Đề tài khảo sát độc tính cấp đường uống và tác động hạ đường huyết trên chuột nhắt của viên nang cứng Insutrix chứa cao mềm chiết từ hỗn hợp các dược liệu lá Mã đề, thân rễ Nghệ và hoa Hòe.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH CẤP ĐƯỜNG UỐNG VÀ TÁC ĐỘNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT TRÊN CHUỘT NHẮT CỦA VIÊN NANG CỨNG INSUTRIX Đỗ Thị Hồng Tươi*, Lộ Nữ Hoàng Thư*, Dương Thị Mộng Ngọc** TÓM TẮT Mục tiêu: Đề tài khảo sát độc tính cấp đường uống tác động hạ đường huyết chuột nhắt viên nang cứng Insutrix chứa cao mềm chiết từ hỗn hợp dược liệu Mã đề, thân rễ Nghệ hoa Hòe Phương pháp: Khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-amylase α-glucosidase in vitro bột thuốc viên nang cứng Insutrix phương pháp so màu Các thử nghiệm in vivo chuột nhắt Swiss albino, 6-7 tuần tuổi, trọng lượng trung bình khoảng 25 g Khảo sát độc tính cấp đường uống cao chuột đực cái, theo dõi tỷ lệ chết biểu độc tính 72 Tác dụng hạ đường huyết viên Insutrix đánh giá chuột đực bình thường chuột gây đái tháo đường cách tiêm tĩnh mạch streptozotocin liều 170 mg/kg cho uống viên Insutrix liều 250, 500 1000 mg/kg ngày 14 ngày; đo nồng độ glucose ngày 15 ngày Glibenclamid mg/kg sử dụng làm thuốc đối chứng Kết quả: Bột thuốc viên Insutrix ức chế enzym α-amylase α-glucosidase in vitro với giá trị IC50 652,09 µg/ml 927,8 µg/ml so với 13,66 µg/ml 429,24 µg/ml đối chứng dương acarbose Viên Insutrix độc tính cấp đường uống chuột với liều tối đa Dmax 10 g/kg Trên chuột khỏe mạnh, viên Insutrix không làm hạ đường huyết Trên mơ hình tăng đường huyết, sau tuần điều trị, viên Insutrix cho chuột uống với liều 250, 500 1000 mg/kg giảm đường huyết 54%, 24% 51% so với 47% nhóm glibenclamid Tác dụng hạ đường huyết thể sớm theo thứ tự liều 250 mg/kg > 500 mg/kg > 1000 mg/kg; liều 250 mg/kg thể tác dụng tương đương với glibenclamid mg/kg Kết luận: Viên nang cứng Insutrix khơng thể độc tính cấp đường uống liều tối đa Dmax 10 g/kg Chế phẩm thể tác động hạ đường huyết liều cho uống 250, 500 1000 mg/kg theo thứ tự sớm sau: liều 250 mg/kg > 500 mg/kg > 1000 mg/kg Khả ức chế enzym α-amylase ức chế α-glucosidase chế tác động viên Insutrix Từ khóa: viên nang cứng Insutrix, α-amylase, α-glucosidase, độc tính cấp, tác dụng hạ đường huyết ABSTRACT STUDY ON ORAL ACUTE TOXICITY AND HYPOGLYCEMIC EFFECT OF INSUTRIX CAPSULE IN MICE Do Thi Hong Tuoi, Lo Nu Hoang Thu, Duong Thi Mong Ngoc * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 22 - No 5- 2018: 115 – 122 Objectives: This study aim to evaluate oral acute toxicity and hypoglycemic effect of Insutrix capsule from extract of mixture of Plantago asiatica L., Curcuma longa L and Sophora japonica L Methods: For in vitro study, inhibitory activity on α-amylase and α-glucosidase was performed by spectrophotometrical methods In vivo experiments were carried out in Swiss albino mice, 6-7 week aged; weighing 25 g The oral acute toxicity in male and female mice was studied on the death rate within 72 hours after being dosed Hypoglycemic effect of Insutrix capsule was evaluated in normal mice and hyperglycemic mice induced by iv streptozotocine at 170 mg/kg Mice were orally given Insutrix capsule every day at the doses of 250, Khoa Dược - Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh ** Trung tâm Sâm Dược liệu TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS.TS Đỗ Thị Hồng Tươi ĐT: 0908683080 Email: hongtuoi@ump.edu.vn 115 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 500 and 1000 mg/kg for 14 days Blood glucose was determined every days for 15 days Glibenclamide mg/kg was used as a drug reference Results: Insutrix capsule could inhibit in vitro activity of α-amylase and α-glucosidase with IC50 values of 652.09 µg/ml 927.8 µg/ml compared to those of 13.66 µg/ml and 429.24 µg/ml of acarbose postitive control This product had no oral acute toxicity in Swiss albino mice at the maximum dose of 10 g/kg body weight Insutrix capsule did not exhibe hypoglycemic effect in normal mice In streptozotocin-induced hyperglycemic model, after weeks treatment, glucose levels of mice treated with Insutrix capsule at 250 mg/kg, 500 mg/kg and 1000 mg/kg were decreased 54%, 24% and 51%, respectively, compared to 47% of mg/kg glibenclamide group The hypoglycemic effect early expressed in the order: 250 mg/kg > 500 mg/kg > 1000 mg/kg; in which that of the dose at 250 mg/kg was similar to that of mg/kg glibenclamide Conclusions: Insutrix capsule did not show oral acute toxicity in mice at the maximum oral dose (Dmax) of 10 g/kg This product exhibed hypoglycemic effect at the oral doses of 250, 500 and 1000 mg/kg in the early order: 250 mg/kg > 500 mg/kg > 1000 mg/kg Its inhibitory activity on α-amylase and α-glucosidase could be one of mechanisms of hypoglycemic effect Keywords: Insutrix capsule, α-amylase, α-glucosidase, acute toxicity, hypoglycemic effect vậy, đề tài thực khảo sát độc tính cấp ĐẶT VẤN ĐỀ đường uống tác động hạ đường huyết Đái tháo đường rối loạn chuột nhắt viên nang cứng Insutrix nhằm chuyển hóa gây biến chứng nghiêm trọng cung cấp sở khoa học tính an tồn tác tỷ lệ bệnh nhân ngày tăng(15) Hiện nay, động hạ đường huyết chế phẩm bên cạnh thuốc tổng hợp, xu hướng điều trị đái ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU tháo đường sử dụng thuốc từ dược liệu giúp kiểm soát đường huyết, hạn chế tác dụng Mẫu thử phụ dùng thời gian dài Ở Việt Nam, Viên nang cứng Insutrix sản xuất ngày số dược liệu báo cáo tác dụng hạ 02/8/2017 đạt tiêu chuẩn sở Viên chứa 25% đường huyết Mướp đắng, Cam thảo, Giảo khối lượng cao mềm chiết từ hỗn hợp dược cổ lam, Chè đắng, Hoàng kỳ Mã đề (Plantago liệu Mã đề, thân rễ Nghệ hoa Hòe, đóng asiatica L.) thường dùng trị bí đái, đái máu, ho gói chai nhựa nút kín ThS Dương Thị lâu ngày, viêm khí quản, đau mắt đỏ(13) Ở Giava, Mộng Ngọc cung cấp Viên chứa bột thuốc màu toàn Mã đề dùng sắc uống trị đái tháo nâu đen, mùi thơm đặc trưng đường(4) Nghệ (Curcuma longa L.) dân Động vật thử nghiệm gian sử dụng điều trị bệnh đái tháo đường, Chuột nhắt Swiss albino đực, - tuần tuổi, hoạt chất curcumin báo cáo tác trung bình khoảng 25 g Viện Vaccin Sinh dụng làm giảm đường huyết, bảo vệ tế bào tụy phẩm Y tế Nha Trang cung cấp Chuột khoẻ tăng độ nhạy cảm với insulin(2,11) Ngồi ra, mạnh, khơng có biểu bất thường, ni flavonoid có nhiều thân rễ Nghệ Hòe ổn định ngày, ni lồng nhựa 25 x 35 x hoa (Sophora japonica L.) thể tác dụng chống 15 cm (6 chuột/lồng) cung cấp thức ăn, nước oxy hóa, bảo vệ quan khỏi tổn thương uống đầy đủ thời gian thử nghiệm tình trạng đường huyết cao gây Từ Hóa chất sở trên, ThS Dương Thị Mộng Ngọc nghiên cứu bào chế viên nang cứng Insutrix chứa cao Streptozotocin, α-amylase, α-glucosidase, mềm chiết từ hỗn hợp dược liệu Mã p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (pNPG) đề, thân rễ Nghệ hoa Hòe với định hướng (Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ); acarbose (CKD Bio, ứng dụng điều trị bệnh đái tháo đường Vì Hàn Quốc), ethylen diamin tetra-acetic 116 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học (EDTA) (Merck, Đức), kit định lượng glucose (Clinitech, Pháp), glibenclamid (Stada, Việt Nam), tinh bột, Na2CO3, cồn 96%, ether ethylic (Guangdong Guanghua, Trung Quốc), NaCl 0,9% (OPV, Việt Nam) ODso màu mẫu thử)] / (ODmẫu chuẩn-ODso màu mẫu chuẩn) x 100 Xác định giá trị IC50 (nồng độ mẫu thử ức chế 50% hoạt tính α-glucosidase) dựa vào phương trình hồi quy % ức chế nồng độ mẫu thử Phương pháp nghiên cứu Khảo sát độc tính cấp đường uống chuột (50% đực, 50% cái) nhịn đói 12 giờ, cho uống viên nang Insutrix liều tối đa qua kim (thể tích 0,2 ml/10g) theo “Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu” Bộ Y tế (3) Theo dõi ghi nhận cử động tổng quát, biểu hành vi, trạng thái lông, ăn uống, tiêu tiểu số lượng chết chuột 72 Nếu sau 72 giờ, chuột khơng có dấu hiệu bất thường chết, tiếp tục theo dõi vòng ngày Nếu có chuột chết, giảm liều, tìm liều tối thiểu gây chết 100% chuột (LD100), liều tối đa không gây chết chuột (LD0) liều gây chết 50% chuột (LD50) Thiết kế thực nghiệm, đo lường độc lập Khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-amylase in vitro Amylase xúc tác phản ứng thủy giải tinh bột thành đường đơn, đường đôi hay dextrin phân tử lớn Lượng maltose giải phóng xác định phương pháp tạo màu với hỗn hợp thuốc thử Hoạt tính ức chế α-amylase khảo sát dựa vào phương pháp đo màu(6) Hỗn hợp phản ứng gồm ml tinh bột 1% (kl/tt), ml α-amylase (1,5 đơn vị/ml) pha đệm acetat 0,1 M (pH 7,2), ml dung dịch mẫu thử (bột thuốc viên nang cứng Insutrix/đối chứng acarbose), ml đệm acetat Ủ hỗn hợp 25 phút 37°C Thêm ml HCl 1N, trộn để kết thúc phản ứng Thêm 0,1 ml iod 1% Đo OD 565 nm Mẫu chuẩn (có α-amylase, khơng có mẫu thử) tiến hành song song Lặp lại thí nghiệm lần, lấy giá trị trung bình xác định hoạt tính ức chế enzym α-amylase: % ức chế = (ODmẫu thử ODmẫu chuẩn)/ ODmẫu chuẩn x 100 Xác định IC50 (nồng độ ức chế 50% hoạt tính α-amylase) dựa vào phương trình hồi quy % ức chế nồng độ mẫu thử Khảo sát tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro(12) Hỗn hợp phản ứng gồm 40 µl α-glucosidase (0,2 đơn vị/ml), 50 µl mẫu thử acarbose đệm phosphat pH 6,8 (so màu mẫu thử) Ủ 20 phút nhiệt độ phòng, thêm 40 µl pNPG mM đệm phosphat pH 6,8 Trộn đều, ủ 20 phút nhiệt độ phòng Kết thúc phản ứng cách thêm 130 µl Na2CO3 0,2 M (pH 9,7), trộn Đo OD 405 nm Mẫu chuẩn (không có mẫu thử) tiến hành song song Hoạt tính ức chế α-glucosidase tính theo cơng thức: % ức chế = [(ODmẫu chuẩn-ODso màu mẫu chuẩn) - (ODmẫu thử- Khảo sát tác động lên trọng lượng đường huyết chuột nhắt trắng bình thường Chuột bình thường khỏe mạnh chia ngẫu nhiên thành lô: lô sinh lý: cho chuột uống nước cất, lô thử cho uống viên nang Insutrix với liều 250 mg/kg, 500 mg/kg 1000 mg/kg, lần/ngày vào buổi sáng 14 ngày Đường huyết chuột đo ngày Lấy máu tĩnh mạch đuôi chuột vào buổi sáng sau cho chuột nhịn đói qua đêm Khảo sát tác động lên trọng lượng đường huyết chuột nhắt trắng gây đái tháo đường streptozotocin(8) Chuột cho nhịn đói 12 giờ, gây tăng đường huyết cách tiêm tĩnh mạch streptozotocin (pha NaCl 0,9%) liều 170 mg/kg Sau ngày tiêm streptozotocin, định lượng glucose máu (cho chuột nhịn đói 12 giờ) Những chuột có đường huyết đói ≥ 200 mg/dl xem chuột đái tháo đường, điều trị glibenclamid mg/kg (đối chứng dương) viên Insutrix liều 250 mg/kg, 500 117 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học mg/kg 1000 mg/kg, cho uống lần/ngày vào buổi sáng (8 - 10 giờ) 14 ngày Theo dõi đường huyết chuột thử nghiệm ngày theo nguyên tắc enzym màu kit định lượng glucose (Clinitech, Pháp) Nồng độ glucose tính theo cơng thức: Nồng độ glucose (mg/dl) = [(Athử - Atrắng)/(Achuẩn - Atrắng)] x Cchuẩn x độ pha loãng Xử lý kết phân tích thống kê Kết trình bày dạng trung bình ± sai số chuẩn giá trị trung bình (Mean ± SEM) Số liệu phân tích thống kê phép kiểm Kruskal-Wallis Mann-Whitney với phần mềm SPSS 22.0 Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê p < 0,05 KẾT QUẢ Hoạt tính ức chế enzym α-amylase in vitro Khảo sát sơ cho thấy hoạt tính ức chế αamylase in vitro bột thuốc viên nang Insutrix 1000 µg/ml khoảng 55% Kết thấy bột thuốc viên Insutrix thể hoạt tính ức chế enzym α-amylase với giá trị IC50 652,09 µg/ml cao 49,6 lần so với IC50 mẫu đối chứng acarbose 13,15 µg/ml (Bảng 1) tương tự giá trị IC50 acarbose 12,48 µg/ml báo cáo trước nhóm nghiên cứu(7) Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase in vitro Từ kết thu được, xác định giá trị IC50 bột thuốc viên nang Insutrix đối chứng dương acarbose 927,8 µg/ml 434,0 µg/ml (Bảng 2) Bảng Hoạt tính ức chế enzym α-amylase in vitro theo nồng độ Chất đối chiếu acarbose Nồng độ (µg/ml) % ức chế (Mean ± SD) 2,5 22,84 ± 4,02 29,71 ± 3,72 10 41,06 ± 1,60 15 56,65 ± 0,26 20 62,36 ± 1,63 25 78,32 ± 1,98 30 83,59 ± 2,92 Phương trình: y = 0,0013x + 0,2945x - 4,8268 R = 0,9905 IC50 = 13,15 µg/ml Bột thuốc viên nang cứng Insutrix Nồng độ (µg/ml) % ức chế (Mean ± SD) 125 14,76 ± 9,81 250 30,96 ± 7,24 500 50,27 ± 4,88 1000 54,81 ± 7,94 1500 64,75 ± 1,96 2000 77,15 ± 4,01 3000 80,79 ± 0,50 Phương trình: y = 0,8011x - 38,248x + 561,74 R = 0,9553 IC50 = 652,09 µg/ml Bảng Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase in vitro mẫu thử đối chứng acarbose Nồng độ (µg/ml) 1000 500 250 125 62,5 31,25 Acarbose Hoạt tính ức chế (%) 75,87 ± 2,18 55,34 ± 2,49 36,93 ± 4,22 23,62 ± 2,15 20,10 ± 2,98 7,68 ± 2,70 Phương trình: y = 0,1792x + 0,7993x + 25,964 R = 0,9986 IC50 = 434,0 µg/ml Độc tính cấp đường uống viên nang Insutrix Khảo sát chuột với liều tối đa bơm qua kim 10 g/kg Sau cho chuột uống, tất chuột khỏe mạnh, ăn cám viên, uống nước, tiêu tiểu, cử động bình thường, khơng có 118 Bột thuốc viên nang cứng Insutrix Nồng độ (µg/ml) Hoạt tính ức chế (%) 2000 76,75 ± 4,22 1500 60,93 ± 2,66 1000 50,95 ± 2,92 500 41,42 ± 1,68 250 24,57 ± 1,99 125 12,97 ± 4,97 31,25 7,82 ± 5,62 Phương trình: y = 0,3137x + 3,0199x - 7,4405 R = 0,983 IC50 = 927,8 µg/ml dấu hiệu bất thường khơng có chuột chết 72 ngày quan sát Như vậy, viên nang Insutrix không xác định giá trị LD50, độc tính cấp đường uống với liều tối đa cho uống (Dmax) 10 g/kg trọng lượng chuột Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Tác động lên trọng lượng đường huyết chuột bình thường Kết cho thấy thay đổi đường huyết chuột bình thường cho uống viên Insutrix liều 250 mg/kg, 500 mg/kg 1000 mg/kg so với lơ sinh lý khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Như vậy, việc uống viên Insutrix khơng ảnh hưởng đường huyết chuột bình thường (Bảng Bảng 4) Tác động lên trọng lượng đường huyết chuột bị đái tháo đường Các lơ tiêm streptozotocin có khối lượng thể giảm khoảng 5,5 g - 16 g so với chuột sinh lý thời điểm N0 thời điểm khảo sát 14 ngày (p < 0,05) Kết chứng tỏ streptozotocin gây độc tế bào tụy dẫn đến tình trạng tăng đường huyết giảm trọng lượng thể chuột vào ngày N0 tiếp tục tiến triển thời gian thử nghiệm Lô chứng bệnh trọng lượng giảm dần theo thời gian (khoảng 3,5 - g vào ngày cuối so với thời điểm N0), lô điều trị (3 lô cho uống viên Insutrix lô glibenclamid) cho thấy trọng lượng thể ổn định tăng nhẹ Tuy nhiên, so với lô chứng bệnh, trọng lượng không khác biệt thời điểm khảo sát (p > 0,05), trừ lô uống Insutrix liều 500 g/kg vào ngày 10, 11, 13 Insutrix liều 250 g/kg ngày 10 có trọng lượng thể cao lô chứng bệnh (p < 0,05; Bảng 5) Điều chứng tỏ việc uống viên Insutrix giúp trì thể trạng chuột Tại thời điểm ban đầu, chuột tiêm streptozotocin có đường huyết tăng cao hơn, gấp 2,7 lần so với chuột sinh lý (p < 0,01) Những chuột có đường huyết lớn 200 mg/dL phân chia vào lô (chứng bệnh, glibenclamid lô uống Insutrix) cho đường huyết trung bình lơ khác khơng có ý nghĩa (p > 0,05, Bảng 6) Sau ngày điều trị, kết cho thấy có lơ đối chứng glibenclamid mg/kg lơ cho uống viên nang Insutrix liều 250 mg/kg làm giảm đường huyết khoảng 24% 38% so với Nghiên cứu Y học thời điểm trước điều trị thấp có ý nghĩa thống kê so với lơ chứng bệnh thời điểm (p < 0,05) Đối với lô uống viên nang Insutrix liều 1000 mg/kg 500 mg/kg, đường huyết chuột giảm khoảng 30 mg/dL so với thời điểm trước điều trị khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh thời điểm khảo sát (p > 0,05) Vào ngày 10, đường huyết chuột lô điều trị glibenclamid mg/kg, viên nang Insutrix liều 500 mg/kg 250 mg/kg giảm khoảng 31%, 29% 40% so với thời điểm trước điều trị thấp có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh (p < 0,05), lô cho uống viên Insutrix liều 1000 mg/kg có đường huyết tương đương với thời điểm trước điều trị tương đương với lô chứng bệnh khảo sát thời điểm (p > 0,05) Sau 15 ngày điều trị, lô điều trị glibenclamid mg/kg, Insutrix liều 1000 mg/kg, 500 mg/kg 250 mg/kg giảm 47%, 51%, 24% 54% so với thời điểm trước điều trị thấp có ý nghĩa thống kê so với lơ chứng bệnh thời điểm (p < 0,05) So sánh lô cho uống viên nang Insutrix liều 1000 mg/kg, 500 mg/kg 250 mg/kg, đường huyết lơ uống liều 1000 mg/kg cao có có nghĩa thống kê so với liều sau ngày 10 ngày (p > 0,05); khác biệt ý nghĩa so với liều lại sau 15 ngày điều trị (p > 0,05) Giữa liều 500 mg/kg 250 mg/kg, đường huyết chuột thử nghiệm khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê thời điểm khảo sát sau điều trị (p > 0,05) So với glibenclamid mg/kg, tác động hạ đường huyết lô Insutrix 250 mg/kg khác biệt khơng có ý nghĩa sau 5, 10 15 ngày điều trị (p < 0,05) Lơ Insutrix 500 mg/kg có đường huyết không khác biệt sau 10 ngày điều trị (p > 0,05), đường huyết cao có ý nghĩa sau 15 ngày điều trị (p < 0,05) Insutrix liều 1000 mg/kg thể tác động hạ đường huyết tương đương glibenclamid sau 15 ngày (p > 0,05) 119 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học sau 10 ngày (p < 0,05) sớm theo thứ tự: 250 mg/kg > 500 mg/kg > 1000 mg/kg; liều 250 mg/kg thể tác động tương đương glibenclamid mg/kg Như vậy, viên Insutrix ba liều khảo sát thể tác động hạ đường huyết chậm đối chứng glibenclamid mg/kg Tác động xuất Bảng Trọng lượng trung bình lơ chuột bình thường 15 ngày (N: ngày) Lô (n=8) N0 N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10 N11 N12 N13 N14 Sinh lý 26,0 ± 28,4 ± 29,7 ± 27,5 ± 29,9 ± 29,5 ± 29,0± 30,7 ± 31,1 ± 30,4 ± 30,1 ± 30,7 ± 31,3 ± 32,1 ± 32,8± 0,7 0,8 1,1 1,2 1,4 1,5 1,4 1,3 1,6 1,3 1,4 1,3 1,3 1,2 1,3 Insutrix 1000 mg/kg 24,4 ± 27,4 ± 28,5 ± 29,3 ± 28,1 ± 29,0 ± 29,4± 30,1 ± 30,2 ± 30,1 ± 28,6 ± 30,2 ± 30,5 ± 31,0 ± 32,0± 0,5 0,6 0,7 0,7 0,7 0,8 0,8 0,8 0,7 0,9 0,9 0,8 0,9 0,9 0,8 Insutrix 500 mg/kg 26,1 ± 28,7 ± 30,8 ± 31,3 ± 30,7 ± 30,8 ± 30,8 ± 31,3 ± 31,7 ± 31,2 ± 29,2 ± 31,3 ± 31,4 ± 32,4 ± 30,3± 0,7 1,0 1,0 1,0 1,0 1,1 1,2 1,1 1,1 1,1 1,0 1,3 1,3 1,5 1,5 Insutrix 250 mg/kg 27,0 ± 29,6 ± 31,3 ± 31,6 ± 30,4 ± 30,9 ± 31,3± 32,2 ± 31,9 ± 32,1 ± 30,8 ± 32,1 ± 31,9 ± 32,5 ± 31,7± 0,6 0,7 0,8 0,8 0,9 1,2 1,2 1,1 1,3 1,6 1,7 1,9 2,0 2,1 1,9 Bảng Nồng độ glucose huyết chuột bình thường lơ Lơ (n = 8) Đường huyết trung bình ± SEM (mg/dL) Ngày Ngày 10 84,75 ± 4,22 83,40 ± 5,05 85,22 ± 5,49 85,62 ± 5,76 81,36 ± 5,85 84,78 ± 4,76 68,84 ± 4,40 83,94 ± 7,21 Ngày 78,18 ± 4,29 69,65 ± 7,56 80,95 ± 6,64 73,38 ± 4,63 Sinh lý Insutrix 1000 mg/kg Insutrix 500 mg/kg Insutrix 250 mg/kg Ngày 15 84,52 ± 5,15 80,93 ± 3,49 99,22 ± 6,74 81,28 ± 3,92 Bảng Trọng lượng trung bình lô chuột đái tháo đường 15 ngày (N: ngày) Lô (n=6) N0 N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10 N11 N12 N13 N14 Sinh lý 38,3 ± 39,2 ± 39,4 ± 41,3 ± 40,6 ± 41,5 ± 41,9 ± 42,4 ± 41,9 ± 42,6 ± 43,1 ± 42,1 ± 44,4 ± 44,5 ± 43,3± 1,0 1,0 0,8 0,9 0,7 0,9 1,0 1,0 0,6 0,9 1,2 0,9 1,4 1,6 1,4 Chứng bệnh 32,7 ± 32,7± 32,3 ± 32,7 ± 32,5 ± 31,3 ± 30,7 ± 30,5 ± 30,3 ± 29,5 ± 29,1 ± 28,7 ± 29,5 ± 28,7 ± 29,0 ± 1,4* 1,7* 2,0* 2,1* 2,1* 2,2* 1,8* 1,6* 1,3* 1,2* 1,1* 1,3* 1,2* 1,3* 1,5* Glibenclami 29,9± 29,6± 28,9 ± 29,6 ± 29,6 ± 28,3 ± 28,9 ± 28,9 ± 29,3 ± 29,3 ± 28,3 ± 28,1 ± 28,8 ± 29,0 ± 28,9± d 5mg/kg 1,9* 1,8* 2,0* 1,8* 1,7* 1,5* 1,7* 1,7* 1,8* 1,9* 1,8* 2,0* 2,1* 2,1* 2,1* Insutrix 1000 32,3± 31,9 ± 31,0 ± 31,0 ± 30,2 ± 29,1 ± 29,4 ± 29,5 ± 30,1 ± 28,9 ± 29,7 ± 29,2 ± 29,8 ± 29,1 ± 29,4± mg/kg 1,3* 1,3* 1,1* 1,1* 1,1* 1,2* 1,1* 1,2* 1,1* 0,8* 1,5* 1,2* 1,3* 1,1* 1,4* Insutrix 500 32,6± 32,9 ± 34,1 ± 34,9 ± 32,9 ± 33,2 ± 34,5 ± 35,1 ± 33,4 ± 33,1 ± 34,3 ± 33,6 ± 31,5 ± 33,8± 33,2± # # # mg/kg 1,8* 1,6* 1,6* 1,6* 1,7* 1,7* 1,7* 1,7* 1,6* 1,8* 1,7* 1,5* 1,2* 1,6* 2,0* Insutrix 250 31,6± 31,5 ± 32,8 ± 33,5 ± 31,4 ± 30,7 ± 33,3 ± 33,2 ± 30,5 ± 31,5 ± 32,2± 31,1 ± 33,0 ± 31,8 ± 31,9± # mg/kg 0,9* 0,9* 0,9* 0,9* 1,2* 0,9* 1,0* 0,9* 1,6* 0,9* 1,0* 1,2* 0,8* 1,0* 1,0* * p < 0,05 so với lô sinh lý # p < 0,05 so với lô chứng bệnh thời điểm khảo sát Bảng Đường huyết chuột bị đái tháo đường lô vào ngày 0, 5, 10, 15 Lô (n = 6) Sinh lý Chứng bệnh Glibenclamid mg/kg Insutrix 1000 mg/kg Insutrix 500 mg/kg Insutrix 250 mg/kg Ngày 102,28 ± 5,11 ** 276,27 ± 10,30 ** 264,15 ± 13,52 ** 282,37 ± 22,70 ** 254,65 ± 20,48 ** 270,16 ± 16,46 Đường huyết trung bình ± SEM (ml/dL) Ngày Ngày 10 67,07 ± 2,35 62,56 ± 5,76 ** ** 271,03 ± 17,23 316,87 ± 27,81 **# **## 201,33 ± 13,71 181,38 ± 18,11 **$ **$ 254,27 ± 12,17 287,59 ± 29,87 ** **# 219,91 ± 21,82 181,08 ± 22,84 **## **## 166,60 ± 18,80 160,94 ± 20,15 Ngày 15 77,28 ± 2,23 ** 295,77 ± 30,27 **## 139,28 ± 8,73 # 138,28 ± 15,34 **#$ 193,56 ± 16,43 # 125,33 ± 30,04 ** p < 0,01: so với lô sinh lý; # p < 0,05; ## p < 0,01: so với lô chứng bệnh $ p < 0,05: so với lô glibenclamid thời điểm khảo sát 120 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 BÀN LUẬN Bên cạnh việc sử dụng dược liệu riêng lẻ điều trị bệnh đái tháo đường, số chế phẩm Trung Quốc, Ấn Độ Việt Nam thường kết hợp nhiều dược liệu để tăng hiệu kiểm soát bệnh Viên nang cứng bào chế từ cao mềm chiết từ hỗn hợp Mã đề, thân rễ Nghệ hoa Hòe phù hợp với định hướng chung Việt Nam giới Một chế điều trị đái tháo đường làm giảm tiêu hóa hấp thu carbohydrat ruột non qua chế ức chế α-amyase αglucosidase, hai enzym tham gia phân giải thủy phân phân tử carbohydrat thành đường đơn hấp thu vào máu Kết tác dụng ức chế α-amyase α-glucosidase bột thuốc viên Insutrix thu đề tài phù hợp với báo cáo trước tác dụng ức chế hai enzym rutin, quercetin có hoa Hòe curcumin, demethoxycurcumin, bisdemethoxycurcumin phân lập từ củ Nghệ(5,10) Với kết viên Insutrix khơng thể độc tính cấp Dmax 10 g/kg, đề tài chọn liều 250, 500 1000 mg/kg để khảo sát tác động hạ đường huyết in vivo Các liều tương ứng với 1/40, 1/20 1/10 Dmax, phù hợp với khuyến cáo liều thử tác dụng dược lý Bộ Y tế(3) Ở ba liều khảo sát, viên Insutrix không ảnh hưởng lên thể trọng đường huyết chuột bình thường; bước đầu chứng tỏ tính an tồn chế phẩm Trên mơ hình chuột đái tháo đường gây streptozotocin, viên Insutrix thể tác động hạ đường huyết sớm theo thứ tự: 250 mg/kg > 500 mg/kg > 1000 mg/kg; liều 250 mg/kg thể tác động tương đương thuốc đối chứng glibenclamid mg/kg Tác động viên Insutrix phù hợp với báo cáo khả hạ đường huyết cao cồn từ Mã đề liều 1000 mg/kg chuột cống bị đái tháo đường báo cáo nhóm nghiên cứu Malaysia(1) Tác động hạ đường huyết viên Insutrix giải thích nhờ kết hợp chế bảo vệ tế bào tụy tăng độ nhạy cảm với insulin Nghiên cứu Y học củ Nghệ(2,11) với chế ức chế cytokin viêm (IL-6, TNF-α), giảm tình trạng stress oxy hóa, rối loạn lipid huyết bảo vệ tế bào beta tụy, làm tăng giải phóng insulin hoa Hòe(9) Flavonoid hoa Hòe báo cáo tác dụng bảo vệ tế bào beta tụy, tế bào thận tránh khỏi tổn thương gây streptozotocin hoa Hòe(14) Liều 250 mg/kg thể tác động hạ đường huyết có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh thời điểm khảo sát sớm liều 500 mg/kg 1000 mg/kg giải thích tăng liều, thành phần khơng thể tác động hạ đường huyết lớn ảnh hưởng nhiều đến tác động mong muốn Từ gợi ý việc chọn liều phù hợp để tính tốn liều dự kiến người Kết đề tài cung cấp sở khoa học tính an tồn tác động hạ đường huyết viên nang cứng Insutrix, tiền đề để ứng dụng chế phẩm phòng và/hoặc điều trị đái tháo đường lâm sàng KẾT LUẬN Viên nang cứng Insutrix thể tác động ức chế α-amylase α-glucosidase in vitro với IC50 652,09 µg/ml 927,8 µg/ml so với IC50 acarbose 13,66 µg/ml 429,24 µg/ml Viên Insutrix khơng thể độc tính cấp đường uống với liều Dmax 10 g/kg Chế phẩm thể tác động hạ đường huyết liều 250 mg/kg, 500 mg/kg 1000 mg/kg sau tuần điều trị; tác động nhanh theo thứ tự 250 mg/kg > 500 mg/kg > 1000 mg/kg; liều 250 mg/kg thể tác động hạ đường huyết tương đương glibenclamid mg/kg TÀI LIỆU THAM KHẢO Abdulghani MA et al (2014) “Potential antidiabetic activity of Plantago major leaves extract in Streptozocin-induced diabetic rats” Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences; 5(2): 896-902 Arun N, Nalini N (2002) “Efficacy of turmeric on blood sugar and polyol pathway in diabetic albino rats” Plant Foods Hum Nutr.; 57(1): 41-52 Bộ Y tế (2015) Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu Ban hành theo định số 141/QĐ-K2ĐT ngày 27 tháng 10 năm 2015 Bộ trưởng Bộ Y tế 121 Nghiên cứu Y học Choi SY, Jung SH, Lee HS, Park KW, Yun BS, Lee KW (2008) “Glycation inhibitory activity and the identification of an active compound in P asiatica extract” Phytother Res.; 22: 323–329 Dua Z et al (2006) “α-glucosidase inhibition of natural curcuminoids and curcumin analogs” European journal of medicinal chemistry; 41(2): 213-218 Gupta D, Chandrashekar, Richard L, Yogendra, Gupta N (2012) “In vitro antidiabetic activity of stem bark of Bauhinia purpurea Linn.” Der Pharmacia Lettre; 4(2): 614-619 Mai Thị Cúc, Đỗ Thị Hồng Tươi (2015) “Phân tích sơ thành phần hóa học, khảo sát hoạt tính ức chế α-amylase, αglucosidase in vitro độc tính cấp đường uống trà thảo mộc Karantina” Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh; 19(3): 3237 Ngô Thị Nga, Mai Thị Cúc, Đỗ Thị Hồng Tươi (2017) “Khảo sát tác dụng hạ lipid huyết hạ đường huyết cao cồn 50% từ trà thảo mộc Panas Karantina chuột nhắt” Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh; 21(2): 7-15 Niture NT, Ansari AA, Naik SR (2014) “Anti-hyperglycemic activity of rutin in streptozotocin-induced diabetic rats: an effect mediated through cytokines, antioxidants and lipid biomarkers” Indian J Exp Biol.; 52(7): 720-727 10 Oboh G et al (2015) “Comparative effect of quercetin and rutin on α-amylase, α-glucosidase, and some pro-oxidant-induced lipid peroxidation in rat pancreas” Comparative Clinical Pathology; 24(5): 1103-1110 122 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 11 Onozato ML, Tojo A, Goto A et al (2002) “Oxidative stress and nitric oxide synthase in rat diabetic nephropathy, effect of A-CEI and ARB” Kidney Int.; 61(1): p 186 12 Phạm Thị Diệu Hạnh, Phùng Văn Trung, Nguyễn Ngọc Hạnh, Nguyễn Đông Trúc (2007) “Khảo sát hoạt tính ức chế men alpha glucosidase cao chiết hạt mướp đắng” Tạp chí Khoa học Trường đại học Cần Thơ; 7: 130-137 13 Viện dược liệu (2004) Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam – tập I NXB khoa học kỹ thuật, tr 172-173 14 Wang T, Miao M, Bai M, Li Y, Li M, Li C, Xu Y (2017) “Effect of Sophora japonica total flavonoids on pancreas, kidney tissue morphology of streptozotocin-induced diabetic mice model” Saudi J Biol Sci; 24(3): 741-747 15 World Health Organization (2018) http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs312/fr/, truy cập ngày 6/6/2018 Ngày nhận báo: 25/04/2017 Ngày phản biện nhận xét báo: 20/06/2018 Ngày báo đăng: 20/09/2018 ... cấp sở khoa học tính an tồn tác động hạ đường huyết viên nang cứng Insutrix, tiền đề để ứng dụng chế phẩm phòng và/ hoặc điều trị đái tháo đường lâm sàng KẾT LUẬN Viên nang cứng Insutrix thể tác. .. 434,0 µg/ml Độc tính cấp đường uống viên nang Insutrix Khảo sát chuột với liều tối đa bơm qua kim 10 g/kg Sau cho chuột uống, tất chuột khỏe mạnh, ăn cám viên, uống nước, tiêu tiểu, cử động bình... Keywords: Insutrix capsule, α-amylase, α-glucosidase, acute toxicity, hypoglycemic effect vậy, đề tài thực khảo sát độc tính cấp ĐẶT VẤN ĐỀ đường uống tác động hạ đường huyết Đái tháo đường rối loạn chuột