Nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm và độc tính của tinh dầu trong cây chúc (citrus hystrix dc , rutaceae) ở tịnh biên, tỉnh an giang

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ TRẦN CÔNG VINH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM VÀ ĐỘC TÍNH CỦA TINH DẦU TRONG CÂY CHÚC (CITRUS HYSTRIX DC., RUTACEAE) Ở TỊNH BIÊN, AN GIANG Chuyên ngành: Dược lý – Dược lâm sàng Mã số: 62.72.04.05.CK LUẬN ÁN CHUYÊN KHOA CẤP II Người hướng dẫn khoa học PGS.TS PHẠM THÀNH SUÔL Cần Thơ - 2018 ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, cho phép tơi bày tỏ lịng biết ơn đến: Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo Sau đại học trường Đại học Y Dược Cần Thơ tạo điều kiện tốt cho tơi học tập hồn thành luận án GS TS Phạm Văn Lình, Chủ tịch Hội đồng trường, giảng dạy, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu nghiên cứu khoa học PGS TS Dương Xuân Chữ, Trưởng Khoa Dược, giảng dạy, truyền đạt kinh nghiệm, hướng dẫn cụ thể vấn đề nghiên cứu dược lý để tơi hồn thành luận án PGS TS Phạm Thành Sl, Phó trưởng Khoa Dược, nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt kinh nghiệm, hướng dẫn đồng hành suốt trình học tập làm luận án Thầy cô Hội đồng bảo vệ luận án cấp Khoa/Trường: PGS.TS Phạm Thị Tâm, PGS.TS Nguyễn Thị Ngọc Vân, TS Phạm Thị Tố Liên, TS Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, TS Phạm Hoàng Lai hướng dẫn, góp ý chân thành, xác đáng để tơi chỉnh sửa, hồn thành luận án cách tốt ThS Nguyễn Ngọc Quỳnh, ThS Lê Thanh Vĩnh Tuyên, Liên Bộ môn Dược liệu – Dược cổ truyền – Thực vật, tạo điều kiện cho tơi thực nghiệm, hướng dẫn, góp ý thiết thực lĩnh vực nghiên cứu dược liệu Tập thể q thầy cơ, ThS Trần Hồng Yến, Liên môn Dược lý – Dược lâm sàng, hướng dẫn, tạo điều kiện cho thực tập, nghiên cứu, đóng góp ý kiến hữu ích để tơi hồn thành luận án Đồng thời tơi xin cảm ơn bạn sinh viên nhóm đề tài nghiên cứu Chúc đồng hành suốt q trình thực luận án TRẦN CƠNG VINH iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Cần Thơ, ngày 30 tháng 10 năm 2018 Trần Công Vinh iv MỤC LỤC Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nghiên cứu Chúc tinh dầu Chúc 1.1.1 Tổng quan Chúc 1.1.2 Tổng quan tinh dầu Chúc 1.2 Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm tinh dầu vỏ 1.2.1 Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn 1.2.2 Nghiên cứu tác dụng kháng nấm .10 1.3 Nghiên cứu độc tính thuốc 13 1.3.1 Một số khái niệm liên quan 13 1.3.2 Thử nghiệm độc tính cấp 13 1.3.3 Thử nghiệm độc tính bán trường diễn 17 1.3.4 Thử nghiệm độc tính chỗ .19 1.4 Nghiên cứu tinh dầu Chúc Việt Nam giới 20 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG P HÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.2 Phương pháp nghiên cứu .27 2.2.1 Xác định thành phần hóa học tinh dầu vỏ 27 v 2.2.2 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm tinh dầu vỏ Chúc môi trường nuôi cấy .32 2.2.3 Đánh giá độc tính cấp, bán trường diễn gây kích ứng da tinh dầu vỏ Chúc động vật .39 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 46 3.1 Thành phần hóa học tinh dầu phân lập từ vỏ Chúc 46 3.2 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm tinh dầu vỏ Chúc môi trường nuôi cấy 51 3.3 Độc tính cấp, bán trường diễn gây kích ứng da tinh dầu vỏ Chúc in vivo 53 3.3.1 Độc tính cấp .53 3.3.2 Độc tính bán trường diễn 54 3.3.3 Độc tính kích ứng da 66 Chương BÀN LUẬN 69 4.1 Thành phần hóa học tinh dầu vỏ Chúc 69 4.2 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm tinh dầu vỏ Chúc môi trường nuôi cấy 70 4.3 Độc tính cấp, độc tính bán trường diễn kích ứng da tinh dầu vỏ Chúc 72 4.3.1 Độc tính cấp 72 4.3.2 Độc tính bán trường diễn 74 4.3.3 Độc tính kích ứng da (độc tính chỗ) 87 KẾT LUẬN 90 KIẾN NGHỊ 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt ALD Absolute lethal dose Liều chết tuyệt đối CFU Colony forming unit Đơn vị tạo khuẩn lạc DMF Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid ĐVTN Động vật thí nghiệm FID Flame Ionization Detector Đầu dị ion hóa lửa GC Gas Chromatography Sắc ký khí LD10 lethal dose 100% Liều làm chết 100% LD50 lethal dose 50% Liều làm chết 50% MHA Thạch Mueller Hinton MLD Mueller Hinton agar Minimum Inhibitory Concentration Mean lethal dose MS Mass spectrometry Khối phổ MTD PE Maximum tolerated dose Liều dung nạp tối đa Organization for Economic Tổ chức Hợp tác Phát Co-operation and Development triển kinh tế Polyethen PEG Polyethylenglycol SDA Sabouraud dextrose agar TSA Tryptic soy agar TSB Tryptic soy broth MIC OECD Nồng độ ức chế tối thiểu Liều chết trung bình vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần vỏ Chúc số nước .21 Bảng 2.1 Chương trình nhiệt độ GC-MS 29 Bảng 2.2 Chương trình nhiệt độ GC-FID 31 Bảng 2.3 Cho điểm đánh giá mức độ kích ứng thuốc lên da 45 Bảng 3.1 Thời gian lưu hỗn hợp alkan chuẩn C8 -C20 46 Bảng 3.2 Thành phần hóa học sơ chất tinh dầu vỏ 47 Bảng 3.3 Định tính khả kháng khuẩn in vitro 51 Bảng 3.4 Giá trị MIC tinh dầu vỏ Chúc với vi khuẩn (%) .51 Bảng 3.5 Kết định tính khả kháng nấm 52 Bảng 3.6 Giá trị MIC tinh dầu vỏ Chúc với vi nấm (%) 53 Bảng 3.7 Kết khảo sát độc tính cấp tinh dầu vỏ Chúc .53 Bảng 3.8 Sự thay đổi trọng lượng lô chuột sau 28 ngày 55 Bảng 3.9 Sự thay đổi trọng lượng lô chuột sau 60 ngày 56 Bảng 3.10 Số lượng hồng cầu lô sau 30 60 ngày .57 Bảng 3.11 Nồng độ Hemoglobin lô sau 30 60 ngày 57 Bảng 3.12 Nồng độ Hematocrit lô sau 30 60 ngày .58 Bảng 3.13 Số lượng bạch cầu lô sau 30 60 ngày 59 Bảng 3.14 Các số loại bạch cầu sau 30 60 ngày 60 Bảng 3.15 Tiểu cầu lô sau 30 60 ngày .61 Bảng 3.16 Hoạt độ ALT lô sau 30 60 ngày 62 Bảng 3.17 Hoạt độ AST lô sau 30 60 ngày .63 Bảng 3.18 Creatinin lô sau 30 60 ngày 64 Bảng 3.19 Ure máu lô sau 30 60 ngày .65 Bảng 3.20 Kết độc tính kích ứng da lơ dầu oliu 67 Bảng 3.21 Kết độc tính kích ứng da tinh dầu vỏ 40 mg/ml 67 Bảng 3.22 Kết độc tính kích ứng da tinh dầu vỏ 80 mg/ml 68 Bảng 3.23 Kết độc tính kích ứng da tinh dầu vỏ 120 mg/ml 68 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình Chúc thực tế tài liệu Hình 3.1 Phổ GC-MS thành phần tinh dầu vỏ Chúc .47 Hình 3.2 Sắc ký đồ GC-FID tinh dầu vỏ Chúc thêm chuẩn nội 49 Hình 3.3 Sắc ký đồ GC-FID mẫu hỗn hợp chuẩn thêm chuẩn nội 50 ĐẶT VẤN ĐỀ Ở Việt Nam, sách quốc gia thuốc định hướng chiến lược chăm sóc sức khỏe nhân dân giai đoạn 2000 – 2020 có yêu cầu “phát huy, thừa kế có chọn lọc, đánh giá tính an tồn, hiệu lực thuốc đồng thời đại hoá dạng bào chế từ thuốc cổ truyền để sử dụng rộng rãi cộng đồng” [33] Vì thế, để phát huy thừa kế có chọn lọc thuốc, thuốc cổ truyền, đặc biệt thuốc chứa tinh dầu có tính kháng khuẩn So với kháng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn từ thực vật có tiềm lớn hợp chất thiên nhiên thường an tồn kinh tế sử dụng Mặt khác, cao chiết số tinh dầu từ thực vật chứng minh có hoạt tính chống lại vi khuẩn, vi nấm; gần tác dụng kháng khuẩn chúng quan tâm ứng dụng nhiều sản phẩm thuốc Cây Chúc gọi trấp (chấp, giấp) có tên khoa học Citrus hystrix DC., thuộc họ Cam (Rutaceae), loài mọc hoang trồng nhiều nước giới Ở nước ta, Chúc mọc hoang trồng nhiều nơi, đặc biệt tỉnh An Giang Tuy nhiên, Chúc chưa triển khai trồng trọt hay sử dụng quy mô lớn Cây Chúc từ lâu người dân biết lồi có nhiều cơng dụng: thường dùng để gội đầu [10] Tồn có tinh dầu thơm nên ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực, phận sử dụng nhiều Cây Chúc phần quan trọng ăn Thái Lan, Campuchia, Indonesia, Lào, Malaysia Philippines Theo kết số cơng trình nghiên cứu khoa học, tinh dầu Chúc sử dụng làm chất tạo mùi vị, sử dụng nước hoa chế phẩm thuốc Tinh dầu Chúc ghi nhận có hiệu chống lại 20 mẫu huyết có Salmonella loại vi khuẩn đường ruột khác [51]; tinh dầu vỏ có tác dụng ức chế chống lại tác nhân gây bệnh đường hô hấp [68] Trồng, bảo vệ rừng trồng dược liệu thuộc danh mục lĩnh vực đặc biệt ưu đãi đầu tư nơng nghiệp, nơng thơn Chính phủ [32]; An Giang với diện tích loại trồng năm 707.247 ha, giá trị sản xuất nông nghiệp trồng trọt 31.242 tỷ đồng/năm [14], phù hợp để phát triển mạnh nông nghiệp Để phát huy thừa kế có chọn lọc thuốc, thuốc cổ truyền việc nghiên cứu dạng bào chế thuận tiện sử dụng thực tế cần thiết Việc tiêu chuẩn hoá chất lượng, đánh giá độ ổn định, tính an tồn hiệu điều trị thuốc (vừa giữ tác dụng thuốc vừa đáp ứng yêu cầu chất lượng dạng thuốc) điều không dễ dàng Nhằm nâng cao hiệu điều trị, phục vụ rộng rãi cho nhu cầu phòng chữa bệnh việc nghiên cứu thuốc có tác dụng sinh học yêu cầu cấp thiết, sở khoa học để bảo tồn phát triển vốn quý Y Dược học cổ truyền Việt Nam Từ lý trên, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm độc tính tinh dầu Chúc (Citrus hystrix DC., Rutaceae) Tịnh Biên, tỉnh An Giang”, với mục tiêu nghiên cứu cụ thể sau: Xác định thành phần hóa học tinh dầu phân lập từ vỏ Chúc Đánh giá tác dụng kháng khuẩn kháng nấm tinh dầu vỏ Chúc môi trường nuôi cấy Đánh giá độc tính cấp, bán trường diễn gây kích ứng da tinh dầu vỏ Chúc chuột trắng nhắt thỏ trắng PL2 - PHỤ LỤC THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG NẤM Thử hoạt tính kháng khuẩn Hình PL 2.1 Kết định tính khả kháng khuẩn tinh dầu vỏ Chúc Hình PL 2.2 Giá trị MIC 1% với chủng Streptococcus pneumoniae Hình PL 2.3 Giá trị MIC 1% với chủng Haemophilus influenzae PL2 - Hình PL 2.4 Kết MIC 2% với chủng Staphylococcus aureus Thử hoạt tính kháng nấm Hình PL 2.5 Kết định tính khả kháng nấm 1: Tinh dầu lá; 2: Tinh dầu vỏ quả; 3: Chứng DMSO Hình PL 2.6 Kết MIC 0,5% với chủng vi nấm PL3 - PHỤ LỤC THỬ ĐỘC TÍNH THỬ ĐỘC TÍNH CẤP 1.1 Hình ảnh đại thể gan, thận Hình PL 3.1 Đại thể gan thận với liều 2500 mg/Kg (dùng đường uống) với gan (A) thận (B) Hình PL 3.2 Đại thể gan thận với liều 3000 mg/Kg (dùng đường uống) với gan (A) thận (B) PL3 - Hình PL 3.3 Đại thể gan thận với liều 3500 mg/Kg (dùng đường uống) với gan (A) thận (B) Hình PL 3.4 Đại thể gan thận với liều 4000 mg/Kg (dùng đường uống) với gan (A) thận (B) PL3 - Hình PL 3.5 Đại thể gan thận với liều 4500 mg/Kg (dùng đường uống) với gan (A) thận (B) Hình PL 3.6 Đại thể gan thận với liều 5000 mg/Kg (dùng đường uống) với gan (A) thận (B) PL3 - 1.2 Hình ảnh vi thể gan, thận Hình ảnh vi thể gan Hình PL 3.7 Hình ảnh vi thể gan lơ sau thử độc tính cấp PL3 - Hình ảnh vi thể thận Hình PL 3.8 Hình ảnh vi thể thận lơ sau thử độc tính cấp PL3 - THỬ ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN 2.1 Hình ảnh đại thể Hình ảnh gan Hình PL 3.9 Hình đại thể gan lơ sau 30 ngày thử nghiệm Hình PL 3.10 Hình đại thể gan lơ sau 60 ngày thử nghiệm PL3 - Hình ảnh thận chuột Hình PL 3.11 Hình đại thể thận lơ sau 30 ngày thử nghiệm Hình PL 3.12 Hình đại thể thận lô sau 60 ngày thử nghiệm PL3 - 2.2 Hình ảnh vi thể gan, thận Hình ảnh gan chuột Hình PL 3.13 Hình ảnh vi thể gan lô sau 30 ngày thử nghiệm PL3 - Hình PL 3.14 Hình ảnh vi thể gan lô sau 60 ngày thử nghiệm PL3 - 10 Hình ảnh thận chuột Hình PL 3.15 Hình ảnh vi thể thận lô sau 30 ngày thử nghiệm PL3 - 11 Hình PL 3.16 Hình ảnh vi thể thận lô sau 60 ngày thử nghiệm PL3 - 12 THỬ ĐỘC TÍNH TẠI CHỖ Hình PL 3.17 Kết độc tính kích ứng da lô dầu Oliu với ô a: dầu oliu; ô c: NaCl 0,9%; b & d: chloroform Hình PL 3.18 Kết độc tính kích ứng da lơ tinh dầu 40 mg/ml với ô a: tinh dầu; ô c: NaCl 0,9%; ô b & d: chloroform PL3 - 13 Hình PL 3.19 Kết độc tính kích ứng da lô tinh dầu 80 mg/ml với ô a: tinh dầu; ô c: NaCl 0,9%; ô b & d: chloroform Hình PL 3.20 Kết độc tính kích ứng da lơ tinh dầu 120 mg/ml với ô a: tinh dầu; ô c: NaCl 0,9%; ô b & d: chloroform