổng hợp của interleukin IL-8 trong tế bào biểu mô dạ dày là do cagA của vi khuẩn H. pylori thâm nhập vào tế bào qua cầu nối hay còn do những lý do khác nh tơng tác với cagA của dịch thể? Câu trả lời sẽ giúp hiểu rõ mối tơng tác của vi khuẩn với vật chủ trong quá trình bệnh lý. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xem xét tơng tác giữa dịch thể của vi khuẩn Helicobacter pylori, chủng VNH85 với tế bào ung th AGS C120. Chúng tôi đã xác nhận, các protein cagA trong dịch thể đã xâm nhập vào tế bào ung th dạ dày AGS và làm tăng quá trình tổng hợp interleukin IL- 8 của tế bào. II. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 1. Đối tợng - Vi khuẩn Helicobacter pylori, chủng VNH- 85 - Tế bào AGS (có nguồn gốc từ ung th dạ dày ngời nhận từ ACTT (American Type culture) 2. Phơng pháp 2.1. Nuôi vi khuẩn H. pylori và tách chiết các thể dịch của vi khuẩn. Vi khuẩn Helicobacter pylori, dòng VNH- 85 [1] đợc nuôi trong môi trờng Brucella lỏng có bổ sung 5% huyết thanh bò và các 49 TCNCYH 23 (3) 2003 kháng sinh tơng ứng. Sau 3-4 ngày, các thể dịch đợc thu nhận bằng ly tâm dịch nổi ở 100.000g trong hai giờ ở 4o C 2.2. Nuôi cấy tế bào. Tế bào AGS [2] nhận từ ACTT (American Type culture) đợc nuôi trên đĩa Petri 35 mm (Corning Glas Works, Corning, NY) trong môi trờng Dulbecco / Eagle (Gibco-BLR) có bổ sung 10% huyết thanh bò, penicillin (100 àg/ml) và streptomycin (100 àg/ml) trong điều kiện 5% CO2 ở 37 o C. AGS C120 là dòng các tế bào ung th AGS đợc biến nạp 240 Gastrin contruct (240 GasLuc) chứa phần điều khiển của gen IL-8 và đã đợc chọn lọc trên môi trờng G418 (Gibco-BLR). 2.3. Xử lý tế bào AGS C120 với các dịch thể của vi khuẩn. Các tế bào AGS đạt 80% confluence đợc ủ với dịch thể ở nồng độ 3,5 àg / ml. Sau các khoảng thời gian 12 giờ, 24 và 48 giờ, tế bào đợc rửa bằng 1 x PBS lạnh và đợc xử lý với Trypsin-EDTA trong vòng 10 phút ở 37 o C. Cũng ở các thời điểm 3, 6 và 21 giờ, 50 àl môi trờng nuôi cấy tế bào đợc lấy để xác định hàm lợng IL-8. 2.4. Định lợng protein: Protein đợc xác định bằng Braford. 2.5. Tủa miễn dịch và phân tích Western. Tế bào AGS thu thập ở 12, 18 và 24 giờ sau khi ủ với các dịch thể đợc làm tan trong dung dịch RIPA [0.15 mM NaCl / 0.05 mM Tris-HCl pH 7. 2 / 1% Triton X-100 / 1% sodium deoxycholate/ 0.1% SDS., 200mM vanadate, 5 mg/ml hỗn hợp protease ]. 200 àl của dịch tan đợc trộn với 50 àl kháng thể đa dòng kháng cagA và ử tiếp ở 4 o C qua đêm. Cho thêm 50 àl hạt Sepharose gắn protein A để tủa phức miễn dịch. Hoà tủa protein trong 1x dung dịch Laemmili (200 mM Tris-HCl pH 8., 8% SDS., 1%Bromophenol Blue và 400 mM DTT). Protein đợc phân giải bằng SDS - PAGE trên gel Polyacrylamid Gradient nồng độ từ 4 đến 20%, sau đó đợc chuyển vào màng Hybond C và lai với kháng thể đa dòng kháng protein cagA. 2.6. Định lợng interleukin IL-8. Interleukin IL-8 có trong dịch nổi nuôi cấy tế bào đợc định lợng bằng phơng pháp Elisa. Chế phẩm sinh học Quantikine của R&D system, Inc. đợc sử dụng. Sản phẩm màu của phản ứng Elisa đợc đo ở bớc sóng 550 nm III. Kết quả 1. Xây dựng đờng chuẩn định lợng IL- 8. Đờng chuẩn để xác định IL-8 đợc trình bầy ở hình 1. Lợng IL-8 nhỏ nhất có thể xác định bởi phơng pháp là 6,2 pcg. 2. Sự xâm nhập của các thể dịch của vi khuẩn Helicobacter pylori vào tế bào AGS. Các phân tích Western cho thấy, từ sau 12 giờ đợc ủ với các dịch thể của vi khuẩn Helicobacter pylori, một số băng protein có phân tử lợng 40 kDa, 35 kDa và 16 kDa đã đợc phát hiện thêm trên Western đồ, chứng tỏ các dịch thể đã thâm nhập vào trong tế bào ung th AGS. Các protêin có trọng lợng nhỏ hơn CagA chứng tỏ, protein đã bị cắt bởi một vài protease ở bên trong tế bào (hình 2). Hai protein của tế bào ung AGS có phân tử lợng >85 kDa cho phản ứng chéo với kháng thể đa dòng kháng cagA cũng đợc phát hiện trên Western đồ. 3. Sự tăng tiết của IL-8 dới ảnh hởng của các dịch thể Các phân tích cho thấy, trong thí nghiệm đối chứng, các tế bào ung th dạ dày AGS C120 tổng hợp IL-8 invitro. Dới ảnh hởng của các thể dịch của H. pylori, chúng đã gia tăng tổng hợp IL-8 lên khoảng 1,5 lần. Lợng interleukin IL-8 đợc tiết vào môi trờng tỷ lệ 50 TCNCYH 23 (3) 2003 thuận với thời gian ủ của dịch thể với vi khuẩn (hình 3). OD (550nm) 1.5 1.0 0.5 6.2 12.5 25 50 (pcg) Hình 1- Đờng chuẩn xác định hàm lợng của IL-8 IV. Bàn luận Các kết quả phân tích của chúng tôi cho thấy, dịch thể của vi khuẩn H. pylori, khi thâm nhập vào trong tế bào ung th AGS đã làm tăng mức độ tổng hợp của interleukin IL-8 trong tế bào. Các nhà khoa học Nhật xác nhận: mức độ tổng hợp interleukin IL-8 của các tế bào ung th dạ dày có quan hệ trực tiếp với quá trình tạo các mạch máu mới để nuôi mô ung th cũng nh sự phát triển và di căn của các mô ung th [6,9]. Sự tăng biểu hiện của MMP-9- một protêinase gắn liền với khả năng tấn công của các tế bào ung th dạ dày cũng nằm trong sự ảnh hởng của interleukin IL- 8 [8]. Nh vậy, chúng tôi đã phát hiện protein cagA có thể đi vào tế bào biểu mô dạ dày qua con đờng dịch thể. Những nghiên cứu tiếp sau sẽ đợc tập trung vào bản chất của các mối tơng tác sẽ làm sáng tỏ ý nghĩa sinh học của hiện tợng vừa đợc miêu tả. 1 2 3 4 kDa 184 121 85 68 52 40 28 22 16,8 Hình 2- Protein cagA của dịch thể (chỉ bằng mũi tên) xâm nhập vào trong tế bào ung th AGS 1- tế bào AGS không ủ với dịch thể. 2-4: AGS đợc ủ với các dịch thể sau 12, 24 và 48 giờ. Phân tử lợng của các protein chuẩn đợc chỉ ở phía trái của hình. 1 2 3 51 TCNCYH 23 (3) 2003 IL-8 (pcg/ml) a b c 3 6 OD (550nm) 3 2 1 1440 960 480 240 21 giờ Hình 3- Sự thâm nhập của các thể dịch của vi khuẩn H. pylori, chủng VNH 85 vào trong tế bào AGS C120 làm tăng quá trình tiết IL-8 vào môi trờng a) Tế bào AGS 120 đợc ủ với IL-1 b) Tế bào AGS đợc ủ với các dịch thể của vi khuẩn c) Tế bào AGS không bị xử lý. V. Kết luận Qua nghiên cứu này, chúng tôi xin rút ra một số kết luận nh sau: 1. Protein cagA có thể thâm nhập vào tế bào biểu mô dạ dày bằng con đờng dịch thể của vi khuẩn Helicobacter pylori 2. Bên trong tế bào biểu mô dạ dày, protein cagA đã làm tăng quá trình tổng hợp của IL-8 lên gắp gần 2 lần. Tài liệu tham khảo 1. Lê Băng Sơn và Nguyễn Thị Hồng Hạnh: Study on Helicobacter pylori, strain 85 isolated from a Vietnamese patient. International workshop on Biology. Hanoi- Viet Nam. 1. 2001: 414 - 417. 2. Baranco, S.C., Townsend,C.M., Casartelli, Jr.C., Macik, B.G., Burger, N.L., Boerwinkle, W.R and Gourley, W.K: Establishment and characterization of an invitro model system for human adernocarcinoma of the stomach. Cancer Res. 1983, 43: 11703 - 1709. 3. Blaser, M.J and Parsonet, J: Parasitism by the slow bacterium Helicobacter pylori leads to altered gastric homeostatis and neoplasia. J. Clin. Investig. 1994 94: 4- 8. 4. Censini, S., Stein, M and Covacci, A.: Cellular responses induced after contact with Helicobacter pylori. Current opinion in Microbiology. 2000, 4: 41- 46. 5. Fiocca, R., Necchi, V., Sommi, P., Ricci, V., Telford, J., Cover, T.L., Solicia, E.: Release of Helicobacter pylori vacuolating cytotoxin by both a specific secrection pathway and budding of outer membrane vesicles. Uptake of released toxin and vesicles by gastric epithelium. J. Pathol. 1999, 188: 220-226. 6. Kido, S., Kitadai, Y., Hattori, N et al: Interleukin IL-8 and vascular endothelial growth factor- prognostic factors in human gastric carcinomas?. 2001, Eur J. of Cancer 37 : 1482- 1487. 7. Kim, J.S., Chang, J.H., Seo, W.Y., Yu, G.J., Chung, S.I. and Yum, J.S.: Cloning and characterization of a 22-kDa Outer-Membrane 52 TCNCYH 23 (3) 2003 Protein (Omp22) from Helicobacter pylori. Mol. Cells. 2001, 10 (6): 633 - 641. 8. Kitadai, Y., Haruma, K., Mukaida, N et al: Regulation of disease – prograsion genes in human gastric carcinoma cells by interleukin IL-8. 2000, Clin Cancer Res. 6 : 2735- 2740. 9. Kitadai, Y., Haruma, K., Sumii, K., Yamamoto, S., Ue, T., Yozaki, H., Yasui, W., Ohmoto, Y., Kajiyama, G., Filder, I. J and Tahara, E [1998]. Expression of interleukin IL- 8 correlates with vascularity in human gastric carcinomas. Am. J. Pathol. 2001, 152 : 93-100. 10. Stein, M., Rappuoli, R and Covacci, A: Tyrosine phosphorylation of the Helicobacter pylori CagA antigen after cag-driven host cell translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 : 1263 - 1268. C«ng tr×nh nghiªn cøu nµy ®−îc tiÕn hµnh t¹i tr−êng §¹i häc Tæng hîp Michigan (Mü). Summary The protein cagA enters the AGS cells via the interaction of the vesicles of Helicobacter pylori The vesicles formed from the outer membrane of the bacterium Helicobacter pylori contain many protein toxins such as cagA.,vacA, HP1125. The entry of the toxin-bearing particles into the gastric cancerous cells AGS led to the increased synthesis of interleukin IL-8. 53 . Protein cagA của dịch thể (chỉ bằng mũi tên) xâm nhập vào trong tế bào ung th AGS 1- tế bào AGS không ủ với dịch thể. 2-4: AGS đợc ủ với các dịch thể. 1. Protein cagA có thể thâm nhập vào tế bào biểu mô dạ dày bằng con đờng dịch thể của vi khuẩn Helicobacter pylori 2. Bên trong tế bào biểu mô dạ dày,