Nghiên cứu này tiến hành khảo sát độc tính cấp, khảo sát ảnh hưởng lên thời gian đông máu của cao chiết nước từ lá Lấu đỏ. Dược liệu được thu hái tại tỉnh Quảng Bình, sấy khô và chiết nóng với nước ở 90oC và cô thành cao đặc.
Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 70 Khảo sát độc tính cấp thăm dò tác dụng đông máu dịch chiết nước từ Lấu đỏ Psychotria rubra (Lour.) Poir, Rubiaceae Hoàng Thị Phương Liên**, Nguyễn Thị Thùy Trang, Nguyễn Lê Thanh Tuyền* Khoa Dược, Đại học Nguyễn Tất Thành * nguyenlethanhtuyend09@gmail.com, **htplien@ntt.edu.vn Tóm tắt Ở Việt Nam, Lấu đỏ (Psychotria rubra) dùng dân gian để điều trị nhiều bệnh, đặc biệt xuất huyết, băng huyết Nghiên cứu tiến hành khảo sát độc tính cấp, khảo sát ảnh hưởng lên thời gian đông máu cao chiết nước từ Lấu đỏ Dược liệu thu hái tỉnh Quảng Bình, sấy khơ chiết nóng với nước 90oC cô thành cao đặc Nghiên cứu xác định LD50 cao Lấu đỏ 25,01g/kg Trên mơ hình in vivo liều 2,50 1,25g/kg chuột, cao Lấu đỏ có tác dụng cầm máu khơng làm thay đổi thời gian đơng máu Trên mơ hình in vitro, nồng độ khảo sát: 0,5; 1,0; 2,0mg/ml, cao Lấu đỏ không làm thay đổi thời gian PT APTT so với mẫu chứng DMSO Như vậy, cao Lấu đỏ có tác dụng cầm máu khơng làm ảnh hưởng đến q trình đơng máu Đây dược liệu có tiềm ứng dụng điều trị cầm máu, xuất huyết cần quan tâm nghiên cứu ® 2018 Journal of Science and Technology - NTTU Giới thiệu Trong năm gần đây, thuốc có nguồn gốc từ dược liệu thiên nhiên trở thành đề tài nghiên cứu quan tâm dược liệu khơng hiệu mà hạn chế tác dụng phụ sử dụng lâu dài Lấu đỏ có tên khoa học Psychotria rubra, thuộc họ Cà phê – Rubiaceae, loại có nhiều Việt Nam, phân bố phổ biến hầu hết tỉnh vùng trung du núi thấp, tỉnh từ Quảng Bình trở Một số nghiên cứu giới thực để khảo sát tính chống oxy hóa, gây độc tế bào tác dụng kháng viêm Lấu đỏ [1,2,3] Theo kinh nghiệm dân gian, Lấu đỏ sử dụng điều trị nhiều bệnh, đặc biệt xuất huyết, tiểu máu, sử dụng cho phụ nữ sau sinh nhằm cầm máu giảm đau [4] Tuy nhiên, nghiên cứu độc tính tác dụng dược lí, đặc biệt tác động trình cầm máu đơng máu dược liệu hạn chế Do đó, để đảm bảo tính an tồn, hiệu sử dụng, nghiên cứu tiến hành khảo sát độc tính cấp thăm dò tác dụng cầm máu, đơng máu dịch chiết nước Lấu đỏ mơ hình thực nghiệm Ngun vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên vật liệu Đại học Nguyễn Tất Thành Nhận 24.09.2018 Được duyệt 15.10.2018 Công bố 25.12.2018 Từ khóa Lấu đỏ, Psychotria rubra, độc tính cấp, cầm máu, đông máu 2.1.1 Dược liệu Lá Lấu đỏ (Psychotria rubra) thu hái huyện Minh Hóa, tỉnh Quảng Bình Lá sau thu hái rửa sạch, sấy 60oC 24 2.1.2 Động vật thí nghiệm Chuột nhắt trắng giống Swiss albino từ đến tuần tuổi hai phái, thể trọng chuột từ 20 – 25g cung cấp Viện Vaccin Sinh phẩm Y tế Nha Trang Chuột nuôi ổn định ngày trước tiến hành thử nghiệm Trong trình thử nghiệm, chuột cung cấp đầy đủ thức ăn (cám viên) nước uống Khi thử nghiệm độc tính cho chuột nhịn đói 12 cung cấp nước đầy đủ 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Chiết xuất dược liệu Chiết dược liệu phương pháp chiết nóng theo tỉ lệ 1g bột dược liệu: 5ml nước cất bếp cách thủy 90oC, chiết lần, 30 phút/lần chiết Dịch chiết cô bay bếp cách thủy nhiệt độ 70oC, thu cao chiết nước từ Lấu đỏ Khối lượng cao tồn phần thu từ 1000g dược liệu khơ Lá Lấu đỏ 220,45g Hiệu suất chiết 20,05% Hàm ẩm cao 9,05% Cao thu có màu nâu đỏ, đặc sệt, mùi thơm nhẹ dược liệu 2.2.2 Khảo sát độc tính cấp đường uống Cho chuột (50% đực, 50% cái) nhịn đói 12 trước cho uống thuốc liều tối đa qua đường uống (tối đa Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 71 0,2ml/10g) Theo dõi ghi nhận cử động tổng quát, biểu hành vi, trạng thái lông, ăn uống, tiêu tiểu số lượng chuột chết 72 Nếu sau 72 giờ, chuột khơng có dấu hiệu bất thường chết, tiếp tục theo dõi 14 ngày Chuột chết hay không 72 định bước thử nghiệm: thử nghiệm tiến hành với liều thấp liều trước không cần tiếp tục tiến hành thử nghiệm [5] 2.2.3 Khảo sát tác động trình cầm máu, đông máu in vivo [1,6] Chuột cho uống nước cất (nhóm chứng) uống cao (nhóm thử) với liều ngoại suy từ kết thử độc tính cấp ngày 90 phút sau liều cuối cùng, cắt đuôi chuột đoạn 5mm từ đầu tận Giọt máu hứng lên lam tính thời gian máu đơng hồn tồn để xác định thời gian đông máu Đồng thời, đuôi chuột nhúng vào nước muối sinh lí 37oC Thời gian tính từ bắt đầu nhúng đuôi đến máu ngừng chảy để xác định thời gian chảy máu 2.2.4 Khảo sát tác động q trình đơng máu in vitro [1] Lấy máu chuột nhắt (Swiss albino), chống đông dung dịch citrate 3,8%, tỉ lệ máu citrate 9:1, li tâm (3000 vòng/phút, 15 phút) thu huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP) Để xác định thời gian hoạt hóa thromboplastin phần (APTT) in vitro, lấy huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP) ủ với cao thử thuốc thử APTT phút 37oC Thời gian đông máu APTT xác định từ bắt đầu thêm calci clorid Để đánh giá thời gian prothrobin (PT), ủ huyết tương không tiểu cầu với cao thử phút 37oC Thời gian đơng máu bắt đầu tính từ cho thuốc thử PT 2.2.5 Phân tích thống kê kết Kết xử lí phần mềm Microsoft Excel, trình bày dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn A B giá trị trung bình (Mean ± SEM) đánh giá ý nghĩa thống kê phép kiểm Mann-Whitney phần mềm SPSS 23.0 Sự khác biệt có ý nghĩa p < 0,05 Kết bàn luận 3.1 Kết độc tính cấp đường uống Cho chuột uống cao Lấu đỏ với nồng độ đặc qua kim 4,76g/ml, thể tích cho uống 0,2ml/10 g thể trọng chuột Chuột tử vong đến Trong 30 – 45 phút sau cho uống, chuột bắt đầu giảm hoạt động, nằm im, hơ hấp nhanh, có triệu chứng co thắt vùng bụng liên tục Biểu chuột trước chết: chuột thụ động, nằm im chỗ, hai chân sau co giật Tiếp tục tiến hành thử nghiệm sơ khởi, xác định được: nồng độ tối đa không gây chết chuột (LD0) 21,05g/kg, nồng độ tối thiểu gây chết 100% chuột thử nghiệm (LD100) 34,30g/kg Từ kết thu được, tiến hành thử nghiệm xác định LD50: chuột chia thành lô, gồm phái, cho uống cao chiết từ Lấu đỏ với liều là: 21,05; 23,70; 26,35; 29,50; 31,30; 34,30g/kg thể trọng chuột Kết trình bày Bảng Bảng Kết thử nghiệm xác định LD50 Liều (g/kg) Số chuột/lô Số chuột chết/lô Tỉ lệ chết (%) 21,05 0 23,70 10 60 26,35 12 50 29,50 12 75 31,30 10 90 34,30 6 100 Theo phương pháp Behrens – Karber, LD50 xác định sau: LD50 = LD100 - ∑( ) = 25,01g/kg (a: số thú chết trung bình liều kế tiếp; d: hiệu số liều kế tiếp; ntb: số thú vật trung bình nhóm) Vậy LD50 cao chiết nước từ Lấu đỏ 25,01g/kg C D Hình Đại thể chuột sau thử nghiệm độc tính cấp A: Sinh lý; B: Chuột chết giờ; C: Chuột sống sau 14 ngày; D: Chuột đực sống sau 14 ngày 3.2 Kết tác động q trình cầm máu, đơng máu in vivo Từ kết thử nghiệm độc tính cấp, xác định LD50 = 25,01g/kg Từ đó, ngoại suy liều thử nghiệm tác động cầm máu đông máu cao chiết nước từ Lấu đỏ 2,50g/kg (1/10 LD50) 1,25g/kg (1/20 LD50) Kết thời gian đông máu thời gian chảy máu in vivo trình bày Bảng Bảng Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 72 Bảng Kết thử nghiệm khảo sát thời gian chảy máu cao Lấu đỏ mơ hình in vivo Lơ Sinh lí LD50/10 Thời gian (s) 237,88 59,75** TB ± SEM ± 27,91 ± 13,01 % so với 25,12%** lơ Sinh lí Chú thích: *: p < 0,05**: p < 0,01 LD50/20 92,00** ± 14,35 38,67%** Bảng Kết thử nghiệm khảo sát thời gian đông máu cao Lấu đỏ mơ hình in vivo Lơ Thời gian (s) TB ± SEM % so với lô Sinh lí Sinh lý 252,75 ± 13,29 LD50/10 248,63 ± 10,23 LD50/20 275,63 ± 8,96 98,37% 109,05% Thời gian chảy máu trung bình lơ sinh lí 237,88 ± 27,91 giây Ở lô thử nghiệm, sau cho chuột uống cao chiết nước từ Lấu đỏ với liều 2,50 1,25g/kg, thời gian chảy máu giảm đáng kể so với lơ sinh lí (p < 0,01), tỉ lệ giảm 74,88% (Lô 2) 61,32% (Lô 3) Thời gian chảy máu liều thử nghiệm khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Thời gian đơng máu trung bình lơ sinh lí 252,75 ± 13,29 giây Ở lô thử nghiệm, thời gian đông máu thay đổi không đáng kể so với lơ sinh lí (p > 0,05) khơng có khác biệt thời gian đông máu hai lô thử nghiệm 3.3 Kết tác động trình đơng máu in vitro Đánh giá ảnh hưởng Lấu đỏ đường đông máu ngoại sinh nội sinh qua thông số PT APTT Huyết tương nghèo tiểu cầu ủ với cao Lấu đỏ nồng độ 0,5; 1,0; 2,0mg/ml Kết so sánh với mẫu chứng DMSO dung mơi hòa tan cao, trình bày Bảng Bảng Tác động cao Lấu đỏ lên PT APTT Mẫu DMSO 0,5 mg/ml PT (s) TB ± SEM 18,48 ± 1,16 17,00 ± 1,21 Đại học Nguyễn Tất Thành APTT (s) TB ± SEM 24,48 ± 1,73 26,89 ± 3,62 1,0 mg/ml 2,0 mg/ml 17,55 ± 0,34 17,51 ± 1,44 28,66 ± 2,69 21,94 ± 1,78 Sau ủ huyết tương với cao chiết từ Lấu đỏ nồng độ thử nghiệm, thời gian PT APTT thay đổi không đáng kể so với lô chứng (p > 0,05) 3.4 Bàn luận Nghiên cứu xác định LD50 cao chiết nước từ Lấu đỏ 25,01g/kg thể trọng chuột Sau xác định độc tính cấp, đề tài tiến hành khảo sát ảnh hưởng cao chiết Lấu đỏ lên thời gian chảy máu, đông máu in vivo liều 2,50 1,25g/kg Kết cho thấy Lấu đỏ làm giảm thời gian chảy máu đáng kể so với lơ sinh lí hai liều thử nghiệm (p < 0,01), tác động không khác biệt liều Tuy nhiên, cao Lấu đỏ không làm thay đổi thời gian đông máu so với lơ sinh lí (p > 0,05) Trên mơ hình in vitro, cao chiết nước Lấu đỏ tất nồng độ thử nghiệm không làm thay đổi thời gian PT APTT so với mẫu chứng DMSO Điều giải thích q trình cầm máu kết hợp nhiều giai đoạn khác như: co mạch chỗ, kết tập tiểu cầu, tạo cục máu đơng [7] Cao Lấu đỏ có hiệu cầm máu, làm giảm thời gian chảy máu không làm ảnh hưởng đến yếu tố đông máu không làm thay đổi thời gian đông máu Kết luận Đề tài tiến hành chiết cao đặc, xác định LD50 cao Lấu đỏ 25,01g/kg thể trọng chuột Cao chiết từ Lấu đỏ có tác dụng cầm máu, làm giảm thời gian chảy máu mơ hình cắt chuột nhắt liều thử nghiệm 2,50 1,25g/kg Cao Lấu đỏ không làm ảnh hưởng đến thời gian đông máu mơ hình in vivo Mơ hình in vitro khảo sát ảnh hưởng cao Lấu đỏ lên thông số PT, APTT cho thấy nồng độ thử nghiệm 0,5; 1,0; 2,0mg/ml; cao Lấu đỏ không làm thay đổi thời gian PT, APTT so với mẫu chứng DMSO Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 73 Tài liệu tham khảo Hao Chen et al., (2014), Effect of Toona microcarpa Harms Leaf Extract on the Coagulation System, BioMed Research International Hayashi T., Smith F.T., Lee K.H., Antitumor agents Psychorubrin, a new cytotoxic naphthoquinone from Psychotria rubra and its structure-activity relationships, J Med Chem., 30(11), (1987), 2005-8 Jin, K S., Kown, H J., & Kim, B W (2014) Anti-Oxidative and Anti-Inflammatory Effects of Malus huphensis, Ophiorrhiza cantonensis, and Psychotria rubra Ethanol Extracts Korean Journal of Microbiology and Biotechnology Từ điển thuốc Việt Nam, Võ Văn Chi, Nhà xuất Y học, 2012, trang 1305 – 1306 Đỗ Trung Đàm (2014), Phương pháp xác định độc tính thuốc, Nhà xuất Y học, Hà Nội, pp 7, 15 – 215 Zhou W., Abdurahman A., Umar A., Iskander G., Abdusalam E., Berké B., Besgaud B., Moore N (2014), “Effects of Cydonia oblonga Miller extracts on blood hemostasis, coagulation andfibrinolysis in mice, and experimental thrombosis in rats”, Journal of Ethnopharmacology, 154, 63-169 Bộ Y tế (2008), Giải phẫu sinh lí người , Nhà xuất Giáo dục Việt Nam, tr.78-86 Determination of acute toxicity and investigate coagulation activity of Psychotria rubra aqueous extract Hoang Thi Phuong Lien**, Nguyen Thi Thuy Trang, Nguyen Le Thanh Tuyen* Pharmacy Faculty of Nguyen Tat Thanh University * nguyenlethanhtuyend09@gmail.com, **htplien@ntt.edu.vn Abstract In Viet Nam, Lau (Psychotria rubra) is used for treatments, such as bleeding This study was conducted for the purpose of determinating acute toxicity and evaluating the hemostatic and coagulation effects of Psychotria rubra aqueous extract Lau was collected at Quang Binh province, dried and extract to aqueous extract The results showed that LD50 of aqueous extract is 25,01mg/kg In in vivo model, extract of Psychotria rubra has hemostatic effect at dosages: 2,50 and 1,25g/kg but doesn’t has coagulation effect In in vitro model, the extract in concentrations: 0,5; 1,0; 2,0mg/ml does not change PT and APTT time compare to DMSO This extract shows significant hemostatic effect but doesn’t has coagulation effect This is a highly potential medicinal plant for the treatment of bleeding diseases and should be investigated the others pharmacological effects Keywords Lau do, Psychotria rubra, acute toxicity, hemostatic, coagulation Đại học Nguyễn Tất Thành ... động trình cầm máu, đông máu in vivo Từ kết thử nghiệm độc tính cấp, xác định LD50 = 25,01g/kg Từ đó, ngoại suy liều thử nghiệm tác động cầm máu đông máu cao chiết nước từ Lấu đỏ 2,50g/kg (1/10... Sau xác định độc tính cấp, đề tài tiến hành khảo sát ảnh hưởng cao chiết Lấu đỏ lên thời gian chảy máu, đông máu in vivo liều 2,50 1,25g/kg Kết cho thấy Lấu đỏ làm giảm thời gian chảy máu đáng kể... đổi thời gian đông máu Kết luận Đề tài tiến hành chiết cao đặc, xác định LD50 cao Lấu đỏ 25,01g/kg thể trọng chuột Cao chiết từ Lấu đỏ có tác dụng cầm máu, làm giảm thời gian chảy máu mô hình cắt