Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết trên chuột nhắt gây tăng glucose huyết bằng streptozocin và độc tính của monordic ford

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ OANH MÃ SINH VIÊN: 1201449 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE HUYẾT TRÊN CHUỘT NHẮT GÂY TĂNG GLUCOSE HUYẾT BẰNG STREPTOZOCIN VÀ ĐỘC TÍNH CỦA MOMORDIC FORD KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI 2017 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ OANH MÃ SINH VIÊN : 1201449 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE HUYẾT TRÊN CHUỘT NHẮT GÂY TĂNG GLUCOSE HUYẾT BẰNG STREPTOZOCIN VÀ ĐỘC TÍNH CỦA MOMORDIC FORD KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn : TS Đỗ Thị Nguyệt Quế Nơi thực : Bộ môn Dược Lực HÀ NỘI – 2017 LỜI CẢM ƠN Bằng tất chân thành, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám Hiệu nhà trường - trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn Dược lực- trường Đại học Dược Hà Nội, tạo điều kiện tốt suốt trình học tập tham gia nghiên cứu khoa học tiến hành đề tài Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Đào Thị Vui, TS Đỗ Thị Nguyệt Quế tạo điều kiện cho em tham gia đề tài dẫn dắt tận tình suốt trình thực đề tài Em xin trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Thùy Dương, Ths Trần Hồng Linh, Ths Ngô Thanh Hoa, Ths Nguyễn Thu Hằng, người thầy tận tình bảo, hướng dẫn em suốt trình tham gia nghiên cứu khoa học môn thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn DS Đinh Đại Độ, Nguyễn Thị Thủy, Đinh Thị Kiều Giang - kỹ thuật viên môn Dược lực đồng hành giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể môn Dược lý bạn sinh viên K67, anh chị K66 tham gia nghiên cứu khoa học làm đề tài môn hỗ trợ em trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, Ngày 18/05/2017 Sinh viên Nguyễn Thị Oanh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Bệnh đái tháo đường .3 1.1.1 Định nghĩa phân loại đái tháo đường 1.1.2 Cơ chế bệnh sinh đái tháo đường 1.1.3 Điều trị bệnh đái tháo đường 1.2 Một số mơ hình gây đái tháo đường chuột .12 1.3.1.Mơ hình gây đái tháo đường kiểu type 12 1.3.2 Mơ hình gây đái tháo đường kiểu type 16 1.3 Chế phẩm Momordic ford .19 1.2.2 Cát cánh ( Radix Platicody) 19 1.3.1 Bạch linh (Poria ) 19 1.2.3 Bạch thược ( Radix Paeoniae ) .20 1.2.4 Nhân sâm (Radix ginseng ) 20 1.2.5 Hoàng kỳ ( Radix Astragali) 20 1.2.6 Thiên hoa phấn (Radix Trichocinthis) 21 1.2.7 Cam thảo (Radix glycirrhizae) .21 1.2.8 Ngũ vị tử (Fructus schisandrae) 22 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 23 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .23 2.1.2 Chuẩn bị chế phẩm thử 24 2.1.3.Động vật nghiên cứu 24 2.1.4 Hóa chất, thuốc thử 25 2.1.5 Trang thiết bị 25 2.2 Nội dung nghiên cứu 25 2.3 Phương pháp nghiên cứu .26 2.3.1 Phương pháp đánh giá tác dụng hạ glucose huyết chế phẩm Momordic ford chuột nhắt trắng 26 2.3.2 Phương pháp xác định độc tính chế phẩm Momordic fordtrên chuột nhắt trắng 28 2.4.3 Phương pháp xử lý số liệu .31 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 32 3.1 Kết đánh giá tác dụng hạ glucose huyết chế phẩm Momordic ford chuột nhắt trắng .32 3.1.1 Kết gây tăng glucose huyết STZ .32 3.1.2 Tác dụng Momordic fordsau uống chế phẩm ngày đến glucose huyết 33 3.1.3 Tác dụng Momordic ford sau uống chế phẩm 14 ngày glucose huyết 34 3.2 Kết đánh giá độc tính chế phầm Momordic ford chuột nhắt trắng 35 3.2.1 Kết đánh giá độc tính cấp 35 3.2.2 Kết xác định độc tính bán trường diễn 36 3.3 Bàn luận 49 3.3.1 Về tác dụng hạ glucose huyết chuột nhắt gây tăng glucose huyết STZ 49 3.3.2 Về độc tính chế phẩm Momordic fordtrên chuột .52 3.3.2.1 Độc tính cấp 52 3.3.2.2 Độc tính bán trường diễn 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 Kết luận 55 Kiến nghị .56 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADA Hiệp hội đái tháo đường Hoa Kỳ ALT Alanin transaminase AST Arpartat transaminase BMI Body mass index DM Đái tháo đường DPP4 Dipeptidyl peptidase -4 GDM Đái tháo đường thai kỳ GIP Gastric inhibitory peptid GLP1 Glucagon like peptid -1 HDL Lipoprotein tỉ trọng cao HCT Hematocrit HGB Hemoglobin LDL Lipoprotein tỷ trọng thấp MCH Hemoglobin trung bình hồng cầu MCHC Nồng độ hemoglobin trung bình hồng cầu MCV Thể tích trung bình hồng cầu OECD Organization for economic co-operation & development PLT Tiểu cầu RBC Hồng cầu STZ Streptozocin T1DM Đái tháo đường type T2DM Đái tháo đường type SGLT2 Kênh đồng vận chuyển natri/glucose TG Triglycerid WBC Bạch cầu WHO Tổ chức y tế giới DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 2.1 Thành phần chế phẩm 23 Bảng 3.1 Mức độ tăng glucose huyết sau 72 tiêm STZ 32 Bảng 3.2 Tác dụng Momordic ford sau uống chế phẩm ngày glucose huyết 33 Bảng 3.3 Tác dụng Momordic ford sau uống chế phẩm 14 ngày glucose huyết 34 Bảng 3.4 Kết thử độc tính cấp chế phẩm Momordic ford 36 Bảng 3.5 Ảnh hưởng chế phẩm Momordic ford liều lặp lại 90 ngày đến thông số huyết học chuột nhắt 39 Bảng 3.6 Ảnh hưởng chế phẩm Momordic ford liều lặp lại 90 ngày đến thơng số sinh hóa chuột nhắt 41 Bảng 3.7 Ảnh hưởng chế phẩm Momordic ford liều lặp lại 90 ngày đến tỉ lệ khối lượng quan so với khối lượng thể 42 Bảng 3.8 Ảnh hưởng chế phẩm Momordic ford liều lặp lại 90 ngày đến mô bệnh học gan 44 Bảng 3.9 Ảnh hưởng chế phẩm Momordic ford liều lặp lại 90 ngày đến mô bệnh học thận 46 Bảng 3.10 Giá trị protein, WBC sau 14 ngày nuôi hồi phục chuột nhắt trắng 48 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Cơ chế tác dụng nhóm chất ức chế DPP-4 11 Hình 1.2 Cơ chế gây độc tế bào β đảo tụy STZ 15 Hình 2.1 Chế phẩm Momordic ford 23 Hình 2.2 Quy trình thử tác dụng hạ glucose huyết 27 Hình 2.3 Quy trình xác định độc tính bán trường diễn 30 Hình 3.1 Ảnh hưởng chế phẩm Momordic ford đến khối 37 lượng thể chuột đực Hình 3.2 Ảnh hưởng chế phẩm Momordic ford đến khối lượng thể chuột 37 ĐẶT VẤN ĐỀ Đái tháo đường bệnh lý mạn tính đặc trưng tình trạng tăng glucose huyết thiếu hụt insulin và/ giảm nhạy cảm với insulin Sự tăng glucose huyết kéo dài gây tổn thương nghiêm trọng nhiều quan khác nhau, đặc biệt biến chứng thần kinh mạch máu [26] Tỉ lệ bệnh nhân đái tháo đường tăng lên nhanh chóng nước có thu nhập thấp trung bình Theo WHO, số lượng bệnh nhân đái tháo đường tăng từ 108 triệu người năm 1980 lên 422 triệu người vào năm 2014, tỉ lệ bệnh nhân mắc đái tháo đường tuổi từ 18 trở lên tăng từ 4,7% lên 8,5% Đái tháo đường nguyên nhân hàng đầu dẫn đến mù lòa, bệnh thận, đột quỵ, tim mạch phẫu thuật cắt bỏ chi Theo thống kê, năm 2012 có khoảng 1,5 triệu người chết đái tháo đường khoảng 2,2 triệu người tử vong có liên quan đến tăng đường huyết Cũng theo ước tính WHO, đái tháo đường trở thành nguyên nhân tử vong đứng thứ vào năm 2030 [44] Đái tháo đường cần điều trị sớm tốt để kiểm soát đường huyết ngăn ngừa biến chứng, giảm nguy tử vong, việc điều trị dựa chế độ ăn, tập luyện, kiểm soát cân nặng sử dụng thuốc [8] Bên cạnh nhóm thuốc hóa dược sử dụng điều trị đái tháo đường, nước phương đơng có kinh nghiệm lâu dài việc sử dụng thuốc từ dược liệu điều trị Rất nhiều vị thuốc, thuốc chứng minh hiệu điều trị tính an tồn qua hàng nghìn năm sử dụng Nguồn dược liệu phong phú với tri thức sử dụng thuốc vốn quý báu lợi Việt Nam, sách phát triển thuốc từ dược liệu tạo điều kiện cho chế phẩm đơng dược có nguồn gốc thảo dược phát triển Phát triển chế phẩm thuốc từ dược liệu tìm kiếm thuốc ứng dụng thực hành lâm sàng, mà việc thương mại hóa sản phẩm giúp tận dụng nguồn lực, tài nguyên vốn có, đóng góp cho phát triển Dược phẩm phát triển kinh tế nước Chế phẩm Momordic ford kết hợp nhiều vị thuốc sử dụng từ lâu điều trị chứng tháo khát (đái tháo đường theo quan niệm đơng y) số vị thuốc chứng minh tác dụng qua thử nghiệm thực nghiệm Thiên Hoa Phấn, Hoàng Kỳ, Nhân sâm…[25], [46], [49] Tuy nhiên, kết hợp vị thuốc chế phẩm liệu có có tác dụng phối hợp vị thuốc hay không tính an tồn chưa nghiên cứu qua thử nghiệm trước Bởi vậy, tiến hành nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết tính an tồn Momordic ford thực nghiệm nhằm cung cấp liệu ban đầu chế phẩm: Nghiên cứu tiến hành với mục tiêu: Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết chế phẩm Momordic ford chuột nhắt trắng gây tăng glucose huyết streptozocin Đánh giá độc tính cấp độc tính bán trường diễn chế phẩm Momordic ford chuột nhắt trắng Sau 90 ngày dùng liên tục chế phẩm Momordic ford mức liều 1200 mg/kg 3600 mg/kg, cấu trúc hình thái vi thể gan thận chuột lô thực nghiệm nhìn chung giới hạn bình thường Tuy nhiên rải rác vài ống thận mô thận kẽ có xâm nhập viêm gặp lơ nghiên cứu Khơng có khác biệt mơ bệnh học lô thử dùng Momordic ford mức liều 1200 mg/kg 3600 mg/kg so với lô chứng 3.2.2.5 Kết nuôi hồi phục sau 14 ngày Do giá trị bạch cầu tăng lên lô dùng chế phẩm, giá trị protein thay đổi lô chuột nhắt liều cao, cá thể chuột lại lô nuôi tiếp 14 ngày sau ngừng chế phẩm Ngày 14, sau cho chuột cho nhịn ăn 2h, lấy máu làm xét nghiệm huyết học, định lượng protein để xác định khả hồi phục sau dừng chế phẩm Kết trình bày bảng 3.10: Bảng 3.10: Giá trị protein, WBC sau 14 ngày nuôi hồi phục chuột nhắt trắng Giống Liều Protein WBC Chứng 71,38 ± 2,08 7,0 ± 0,55 67,88 ± 2,45 9,88 ± 0,63* 64,65 ± 1,48* 11.18 ± 1,94 72,21 ± 2,09 7,73 ± 1,12 74,28 ± 1,71 8,72± 1,98 72,86 ± 1,78 8,88 ± 0,54 1200mg/kg Cái (n=8) 3600mg/kg (n=8) Chứng 1200mg/kg Đực (n=8) 3600mg/kg (n=8) (Số liệu biểu diễn dạng M± SE, * p< 0,05 so với lô chứng) Nhận xét : Bạch cầu tăng nhẹ lô dùng chế phẩm trở lại bình thường sau 14 ngày ni hồi phục: giống đực mức liều, giống liều 3600mg/kg chuột 48 Protein tăng nhẹ lô chuột nhắt giống mức liều 3600mg/kg cân nặng sau 14 ngày dùng chế phẩm giảm xuống, mức thấp giá trị protein lô chứng 3.3 Bàn luận 3.3.1 Về tác dụng hạ glucose huyết chuột nhắt gây tăng glucose huyết STZ Hậu đáng quan tâm đái tháo đường biến chứng mạch máu Biến cố tim mạch nguyên nhân tử vong đa số bệnh nhân đái tháo đường Quản lý chặt chẽ số mục tiêu bệnh nhân làm giảm nguy tử vong nguyên nhân tim mạch Các bệnh nhân thường cần điều chỉnh lối sống kết hợp với sử dụng thuốc để cải thiện chất lượng sống tăng tuổi thọ Các thuốc đái tháo đường có vai trị quan trọng việc điều chỉnh số cận lâm sàng glucose huyết, HbA1c, số thuốc có khả cải thiện giá trị cholesterol, từ làm giảm nguy xuất biến cố bất lợi lâm sàng Rất nhiều thảo dược sử dụng rộng rãi từ xa xưa điều trị đái tháo đường có nhiều tác dụng nghiên cứu hạ glucose huyết, tăng nhạy cảm với insulin, chống viêm… Sự kết hợp nhiều vị thuốc thuốc mang lại tác dụng kết hợp cuối mang lại nhiều lợi ích phối hợp người bệnh Tuy nhiên, chứng phối hợp nhiều vị thuốc hạn chế Nhóm nghiên cứu tiến hành đánh giá tác dụng hạ glucose huyết thuốc Momordic ford mơ hình chuột nhắt gây tăng glucose huyết STZ, kết nghiên cứu cho thấy chế phẩm có tác dụng hạ glucose huyết rõ ràng  Về mơ hình thiết kế nghiên cứu Sử dụng hóa chất gây đái tháo đường chuột mơ hình phổ biến, sử dụng rộng rãi nay, hóa chất sử dụng nhiều alloxan STZ [39] Chúng tơi lựa chọn mơ hình gây tăng glucose huyết hóa chất để tiết kiệm thời gian chi phí, mơ hình cho hiệu hạ glucose huyết cao Qua nghiên cứu trước thực nước giới cho thấy STZ có ưu điểm alloxan gây tổn thương quan khác gan, thận, tỉ lệ chuột chết Từ đó, chúng tơi lựa chọn mơ hình gây đái tháo đường với hóa 49 chất STZ Tuy nhiên, mức liều sử dụng nghiên cứu 150mg/kg cân nặng, mức liều cao so với mơ hình Rất nhiều nghiên cứu đánh giá tác dụng hạ glucose huyết dược liệu sử dụng mơ hình gây tăng glucose huyết STZ chuột nhắt trắng thực mức liều thấp 50mg/kg, 60mg/kg, 70mg/kg,100mg/kg cân nặng …[25], [32] Như vậy, so sánh mức liều, thấy liều sử dụng mơ hình chúng tơi liều cao, chí mức liều sử dụng gây đái tháo đường type [17] Tuy nhiên mơ hình gây đái tháo đường hóa chất có mức liều dao động lớn, khơng có mức liều chuẩn để gây đái tháo đường type type Trước tiến hành thử nghiệm thức, chúng tơi khảo sát mức liều khác STZ, kết cho thấy liều thấp gây đái tháo đường với tỉ lệ thấp, liều 150mg/kg chuột múc liều phù hợp để tiến hành nghiên cứu Hơn nữa, nhìn vào mức độ tăng glucose huyết đạt được, thấy mức liều thấp khơng đủ hiệu lực để tạo chuột có đái tháo đường đưa vào thử nghiệm Như vậy, mức liều lựa chọn dựa điều kiện thực nghiệm có kết phù hợp để tiến hành thử nghiệm đánh giá tác dụng hạ glucose huyết chế phẩm nghiên cứu Về mơ hình sử dụng hóa chất, nhóm nghiên cứu nhận thấy có số nhược điểm định, nhược điểm lớn việc gây đái tháo đường khơng gần với sinh lý bệnh Sử dụng hóa chất phá hủy phần tụy làm tổn thương phần chức tụy, gây thiếu insulin tương đối, không tạo kháng insulin số đặc trưng khác liên quan đến đái tháo đường type rối loạn chuyển hóa đặc trưng hay béo phì, tượng thường thấy bệnh nhân đái tháo đường type Tuy nhiên, nghiên cứu tiến hành đánh giá tác dụng ban đầu chế phẩm thử, lựa chọn mô hình để rút ngắn thời gian nghiên cứu tiết kiệm chi phí nghiên cứu Kết nghiên cứu coi định hướng để tiến hành nghiên cứu khác sâu Nghiên cứu cho thấy chế phẩm có tác dụng hạ glucose huyết chuột, từ có triển khai mơ hình gây đái tháo đường gần với sinh lý bệnh đái tháo đường type 50 Các mơ hình gây đái tháo đường type khác sử dụng chế độ ăn kết hợp chế độ ăn với sử dụng hóa chất nên sử dụng cho nghiên cứu khác sâu đánh giá hiệu chế phẩm điều trị đái tháo đường type Các mô hình tạo chuột đái tháo đường gần với sinh lý bệnh đái tháo đường type 2, kết thu gần với hiệu thực tế Trong đó, mơ hình sử dụng STZ liều thấp kết hợp với chế độ ăn có thời gian thực ngắn có suy giảm chức tế bào β đảo tụy, mô hình thích hợp với nghiên cứu đánh giá tác dụng thuốc đối tượng đích có đái tháo đường type Trên thực tế, thuốc điều trị đái tháo đường đường uống có vai trị chủ yếu điểu trị đái tháo đường type 2, đồng thời type chiếm đến 90% quần thể bệnh nhân mắc đái tháo đường Do đó, mơ hình thử nghiệm tạo động vật có bệnh lý gần với đái tháo đường type cho kết gần với hiệu quần thể đích hướng đến Trong nghiên cứu, lựa chọn thuốc đối chứng metformin glyclazid Metformin thuốc định đầu tay điều trị cho bệnh nhân đái tháo đường type 2, glyclazid thuốc khuyến cáo lựa chọn sau metformin cho bệnh nhân [1] Metformin glyclazid thuộc nhóm thuốc hạ glucose huyết có chế khác nhau, metformin ức chế sản xuất glucose gan tái hấp thu glucose ruột, glyclazid kích thích tế bào β đảo tụy sản xuất insulin Chế phẩm Momordic ford kết hợp nhiều vị thuốc khác nhau, chế chưa rõ, chọn thuốc đối chiếu mơ hình  Về kết thu Sau giai đoạn gây tăng glucose huyết, lựa chọn chuột có giá trị glucose huyết ≥ 9mmol/l đưa vào nghiên cứu Mặc dù nghiên cứu sử dụng mức liều cao mức tăng glucose huyết lại không cao Chúng chấp nhận ngưỡng glucose cho tăng glucose huyết thấp nghiên cứu khác, nhiên đảm bảo tăng glucose huyết có ý nghĩa đưa vào thí nghiệm đánh giá tác dụng hạ glucose huyết chế phẩm Ngoài ra, kết thu cho thấy mức độ tăng glucose huyết lô thử lô chứng đạt đồng cao 51 Nghiên cứu sử dụng hai thuốc đối chứng có chứng lâm sàng tác dụng hạ glucose huyết khuyến cáo sử dụng rộng rãi Trên thực tế, thuốc sử dụng phổ biến thực hành lâm sàng Việc lựa chọn thuốc đối chứng tốt làm tăng tính tin cậy kết nghiên cứu Chúng cho kết thu hai thuốc đối chứng chế phẩm thử có tác dụng hạ glucose huyết chuột nhắt kết đáng tin cậy Chế phẩm Momordic ford dùng liều 1200mg/kg chuột có tác dụng hạ glucose huyết với giá trị p < 0,01 so với lô chứng bệnh giống hai thời điểm ngày sau dùng chế phẩm 14 ngày sau dùng chế phẩm Tỷ lệ hạ glucose huyết chuột nhắt tăng lên thời điểm 14 ngày so với thời điểm ngày khoảng lần Các thành phần chế phẩm nghiên cứu có hiệu hạ glucose huyết số tác dụng khác thực nghiệm Sự kết hợp thành phần nghiên cứu có hiệu giảm glucose huyết cách rõ ràng Vậy kết hoàn toàn khả quan để thực nghiên cứu tiếp theo, sâu tác dụng chế phẩm giá trị glucose huyết đối tượng có đái tháo đường type 3.3.2 Về độc tính chế phẩm Momordic ford chuột 3.3.2.1 Độc tính cấp Với liều tối đa uống (21,68 gam bột chế phẩm/kg chuột), gấp khoảng 18 lần liều thể tác dụng hạ glucose huyết, tất cá thể chuột thử nghiệm khơng có biểu độc tính Vậy, chúng tơi khơng xác định LD50 chế phẩm nghiên cứu chuột nhắt trắng chủng Swiss Kết hoàn toàn thuận lợi cho việc nghiên cứu chế phẩm 3.3.2.2 Độc tính bán trường diễn Mặc dù chứng minh tác dụng độc tính cấp chế phẩm Tuy nhiên thực tế sử dụng thuốc điều trị đái tháo đường dài ngày Do đó, cần đánh giá độc tính dài để phản ánh đầy đủ ảnh hưởng chế phẩm lên thể chức quan quan trọng gan, thận Thử nghiệm tiến hành đánh giá độc tính bán trường diễn lên đến 90 ngày, tiến hành 52 đánh giá tăng trưởng thể, số cận lâm sàng, quan sát đại thể quan làm vi thể gan, thận, nhằm đánh giá chức gan, thận, chức tạo máu, ảnh hưởng đến chuyển hóa, tăng trưởng thể, đánh giá sơ đại thể quan Từ kết thu được, hy vọng phản ánh phần ảnh hưởng chế phẩm lên quan sử dụng dài ngày Để xác định độc tính bán trường diễn chế phẩm, chúng tơi tiến hành xét nghiệm sinh hóa, huyết học làm tiêu mô bệnh học quan gan, thận thời điểm 90 ngày dùng chế phẩm Các số huyết học phản ánh ảnh hưởng chế phẩm lên quan tạo máu Các số sinh hóa phản ánh chức gan, thận Chuột sau lấy máu mổ để quan sát đại thể quan làm tiêu mẫu gan, thận để xác định tổn thương vi thể Về bất thường xác định phần kết quả, tác giả đưa số ý kiến bàn luận sau :  Về thay đổi bạch cầu (WBC) Sự thay đổi bạch cầu xảy tất lô dùng chế phẩm thời điểm 90 ngày Thể xu hướng rõ ràng, thấy, chế phẩm có khả gây tăng WBC chuột nhắt trắng Tăng bạch cầu xảy mức độ nhẹ, nhiên dấu tình trạng viêm tiến triển, nhiễm trùng tổn thương quan khác Cũng cần lưu ý rằng, giá trị bạch cầu dao động khoảng bình thường, có biên dao động lớn Thay đổi có ý nghĩa mặt thống kê khơng đồng nghĩa với có hậu lâm sàng, đặc biệt thay đổi không lớn kết nghiên cứu Ngoài ra, suốt q trình nghiên cứu, chúng tơi khơng phát thấy có biểu bất thường khác có liên quan Do vậy, có ý nghĩa mặt thống kê, thay đổi chưa phản ánh chế phẩm độc tính chuột phơi nhiễm thời gian 90 ngày  Về thay đổi protein lô chuột nhắt trắng giống Sự thay đổi protein xảy lô chuột nhắt giống cái, mức liều thử (liều 3600mg/kg thể trọng) Như thấy, thay đổi protein khơng phải xu hướng rõ ràng chế phẩm Giá trị protein thay đổi phụ thuộc vào nhiều yếu tố, biến đổi tùy thuộc giai đoạn, thời điểm ngày cá 53 thể Khơng loại trừ có ảnh hưởng yếu tố khác dẫn đến thay đổi Hơn nữa, thay đổi giá trị protein so với lơ chứng có ý nghĩa thống kê chưa đủ để gây hậu lâm sàng Điều củng cố thêm kết mô bệnh học gan, thận (là quan có ảnh hưởng đến protein huyết tương ) lô chuột dùng chế phẩm khơng có bất thường so với lơ chứng Như biết, gan quan chịu trách nhiệm sản xuất, tổng hợp protein cho thể Thận khơng có vai trị tổng hợp protein số bệnh thận có khả làm protein ảnh hưởng đến nồng độ protein huyết tương (hội chứng thận hư, viêm cầu thận cấp) [5], [6] Bên cạnh đó, lưu ý thay đổi xảy mức liều cao gấp lần liều có tác dụng hạ glucose huyết, liều thể tác dụng hạ glucose huyết khơng có khác biệt có ý nghĩa thời điểm 90 ngày dùng lặp lại chế phẩm sau ngưng chế phẩm 14 ngày  Về kết nuôi hồi phục sau 14 ngày Do thay đổi có ý nghĩa mặt thống kê hai thông số WBC protein, thay đổi nhỏ, khơng có ý nghĩa lâm sàng, tiến hành ni cá thể chuột cịn lại tất lô tiếp 14 ngày không dùng chế phẩm, sau tiến hành kiểm tra hồi phục thơng qua thơng số huyết học, sinh hóa, giải phẫu mơ bệnh học tương tự thời điểm 90 ngày Kết thu giá trị WBC phục hồi bình thường sau 14 ngày khơng dùng chế phẩm (trừ lô chuột nhắt giống liều 1200mg/kg), giá trị protein có chiều hướng đảo ngược lơ chuột liều cao, lơ cịn lại khơng có thay đổi có ý nghĩa so với lơ chứng Như vậy, tăng WBC chuột dùng chế phẩm hồi phục, nhiên hồi phục không xảy tất lô không phụ thuộc liều Sự thay đổi protein xu hướng rõ ràng chế phẩm Nếu giá trị protein sau ni hồi phục giảm thấp có vấn đề chức gan Tuy nhiên giá trị dao động khoảng nhỏ, thuộc ngưỡng bình thường khơng có tổn thương thiết lập Do khơng có giá trị khoảng tham chiếu thơng số huyết học sinh hóa tương tự khoảng tham chiếu giá trị bình thường người, kết luận chắn khả gây độc chế phẩm trường hợp 54 Các kết chưa thể chế phẩm có gây độc chuột sử dụng liều lặp lại 90 ngày, cho rằng, để kết luận chắn tính an toàn chế phẩm cần tiếp tục tiến hành nghiên cứu khác dài Như vậy, có khác biệt có ý nghĩa thống kê hai thơng số WBC (ở tất lô) protein (lô chuột nhắt trăng giống liều cao) so với lô chứng, cho chưa thể xu hướng gây độc chế phẩm kết luận chế phẩm gây độc quan tạo máu gan, thận Kết mô bệnh học vi thể không nhận thấy bất thường quan gan, thận, quan sát đại thể quan gan, thận, lách, phổi, tim không cho thấy bất thường Vậy, nói chế phẩm khơng ảnh hưởng đến chức quan dùng liều lặp lại 90 ngày chuột nhắt trắng, kết sử dụng làm tiến hành nghiên cứu Do có thay đổi trên, nghiên cứu sau cần ý theo dõi biểu thơng số có liên quan đối tượng nghiên cứu KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận  Về tác dụng hạ glucose huyết chế phẩm  Về tác dụng Momordic ford nồng độ glucose huyết sau uống chế phẩm ngày: chế phẩm Momordic ford sử dụng liều 1200mg/kg cân nặng theo đường uống chuột nhắt trắng ngày liên tiếp thể tác dụng hạ glucose huyết rõ rệt Tỉ lệ giảm glucose huyết so với lô chứng bệnh giống 32,4%  Về tác dụng Momordic ford nồng độ glucose huyết sau uống chế phẩm 14 ngày: chế phẩm Momordic ford sử dụng liều 1200mg/kg cân nặng theo đường uống chuột nhắt trắng 14 ngày liên tiếp thể tác dụng hạ glucose huyết rõ rệt Tỉ lệ giảm glucose huyết so với lô chứng bệnh giống 63,5% Tỉ lệ tăng gấp khoảng lần so với thời điểm ngày dùng chế phẩm 55  Về độc tính chế phẩm  Độc tính cấp tính: với liều tối đa uống 21,68 gam bột chế phẩm/ kg chuột không thấy xuất biểu độc tính, mức liều cao gấp 18,1 lần liều xuất tác dụng dược lý Không xác định LD50 chuột  Độc tính bán trường diễn: với mức liều thử 1200mg/kg cân nặng 3600mg/kg cân nặng: thông số sinh hóa, huyết học, mơ bệnh học vi thể gan, thận đại thể quan không cho thấy có bất thường lơ dùng chế phẩm thử trừ giá trị bạch cầu tăng nhẹ tất lô thời điểm 90 ngày, giá trị protein tăng nhẹ lô chuột nhắt giống dùng liều cao Sau 14 ngày không dùng chế phẩm, giá trị có xu hướng thay đổi, giá trị bạch cầu trở bình thường ngoại trừ lơ sử dụng liều 1200mg/kg Giá trị protein lô chuột nhắt giống dùng liều cao giảm xuống thấp lô chứng giống Kiến nghị Từ liệu thực nghiệm q trình nghiên cứu, khẳng định chế phẩm có tác dụng hạ glucose huyết chuột nhắt trắng gây tăng glucose huyết STZ Tuy nhiên, mơ hình gây tăng glucose huyết chưa thật gần với đái tháo đường type không sinh lý, đề xuất thực nghiên cứu mơ hình sử dụng mơ hình gây đái tháo đường type chuột chế độ ăn, kết hợp chế độ ăn với sử dụng hóa chất liều thấp Các mơ hình tạo đề kháng rối loạn tiết insulin, tạo chuột đái tháo đường gần với sinh lý bệnh đái tháo đường type Điều kiện thử nghiệm gần với quần thể đích so với thử nghiệm chúng tơi tiến hành Từ đó, kết hợp kết nghiên cứu từ nhiều mơ hình để xây dựng liệu tiền lâm sàng làm sở cho nghiên cứu lâm sàng người Dựa vào kết thử độc tính chế phẩm, kết chưa đủ mạnh để khẳng định tính an tồn, chúng tơi kiến nghị theo dõi tính an tồn chế phẩm nghiên cứu có thời gian lâu 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ Y Tế (2015), Hướng dẫn chẩn đoán điều trị bệnh nội tiết chuyển hóa,, tr.174-182, Nhà xuất y học Hà Nội Bộ Y Tế (2015), Dự thảo hướng dẫn thử nghiệm phi lâm sàng lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu,tr9-20 Bộ Y Tế (2012), Giải phẫu sinh lý người,tr.294-298, Nhà xuất giáo dục Bộ Y Tế (2007), Dược lý học tập 2, tr.296-304, Nhà xuất Y học Hà Nội Bộ Y tế (2010), "Bệnh học ", Nhà Xuất Bản Y Học pp.trang 209-222 Đào Thị Kim Chi, Bạch Vọng Hải (2005), Hóa Sinh lâm sàng biện giải case lâm sàng,tr.110-130, Bộ Mơn Hóa Sinh, trường Đại học Dược Hà Nội Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, tr.65-887, Nhà Xuất Bản Y Học TIẾNG ANH ADA (American Diabetes Association ((2016),), "Standards of medical care in diabetes -2016," The Journal of Clinical and applied research and education Adeyi A O., Idowu B A., et al (2012), "Rat model of food-induced nonobese-type diabetes mellitus: comparative pathophysiology and histopathology", Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol, 4(1), pp.51-58 10 Arora S., Ojha S K Vohora D (2009), "Characterisation of streptozotocin induced diabetes mellitus in swiss albino mice", Global J Pharmacol, 3(2), pp.81-84 11 Basha B., Samuel S M., et al (2012), "Endothelial dysfunction in diabetes mellitus: possible involvement of Experimental diabetes research, 2012 endoplasmic reticulum stress?", 12 Bryda E C (2013), "The mighty mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research", Missouri medicine, 110(3), pp.207 13 Buchanan T A., Xiang A H Page K A (2012), "Gestational diabetes mellitus: risks and management during and after pregnancy", Nature Reviews Endocrinology, 8(11), pp.639-649 14 Coleman T., Gamble D Taylor K (1973), "Diabetes in mice after Coxsackie B4 virus infection", Br Med J, 3(5870), pp.25-27 15 Cuypers J., Mathieu C Benhalima K (2013), "SGLT2-inhibitors: a novel class for the treatment of type diabetes introduction of SGLT2-inhibitors in clinical practice", Acta Clinica Belgica, 68(4), pp.287-293 16 Damsbo P., Vaag A., et al (1991), "Reduced glycogen synthase activity in skeletal muscle from obese patients with and without type (non-insulindependent) diabetes mellitus", Diabetologia, 34(4), pp.239-245 17 Deeds M., Anderson J., et al (2011), "Single dose streptozotocin-induced diabetes: considerations for study design in islet transplantation models", Laboratory animals, 45(3), pp.131-140 18 Ebeling P., Koistinen H A Koivisto V A (1998), "Insulin‐independent glucose transport regulates insulin sensitivity", FEBS letters, 436(3), pp.301303 19 Federiuk I F., Casey H M., et al (2004), "Induction of type-1 diabetes mellitus in laboratory rats by use of alloxan: route of administration, pitfalls, and insulin treatment", Comparative medicine, 54(3), pp.252-257 20 Filippi C M von Herrath M G (2008), "Viral trigger for type diabetes", Diabetes, 57(11), pp.2863-2871 21 Guo L Y., Hung T M., et al (2008), "Anti-inflammatory effects of schisandrin isolated from the fruit of Schisandra chinensis Baill", European journal of pharmacology, 591(1), pp.293-299 22 Gupta V (2013), "Glucagon-like peptide-1 analogues: an overview", Indian journal of endocrinology and metabolism, 17(3), pp.413 23 Hán- Georg Joost, Hadi Al-Hasani Schurmann A.,(2012), Animal models in diabets research, chapter 10, pp.161-171, Humana press 24 Harvey R A., Clark M., et al., (2012), Lippincott’s illustrated reviews: Pharmacology, pp.315-330, Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins 25 He K., Li X., et al (2011), "Evaluation of antidiabetic potential of selected traditional Chinese medicines in STZ-induced diabetic mice", Journal of ethnopharmacology, 137(3), pp.1135-1142 26 Joseph D., (2008), Pharmacotherapy: A pathophysiologic approach, 9th edition, pp.1850-1914, McGraw-Hill Medical 27 Ko B.-S., Jang J S., et al (2007), "Changes in components, glycyrrhizin and glycyrrhetinic acid, in raw Glycyrrhiza uralensis Fisch, modify insulin sensitizing and insulinotropic actions", Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 71(6), pp.1452-1461 28 Koivisto V A., Pelkonen R Cantell K (1989), "Effect of interferon on glucose tolerance and insulin sensitivity", Diabetes, 38(5), pp.641-647 29 Li T.-H., Hou C.-C., et al (2010), "Anti-hyperglycemic properties of crude extract and triterpenes from Poria cocos", Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2011 30 Li W., Zheng H., et al (2004), "Natural medicines used in the traditional Chinese medical system for therapy of diabetes mellitus", Journal of ethnopharmacology, 92(1), pp.1-21 31 Liu M., Wu K., et al (2010), "Astragalus polysaccharide improves insulin sensitivity in KKAy mice: regulation of PKB/GLUT4 signaling in skeletal muscle", Journal of ethnopharmacology, 127(1), pp.32-37 32 Liu Z., Wang L malonyl‐ginsenosides J., et al extracted (2009), from "Hypoglycemic roots of Panax effects of ginseng on streptozotocin‐induced diabetic mice", Phytotherapy Research, 23(10), pp.1426-1430 33 Melina R (2010), "Why Medical Researchers Use Mice?", Life's Little Mysteries: LiveScience 34 OECD, Test No 408: Repeated Dose 90-Day Oral Toxicity Study in Rodents,OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, (1998), , OECD Publishing,: Paris 35 Park S., Hong S M., et al (2009), "Huang-Lian-Jie-Du-Tang supplemented with Schisandra chinensis Baill and Polygonatum odoratum Druce improved glucose tolerance by potentiating insulinotropic actions in islets in 90% pancreatectomized diabetic rats", Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 73(11), pp.2384-2392 36 Prasad-Reddy L Isaacs D (2015), "A clinical review of GLP-1 receptor agonists: efficacy and safety in diabetes and beyond", Drugs in context, 37 Rohilla A Ali S (2012), "Alloxan induced diabetes: mechanisms and effects", International journal of research in pharmaceutical and biomedical sciences, 3(2), pp.819-823 38 Sato M., Tai T., et al (2002), "Dehydrotrametenolic acid induces preadipocyte differentiation and sensitizes animal models of noninsulindependent diabetes mellitus to insulin", Biological and Pharmaceutical Bulletin, 25(1), pp.81-86 39 Szkudelski T (2001), "The mechanism of alloxan and streptozotocin action in B cells of the rat pancreas", Physiological research, 50(6), pp.537-546 40 Tomás E., LIN Y S., et al (2002), "Hyperglycemia and insulin resistance: possible mechanisms", Annals of the New York Academy of Sciences, 967(1), pp.43-51 41 von Herrath M G., Dockter J Oldstone M B (1994), "How virus induces a rapid or slow onset insulin-dependent diabetes mellitus in a transgenic model", Immunity, 1(3), pp.231-242 42 Wang N., Zhang D., et al (2009), "Astragalus polysaccharides decreased the expression of PTP1B through relieving ER stress induced activation of ATF6 in a rat model of type diabetes", Molecular and cellular endocrinology, 307(1), pp.89-98 43 Whalen K., Miller S Onge E S (2015), "The role of sodium-glucose cotransporter inhibitors in the treatment of type diabetes", Clinical therapeutics, 37(6), pp.1150-1166 44 WHO, media centre, http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs312/en/10/05/2017 45 Wikipedia Incretin , https://en.wikipedia.org/wiki/Incretin#/media/File:Incretins_and_DPP_4_inh ibitors.svg/18/04/2017 46 Xie W Du L (2011), "Diabetes is an inflammatory disease: evidence from traditional Chinese medicines", Diabetes, Obesity and Metabolism, 13(4), pp.289-301 47 Yang X.-L., Liu D., et al (2013), "Study on in vitro anti-inflammatory activity of total flavonoids from Glycyrrhizae Radix et Rhizoma and its ingredients", Zhongguo Zhong yao za zhi= Zhongguo zhongyao zazhi= China journal of Chinese materia medica, 38(1), pp.99-104 48 Yawata N., Nakamura S., et al (1999), "High incidence of glucose intolerance in Vogt–Koyanagi–Harada disease", British journal of ophthalmology, 83(1), pp.39-42 49 Yin J., Zhang H Ye J (2008), "Traditional Chinese medicine in treatment of metabolic syndrome", Endocrine, Metabolic & Immune Disorders-Drug Targets (Formerly Current Drug Targets-Immune, Endocrine & Metabolic Disorders), 8(2), pp.99-111 50 YKI-JÄRVINEN H., SAMMALKORPI K., et al (1989), "Severity, duration, and mechanisms of insulin resistance during acute infections", The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 69(2), pp.317-323 51 Zhang Z., Li X., et al (2008), "Ginsenoside Re reduces insulin resistance through inhibition of c-Jun NH2-terminal kinase and nuclear factor-κB", Molecular endocrinology, 22(1), pp.186-195 ... NGUYỄN THỊ OANH MÃ SINH VIÊN : 1201449 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE HUYẾT TRÊN CHUỘT NHẮT GÂY TĂNG GLUCOSE HUYẾT BẰNG STREPTOZOCIN VÀ ĐỘC TÍNH CỦA MOMORDIC FORD KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người... chế phẩm: Nghiên cứu tiến hành với mục tiêu: Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết chế phẩm Momordic ford chuột nhắt trắng gây tăng glucose huyết streptozocin Đánh giá độc tính cấp độc tính bán trường... glucose huyết chế phẩm Momordic fordtrên chuột nhắt trắng: + Đánh giá kết gây tăng glucose huyết STZ + Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết sau ngày dùng chế phẩm + Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết