Bài viết đã sử dụng ethanol như một dung môi để chiết các thành phần hòa tan có trong lá của cây Heliciopsis lobata. Tiếp theo, dịch chiết được sử dụng để đánh giá tác động của nó lên sự tăng sinh của các tế bào ung thư dạ dày dòng AGS và MKN45 bằng phương pháp MTT. Sự thay đổi hình thái nhân tế bào được phát hiện dựa vào thuốc nhuộm nhân DAPI.
TNU Journal of Science and Technology 225(11): 33 - 38 DỊCH CHIẾT ETHANOL TỪ LÁ CÂY ĐÌA ĐỤM (HELICIOPSIS LOBATA (MERR.) SLEUM) ỨC CHẾ SỰ TĂNG SINH TẾ BÀO VÀ TĂNG CƯỜNG APOPTOSIS Ở HAI DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY AGS VÀ MKN45 Lê Thị Thanh Hương1, Trần Thu Hiền1, 2, Mai Văn Linh1, Nguyễn Phú Hùng1* 1Trường Đại học Khoa học – ĐH Thái Nguyên, 2Bệnh viện Nội tiết Trung ương TĨM TẮT Cây Đìa đụm (Heliciopsis lobata (Merr.) Sleum), dân gian gọi Bàn tay ma, ghi nhận thuốc dùng rộng rãi thuốc y học cổ truyền Trong nghiên cứu này, sử dụng ethanol dung mơi để chiết thành phần hịa tan có Heliciopsis lobata Tiếp theo, dịch chiết sử dụng để đánh giá tác động lên tăng sinh tế bào ung thư dày dòng AGS MKN45 phương pháp MTT Sự thay đổi hình thái nhân tế bào phát dựa vào thuốc nhuộm nhân DAPI Kết cho thấy, dịch chiết ethanol từ Đìa đụm làm giảm mạnh khả tăng sinh tế bào ung thư dày hai dòng tế bào AGS MKN45 Giá trị IC50 dịch chiết hai dòng AGS MKN45 tương ứng với 0,467 mg/ml 0,168 mg/ml Dịch chiết ethanol Đìa đụm làm tăng tỷ lệ tế bào có kiểu hình apoptosis từ – 20% dòng AGS – 28% dòng tế bào MKN45 Kết nghiên cứu cho thấy, dịch chiết từ Đìa đụm Heliciopsis lobata có tiềm ức chế sinh trưởng tế bào ung thư dày Từ khóa: Sinh học; apoptosis; ung thư dày; dịch chiết ethanol; tăng sinh tế bào Ngày nhận bài: 16/7/2020; Ngày hoàn thiện: 16/9/2020; Ngày đăng: 21/10/2020 THE ETHANOL EXTRACT OF THE LEAVES OF HELICIOPSIS LOBATA INHIBITS CELL PROLIFERATION AND ENHANCES APOPTOSIS IN THE TWO GASTROINTESTINAL CANCER CELL LINES AGS AND MKN45 Le Thi Thanh Huong1, Tran Thu Hien1, 2, Mai Van Linh1, Nguyen Phu Hung1* 1TNU 2National - University of Sciences, Hospital of Endocrinology ABSTRACT Heliciopsis lobata (Merr.) Sleum, also called Ghost hand tree, has been recognized as a widely used medicinal plant in traditional medicine In this study, we used ethanol as a solvent to extract components contained in the leaves of Heliciopsis lobata The extract was then used to assess its effect on the cell proliferation of AGS and MKN45 gastric cancer cells by MTT assay Nuclear morphological changes were detected by DAPI staining The results showed that ethanol extract from Heliciopsis lobata leaves significantly reduced the cell proliferation in both AGS and MKN45 cell lines The IC50 value of the extract for AGS and MKN45 cells corresponded to 0,467 mg/ml and 0,168 mg/ml The ethanol extract of Heliciopsis lobata leaves also increased the proportion of apoptosis-type cells from - 20% for AGS lines and - 28% for MKN45 cell lines The results of this study showed that the ethnanol extract from the Heliciopsis lobata leaves has the potential to inhibit the growth of stomach cancer cells Keywords: Biology; apoptosis; gastric cancer; ethanol extract; cell proliferation Received: 16/7/2020; Revised: 16/9/2020; Published: 21/10/2020 * Corresponding author Email: hungnguyenphu@tnus.edu.vn http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn 33 Lê Thị Thanh Hương Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN Giới thiệu Cây Đìa đụm (Heliciopsis lobata (Merr.) Sleum, thuộc họ Proteaceae (họ Quắn hoa), phân bố số tỉnh miền núi phía Bắc số tỉnh trung du Bắc Một số đồng bào dân tộc thiểu số cịn gọi Đìa đụm Bàn tay ma có cấu tạo phân thùy giống hình bàn tay Đìa đụm từ lâu đồng bào dân tộc thiểu số sử dụng thuốc khác để chữa trị số bệnh gan mật, tiết niệu số bệnh viêm nhiễm viêm gan, vàng mắt Bên cạnh đó, Đìa đụm dùng để hỗ trợ điều trị bệnh xương khớp tắm cho phụ nữ sau sinh Một số nghiên cứu gần cho thấy, Đìa đụm có chứa số hợp chất có khả ức chế tế bào ung thư myricetin, myrincitrin, hydroquinone medioresinol [1], [2] Bên cạnh đó, Heliciopsis lobata cịn có tác dụng chống oxy hóa có khả gây biệt hóa tế bào ung thư Hai dẫn xuất arbutin tách chiết từ Đìa đụm 6'-((E)2methoxy-5-hydroxycinnamoyl) arbutin 2'((E)2, 5-dihydroxycinnamoyl) arbutin (2) chứng minh có khả gây độc cho tế bào gốc ung thư vú, ức chế khả di trú cảm ứng trình apoptosis tế bào [3], [4] Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu đánh giá tác động dịch chiết từ Đìa đụm lên tế bào ung thư dày Chính vậy, lần đầu tiên, chúng tơi tiến hành phân tích ảnh hưởng ức chế dịch chiết ethanol Đìa đụm lên tăng sinh tế bào ung thư dày khả cảm ứng trình apoptosis tế bào 225(11): 33 - 38 falcon chứa 15 gam bột lắc qua đêm tốc độ 200 vòng/phút Tiến hành lọc dịch giấy lọc Whatman (Merk, Đức) Ethanol bay hoàn toàn nhiệt độ 40oC 24h Phần cô đặc gọi cao chiết hịa tan dung mơi DMSO nồng độ gốc 200 mg/ml Dung dịch chứa cao chiết sử dụng đánh giá tác động hai dòng tế bào ung thư dày AGS MKN45 2.2 Phân tích tăng sinh tế bào 2.2.1 Phương pháp đánh giá kiểu hình tế bào Hai dịng tế bào ung thư dày AGS MKN45 (do phịng thí nghiệm Inserm U1053 – Viện Sức khỏe Nghiên cứu Y học Quốc gia Pháp cung cấp) nuôi cấy môi trường RPMI 1640 (Invitrogen, Mỹ) có bổ sung 10% huyết bò (FBS) 1% kháng sinh penicillin/streptomycin đĩa 96 giếng với mật độ ban đầu 5.103 tế bào/giếng Sau 24h nuôi cấy, môi trường thay mơi trường có chứa dịch chiết ethanol từ Heliciopsis lobata nồng độ khác nhau: 0,1 – 0,2 – 0,5 – mg/ml 48h điều kiện 37oC, 5% CO2 Quan sát, chụp ảnh đánh giá kiểu hình tế bào kính hiển vi soi ngược (NIKON, Ts2, Nhật Bản) Mẫu Đìa đụm (Heliciopsis lobata) thu thập huyện Võ Nhai, Thái Nguyên, đem rửa sạch, sấy khô 50oC 48h nghiền thành bột mịn trước tiến hành thu dịch chiết với ethanol (Hình 1) 2.2.2 Sàng lọc MTT Các tế bào ung thư dày AGS MKN45 xử lý với dịch chiết ethanol từ Heliciopsis lobata nuôi cấy điều kiện 37oC, 5% CO2, độ ẩm 95% Sau 48h xử lý, môi trường nuôi cấy cũ loại bỏ tiến hành bổ sung môi trường nuôi cấy chứa MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide) nồng độ mg/ml Tiếp theo, môi trường nuôi cấy chứa MTT loại bỏ bổ sung 100 µl DMSO để hịa tan tinh thể kết tinh Mật độ tế bào xác định bước sóng 570 nm máy quang phổ (Multiskan Sky Thermo Fisher) Mỗi nồng độ lặp lại giếng cho thí nghiệm Tỉ lệ tăng sinh tế bào tính theo cơng thức: Dịch chiết Đìa đụm thu cách bổ sung 30 ml ethanol 95% vào ống % tăng sinh tế bào = (OD mẫu xử lý/OD mẫu đối chứng)*100 Phương pháp nghiên cứu 2.1 Thu mẫu chiết dịch từ ethanol 34 http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn Lê Thị Thanh Hương Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN Giá trị IC50 dịch chiết ethanol từ Đìa đụm dịng tế bào dựa độ hấp thụ OD (mật độ quang) từ sàng lọc MTT thực phần mềm chuyên dụng GraphPad Prism 5.0, theo hướng dẫn nhà sản xuất 2.3 Phân tích biến đổi kiểu nhân tế bào thuốc nhuộm nhân DAPI Tế bào ung thư dày nuôi cấy môi trường RPMI 1640 đĩa 96 giếng Sau 48h xử lý với dịch chiết Heliciopsis lobata, tế bào cố định dung dịch ethanol 95% 10 phút Sau cố định, ethanol loại bỏ cách rửa lần với dung dịch đệm PBS 1X Tiếp theo, bổ sung vào giếng 100 µl dung dịch nhuộm nhân tế bào DAPI (2-(4-Amidinophenyl)-6indolecarbamidine dihydrochloride) nồng độ 10 µg/ml phút Tế bào soi kính hiển vi huỳnh quang Nilkon T2U độ phóng đại 200 lần kính lọc sắc dành cho kênh mầu DAPI Hình Ảnh hưởng dịnh chiết lên tăng sinh tế bào AGS: A) Hình ảnh tế bào chụp kính hiển vi soi ngược nồng độ xử lý với dịch chiết khác B) Tỷ lệ phần trăm tăng sinh tế bào so với đối chứng (100%),* p ≤ 0,05, n = Thang đo: 50 µm Kết thảo luận http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn 225(11): 33 - 38 3.1 Tác động dịch chiết Đìa đụm lên tăng sinh tế bào ung thư 3.1.1 Tác động dịch chiết lên tăng sinh tế bào AGS Để đánh giá ảnh hưởng dịch chiết Đìa đụm lên tăng sinh tế bào ung thư dày AGS MKN45 Kết hình cho thấy, sau 48h dịch chiết ethanol từ Đìa đụm pha lỗng mơi trường ni cấy theo nồng độ khác từ 0,1 – 0,2 – 0,5 - mg/ml Kết hình 1A cho thấy, mật độ tế bào khơng có thay đổi đáng kể so với đối chứng (0 mg/ml) Tuy nhiên, tăng lên nồng độ dịch chiết ảnh hưởng rõ rệt đến mật độ tế bào quan sát Hình 1B cho thấy, nồng độ 0,2 mg/ml mức độ tăng sinh tế bào giảm xấp xỉ 50% so với đối chứng Ở nồng độ cao hơn, từ 0,5 - mg/ml, mức độ tăng sinh khoảng 40% - 7% so với đối chứng Như thấy rằng, dịch chiết ethanol Đìa đụm tác động rõ rệt lên khả phân chia, tăng sinh tế bào ung thư dày dòng AGS Sử dụng phần mềm phân tích chuyên dụng GraphPad Prism 5.0, xác định giá trị IC50 dịch chiết ethanol từ Đìa đụm tác động lên tế bào ung thư dày AGS 48h 0,476 mg/ml (hình 1B) Trước đó, nghiên cứu Choi cộng đánh giá tác động dịch chiết ethanol từ Paeonia suffruticosa ức chế tăng sinh tế bào AGS với giá trị IC50 xác định 48h xử lý 0,22 mg/ml [5] Trong nghiên cứu khác, dịch chiết ethanol từ phận khác Linum album thu nhận Iran có tác động ức chế tăng sinh tế bào AGS với giá trị IC50 dao động từ 0,35 – 0,894 mg/ml [6] Một nghiên cứu trước Wei-Yan đồng tác giả (2016) cho thấy, số hợp chất thuộc nhóm arbutin tách chiết tinh từ Heliciopsis lobata có ảnh hưởng ức chế tăng tế bào ung thư biểu mô dày MGC-803 với giá trị IC50 > 0,05 mg/ml [4] Như thấy rằng, dịch chiết 35 Lê Thị Thanh Hương Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN ethanol từ lồi thảo dược khác có mức độ tác động lên tăng sinh dòng tế bào ung thư dày AGS không giống thường có giá trị IC50 lớn so với chất tinh từ dịch chiết tổng thể 3.1.2 Tác động dịch chiết lên tăng sinh tế bào MKN45 MKN45 dòng tế bào ung thư dày thuộc thể phân tán sử dụng nhiều nghiên cứu độc tính thuốc hợp 225(11): 33 - 38 loài Cyrtopodion scabrum có khả ức chế tăng sinh tế bào với giá trị IC50 đạt 0,38 mg/ml Nghiên cứu rằng, giá trị IC50 dịng tế bào ung thư gan HepG2 0,86 mg/ml [7] Như thấy rằng, dịch chiết ethanol từ Đìa đụm có tác động ức chế mạnh dòng tế bào MKN45 so với dòng tế bào AGS nghiên cứu mạnh so với dịch chiết từ loài Cyrtopodion scabrum nghiên cứu trước 3.2 Tác động dịch chiết Đìa đụm lên tỷ lệ tế bào có kiểu hình apoptosis tế bào ung thư 3.2.1 Tác động dịch chiết lên tế bào AGS Để đánh giá tác động dịch chiết ethanol lên kiểu nhân hai dòng tế bào ung thư dày AGS MKN45, sau cố định, tế bào nhuộm với thuốc nhuộm DNA nhân DAPI Những thay đổi kiểu hình nhân tế bào ghi nhận kính hiển vi huỳnh quang (hình 3) Hình Ảnh hưởng dịnh chiết lên tăng sinh tế bào MKN45: A) Hình ảnh tế bào chụp kính hiển vi soi ngược nồng độ xử lý với dịch chiết khác B) Tỷ lệ phần trăm tăng sinh tế bào so với đối chứng (100%), * p ≤ 0,05, n = Thang đo: 50 µm Kết nghiên cứu (hình 2) cho thấy, nồng độ 0,1 mg/ml, dịch chiết Đìa đụm biểu thị khả kìm hãm tăng sinh tế bào so với đối chứng Mức độ kìm hãm tăng sinh tăng lên nồng độ dịch chiết tăng từ 0,2 - mg/ml Đáng ý, nồng độ từ 0,5 mg/ml xuất hiện tượng tế bào khả bám dính, co cụm thành đám tế bào Giá trị ức chế 50% tăng sinh tế bào (IC50) xác định sau 48h xử lý với dịch chiết xác định 0,168 mg Một nghiên cứu gầy dòng tế bào MKN45 cho thấy, dịch chiết ethanol từ 36 Hình Dịnh chiết Đìa đụm tác động lên hình thành kiểu nhân tế bào apoptosis dịng tế bào AGS, * p ≤ 0,05, n = Thang đo: 30 µm http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn Lê Thị Thanh Hương Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN Hình 3A cho thấy, tế bào có kiểu nhân điển hình tế bào apoptosis nhân phân mảnh, bắt màu mạnh với thuốc nhuộm DAPI bắt đầu xuất rõ rệt giếng xử lý với dịch chiết nồng độ từ 0,2 mg/ml Tỷ lệ tế bào có kiểu hình apoptosis tăng mạnh nồng độ cao đạt xấp xỉ 20% tổng số tế bào quan sát nồng độ mg/ml Như thấy rằng, độc tính dịch chiết tế bào AGS tăng lên tăng nồng độ xử lý tăng lên Kết tương tự trường hợp dịch chiết ethanol từ lồi Cyrtopodion scabrum dịng tế bào SW740 Ở nồng độ mg/ml, dịch chiết loài làm tăng tỷ lệ tế bào apoptosis tế bào SW740 lên khoảng 15% [7] 3.2.2 Tác động dịch chiết lên tế bào MKN45 Hình Dịnh chiết Đìa đụm tác động lên hình thành kiểu nhân tế bào apoptosis dòng tế bào MKN45, * p ≤ 0,05, n = Thang đo: 30 µm Đối với dịng tế bào ung thư dày MKN45, kết phân tích tăng sinh (hình 3) cho thấy rằng, MKN45 nhạy cảm dịch chiết từ Heliciopsis lobata so với http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn 225(11): 33 - 38 dòng AGS Những ảnh hưởng dịch chiết lên mức độ apoptosis tế bào đánh giá kỹ thuật nhuộm nhân với thuốc nhuộm DAPI Kết trình bày hình cho thấy, tỷ lệ tế bào có kiểu nhân apoptosis tăng từ - 28% so với đối chứng nồng độ dịch chiết tăng từ 0,2 - mg/ml Điều cho thấy rằng, mức độ gây apoptosis dịch chiết dòng MKN45 cao đáng kể so với dịng AGS Kết có tương đồng mức độ ảnh hưởng dịch chiết lên tăng sinh tế bào hai dòng tế bào ung thư AGS MKN45 Apoptosis cách thức thể chống lại phát sinh ung thư thông qua việc loại bỏ tế bào có sai hỏng hệ gen [8] Dựa đặc điểm này, nhiều loại thuốc kháng ung thư phát triển 5-Fluouracin hay Doxorubicin Trong năm gần đây, việc sàng lọc thảo dược có khả ức chế tăng sinh tế bào thông qua chế gây chết tế bào đường apoptosis đặc biệt quan tâm [9] Trong dân gian, Đìa đụm biết đến vị thuốc quan trọng thuốc bệnh gan, bệnh đường tiết liệu Trong nghiên cứu này, lần chúng tơi chứng minh được, Đìa đụm cịn có tiềm chống lại tăng sinh tế bào ung thư dày khả cảm ứng trình apoptosis loại ung thư Kết luận Dịch chiết ethanol từ Đìa đụm (Heliciopsis lobata) ức chế tăng sinh tế bào ung thư dày hai dòng tế bào AGS MKN45 với giá trị IC50 tương ứng 0,467 mg/ml 0,168 mg/ml Tỷ lệ tế bào có kiểu nhân apoptosis tăng từ - 20% xử lý tế bào AGS với dịch chiết Đìa đụm Đối với dịng MKN45, tỷ lệ tế bào có kiểu nhân apoptosis tăng từ - 28% Nghiên cứu rằng, Đìa đụm loại thảo dược có tiềm chống lại tăng sinh tế bào ung thư dày 37 Lê Thị Thanh Hương Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN TÀI LIỆU THAM KHẢO/ REFERENCES [1] D Li, M.-S Liu, Z.-L Li, S.-L Kang, and H.M Hua, “Studies on chemical constituents of Heliciopsis lobata II,” Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, vol 33, no 4, pp 409-411, Feb 2008 [2] J Feng et al., “Myricetin inhibits proliferation and induces apoptosis and cell cycle arrest in gastric cancer cells,” Mol Cell Biochem., vol 408, no 1-2, pp 163-170, Oct 2015 [3] X Man, L Yang, S Liu, L Yang, M Li, and Q Fu, “Arbutin promotes MC3T3‑E1 mouse osteoblast precursor cell proliferation and differentiation via the Wnt/β‑catenin signaling pathway,” Mol Med Rep, vol 19, no 6, pp 4637–4644, Jun 2019 [4] W.-Y Qi, N Ou, X.-D Wu, and H.-M Xu, “New arbutin derivatives from the leaves of Heliciopsis lobata with cytotoxicity,” Chin J Nat Med, vol 14, no 10, pp 789-793, Oct 2016 [5] H S Choi, H.-S Seo, J H Kim, J.-Y Um, Y C Shin, and S.-G Ko, “Ethanol extract of paeonia suffruticosa Andrews (PSE) induced 38 [6] [7] [8] [9] 225(11): 33 - 38 AGS human gastric cancer cell apoptosis via fas-dependent apoptosis and MDM2-p53 pathways,” J Biomed Sci., vol 19, p 82, Sep 2012 E A Asl, J F Mehrabadi, D Afshar, H Noorbazargan, H Tahmasebi, and A Rahimi, “Apoptotic Effects of Linum album Extracts on AGS Human Gastric Adenocarcinoma Cells and ZNF703 Oncogene Expression,” Asian Pac J Cancer Prev, vol 19, no 10, pp 2911–2916, Oct 2018 M Rashidi et al., “Selective Cytotoxicity and Apoptosis-Induction of Cyrtopodion scabrum Extract Against Digestive Cancer Cell Lines,” Int J Cancer Manag, vol 10, no 5, pp 8633, May 2017 S Elmore, “Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death,” Toxicol Pathol, vol 35, no 4, pp 495-516, Jun 2007 B A Carneiro, and W S El-Deiry, “Targeting apoptosis in cancer therapy,” Nat Rev Clin Oncol, vol 17, pp 395-417, Mar 2020 http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn ... Tác động dịch chiết Đìa đụm lên tăng sinh tế bào ung thư 3.1.1 Tác động dịch chiết lên tăng sinh tế bào AGS Để đánh giá ảnh hưởng dịch chiết Đìa đụm lên tăng sinh tế bào ung thư dày AGS MKN45 Kết... thư dày khả cảm ứng trình apoptosis loại ung thư Kết luận Dịch chiết ethanol từ Đìa đụm (Heliciopsis lobata) ức chế tăng sinh tế bào ung thư dày hai dòng tế bào AGS MKN45 với giá trị IC50 tương... sinh dòng tế bào ung thư dày AGS không giống thư? ??ng có giá trị IC50 lớn so với chất tinh từ dịch chiết tổng thể 3.1.2 Tác động dịch chiết lên tăng sinh tế bào MKN45 MKN45 dòng tế bào ung thư dày