Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu thực trạng ngộ độc, đặc điểm, độc tính của nấm độc trắng hình nón (Amanita virosa) tại Bắc Kạn và thử nghiệm thuốc điều trị trên động vật

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là: Mô tả thực trạng ngộ độc nấm độc tại tỉnh Bắc Kạn từ năm 2004 đến năm 2016 và đặc điểm của một số loài nấm độc mọc tại địa phương nơi xảy ra ngộ độc. Xác định độc tính của loài nấm độc trắng hình nón (Amanita virosa) mọc tại tỉnh Bắc Kạn lên một số cơ quan của động vật thực nghiệm. Khảo sát hiệu quả bảo vệ gan của thuốc silibinin và silymarin trên động vật thực nghiệm ngộ độc nấm độc trắng hình nón. Mời các bạn tham khảo!

1  ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là nước nhiệt đới nóng  ẩm có nhiều lồi nấm mọc tự  nhiên, trong đó có cả nấm độc. Người dân nước ta, đặc biệt là ở các tỉnh  miền núi phía Bắc nơi có nhiều nấm mọc, có thói quen thu hái và ăn nấm  mọc tự  nhiên nên vẫn thường xảy ra các vụ  ngộ  độc do ăn nhầm phải  nấm độc. Tại tỉnh Bắc Kạn,   theo báo cáo của Chi cục an tồn vệ  sinh  thực phẩm từ năm 2004 đến năm 2011 đã xảy ra nhiều vụ ngộ độc nấm  độc, trong đó có những vụ cả gia đình tử vong sau ăn nấm.  Từ năm 2012,  ngành y tế địa phương đã triển khai các biện pháp can thiệp truyền thơng  hướng dẫn người dân cách nhận dạng nấm độc và khơng ăn nấm mọc tự  nhiên. Đặc điểm chi tiết các vụ  ngộ  độc nấm độc tại tỉnh Bắc Kạn đã   diễn ra như  thế  nào trước và sau khi triển khai các biện pháp can thiệp  phịng chống ngộ độc nấm độc tại địa phương?  Ở  Bắc Kạn có các lồi   nấm độc nào, trong đó có nấm độc chứa amatoxin gây chết người hay   khơng? Bên cạnh các biện pháp điều trị  giải độc khơng đặc hiệu, thuốc   silibinin bảo vệ  tế  bào gan (dùng đường tiêm hoặc đường uống) có tác  dụng bảo vệ tế bào gan trước tác dụng gây độc của độc tố  amatoxin do  ngộ  độc nấm độc hay khơng trên thực nghiệm, để  từ  đó định hướng sử  dụng thuốc này trên lâm sàng? Đây là các thơng tin khoa học làm cơ sở để  đưa ra các biện pháp phịng chống thích hợp nhằm giảm tỷ lệ mắc và tử  vong do ngộ độc nấm độc sát với thực tế  của địa phương. Từ  đó đề  tài  “Nghiên cứu thực trạng ngộ  độc, đặc điểm, độc tính của nấm độc   trắng hình nón (Amanita virosa) tại Bắc Kạn và thử nghiệm thuốc điều   trị trên động vật” Mục tiêu:   Mơ tả  thực trạng ngộ  độc nấm độc tại tỉnh Bắc Kạn từ  năm   2004 đến năm 2016 và đặc điểm của một số lồi nấm độc mọc   tại địa phương nơi xảy ra ngộ độc Xác định độc tính của lồi nấm độc trắng hình nón ( Amanita virosa)  mọc    tỉnh  Bắc  Kạn  lên  một  số     quan của  động  vật  thực   nghiệm Khảo sát hiệu quả  bảo vệ  gan của thuốc silibinin và silymarin   trên động vật thực nghiệm ngộ độc nấm độc trắng hình nón Tính cấp thiết Ngộ  độc nấm xảy ra   nhiều địa phương trong cả  nước nhưng  tập trung nhiều nhất   các tỉnh miền núi phía bắc. Cùng một lồi nấm   độc nhưng mọc ở các vùng sinh thái khác nhau thì mức độ độc cũng khác  nhau. Bắc Kạn là một tỉnh miền núi phía bắc có điều kiện tự nhiên thuận   lợi cho sự phát triển thực vật trong đó có các lồi nấm độc. Do vậy, số  vụ ngộ độc nấm độc với tỷ lệ tử vong ở địa phương này cũng rất cao.  Đóng góp mới của luận án ­ Xác định thực trạng ngộ  độc nấm tại tỉnh Bắc Kạn trong giai đoạn   2004­ 2016, làm cơ  sở  quan trọng cho việc đánh giá hiệu quả  của các   biện pháp can thiệp được triển khai sau này ­  Nghiên cứu đã thống kê cho thấy ngộ  độc nấm độc chủ  yếu xảy ra   trong thời gian từ tháng 2 đến tháng 8, nhiều nhất là các tháng 3,4 và 6.  Tử vong do ngộ độc nấm chỉ xảy ra vào tháng 3 và 4 là thông tin quan   trọng định hướng cho người dân cũng như  ngành y tế  cần nâng cao   cảnh giác hơn vào các thời điểm trong năm có nấm mọc nhiều và độc   tính cao ­  Nghiên cứu tìm thấy 10 lồi nấm độc phân bố  tại Bắc Kạn. Trong đó  có nấm độc trắng hình nón được tìm thấy tại 6 xã thì 5 xã có xảy ra  ngộ độc nấm có người tử  vong. Đây cũng là lồi nấm gây chết người   duy nhất tại địa phương, cần tập trung nghiên cứu sâu hơn về độc tính   và các biện pháp cấp cứu, điều trị ngộ độc lồi nấm này ­  Xác định được độc tính cấp và sự thay đổi một số chỉ tiêu về hóa sinh,   huyết học, tim mạch và mơ bệnh học ở động vật thực nghiệm ngộ độc   nấm độc trắng hình nón. Những thơng tin này có ý nghĩa thiết thực cho   việc đưa ra các giải pháp kỹ  thuật trong việc cấp cứu và điều trị  ngộ  độc lồi nấm độc này ­  Silibinin và silymarin đều có hiệu quả bảo vệ tế bào gan dưới tác dụng   gây độc của amatoxin trong nấm độc trắng hình nón.  Bố cục luận án: Luận án có 138 trang, trong đó đặt vấn đề 2 trang, tổng quan 36 trang,   đối tượng và phương pháp 22 trang, kết quả 49 trang, bàn luận 26 trang,  kết luận 2 trang, kiến nghị 1 trang Luận án có 106 tài liệu tham khảo (tiếng Việt: 15, tiếng Anh: 91) Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ NẤM ĐỘC 1.1.1. Khái niệm Nấm độc là lồi nấm có chứa độc tố gây ngộ độc cho cơ thể con   người và động vật khi ăn phải. Nấm là loại thực phẩm giàu dinh dưỡng,  chứa nhiều protein, acid amin, vitamin, muối khống và các chất kháng   sinh  thêm vào đó nấm thường có mùi vị  đặc trưng tạo ra sự  hấp dẫn,  thu hút khẩu vị  của nhiều người. Tuy nhiên, khơng phải nấm nào cũng   ngon và bổ, trong số loại thực phẩm rất đa dạng này có nhiều loại nấm  độc 1.1.2. Phân loại nấm độc Phương pháp đơn giản và được  ứng dụng nhiều nhất trong thực   tế để phân biệt các lồi nấm độc là nhận biết hình thái, so sánh nấm độc  và nấm khơng độc.  Gần đây các tác giả đã phân loại nấm độc theo hội chứng ngộ độc   nấm gồm 14 nhóm trong đó có 2 nhóm chưa xác định được độc tố 1.1.3. Tình hình ngộ độc nấm độc trên thế giới và ở Việt Nam Trên thế giới, ngộ độc nấm chiếm 2,1% trong tổng số các ca ngộ  độc. Ngộ  độc nấm là một trong các dạng ngộ  độc xảy ra thường xun  nhất với trên 12.000 ca đã được các Trung tâm chống độc ghi nhận trong   năm 1996 và tính ra có 5 ca/100.000 dân Việt Nam là nước có khí hậu nóng  ẩm, mưa nhiều. Các vụ  ngộ  độc nấm độc vẫn thường xun xảy ra   các tỉnh vùng cao nơi dân trí  thấp, nhiều dân tộc cùng sinh sống và đời sống người dân ở đây cịn khó  khăn như Hà Giang, Bắc Kạn, Cao Bằng, Thanh Hóa, Sơn La, n Bái   Các cơng trình nghiên cứu về  nấm độc   Việt Nam cịn rất ít. Gần đây  tác giả  Hồng Cơng Minh và CS đã nghiên cứu về  nấm độc tại một số  tỉnh của Việt Nam và đã cơng bố thực trạng ngộ độc nấm độc ở các tỉnh   này.  1.2. NẤM ĐỘC TRẮNG HÌNH NĨN VÀ ĐỘC TỐ AMATOXIN 1.2.1. Nấm độc trắng hình nón  Nấm   độc   trắng   hình   nón   trơng     giống   nấm   độc   tán   trắng  (Amanita verna), bình thường theo hình dáng, màu sắc rất khó phân biệt  giữa hai lồi nấm này. Điểm khác biệt là khi nhỏ  dung dịch 5 – 10%   hydrocid kali (KOH) lên mũ nấm trắng hình nón thấy chỗ có nhỏ KOH  sẽ chuyển màu vàng Khi nấm cịn nhỏ, nấm độc trắng hình nón giống với trứng gà của  gà mái trắng và vẫn  ẩn dưới lịng đất. Nắp của nó có hình chng, gần  như nhọn, với một bề mặt trơn trượt và có mùi hơi khó chịu Khi trưởng thành, nó trở nên khơ, với ánh sáng lụa, vẫn trắng nhưng   có thể trở nên sặc sỡ với màu vàng hoặc nâu ở giữa nắp của nó. Các bào   tử của A. virosa có màu trắng, với đường kính từ 8­10 mm. Tỷ lệ chiều dài   / chiều rộng nhỏ hơn 1,25.  Phân bố  nhiều nơi trên thế  giới, đặc biệt thấy nhiều   châu Âu,   châu Mỹ  và Canada. Tại châu Á, lồi nấm này có mọc  ở vùng đơng bắc   Thái Lan và đã có một số  vụ  ngộ  độc gây chết người. Tại Việt Nam,   nấm độc trắng hình nón có thể  tìm thấy   các tỉnh phía Bắc như  Hà   Giang, n Bái, Cao Bằng.   1.2.2. Độc tố Amatoxin Độc tố  amatoxin tìm thấy trong khoảng 35 lồi nấm trong ba chi   (Amanita,   Galerina,     Lepiota)  chứa   amatoxin   Ngộ   độc   nấm   chứa  amatoxin là nguyên nhân phổ  biến gây tử  vong trong số  các bệnh nhân   ngộ  độc nấm. Điều trị  ngộ  độc amatoxin rất khó khăn, phải càng sớm  càng tốt khi có những biểu hiện lâm sàng ban đầu của ngộ độc amatoxin 1.2.2.1. Cấu trúc của amatoxin  Amatoxin   bao   gồm     loại   bao   gồm:  α­amanitin;  β­amanitin,  γ­ amanitin,  ε­amanitin,   amaninamide,   amanullin,   proamanullin,   amanin   và  amanullinic acid. Các ammatoxin đầu tiên được tách chiết vào năm 1941 1.2.2.2. Cơ chế gây ngộc độc  Amatoxin khơng tan trong nước, hấp thu qua đường tiêu hóa vào   máu rồi được chuyển đến gan thơng qua hệ thống tuần hồn. Hoạt động  vận chuyển được thực hiện bằng các protein màng tế bào gan gọi là các   polypeptide anion hữu cơ  vận chuyển (OATP) 1B3 và chất đồng vận   chuyển natri taurocholat (NTCP) làm tập trung độc tố amatoxin vào trong   tế   bào   gan   Sau     vào     tế   bào,   amatoxin   gắn   kết   với   RNA   polymerase phụ  thuộc DNA và làm ngưng trệ  sự  tổng hợp protein nội   bào, dẫn đến kết quả là sự chết tế bào do apoptosis. Amatoxin là ngun   nhân gây ra tình trạng hủy hoại tế bào gan trước tiên sau đó ảnh hưởng   đến thận 1.2.2.3 Độc tính của amatoxin Amatoxin có độc tính cao, trên người liều gây chết cho người lớn   đối   với   amatoxin     0,1g/kg   thể   trọng   Có   thể   chiết     10   –   15mg  amatoxin trong 40 gam nấm tươi. Trên động vât, một số  nghiên cứu cho  thấy độc tính của amatoxin đối với các lồi động vật có khác nhau. LD 50  đối với  amatoxin  trên  chó  là 0,1mg/kg thể  trọng qua  đường  tiêm  tĩnh   mạch. Trên chuột  cống: LD50  là  4mg/kg theo  đường  tiêm màng bụng.  Động vật thường chết   ngày thứ  2 – 7 ngày sau ngộ  độc. LD50  trên  chuột  nhắt trắng là  300 mg/kg thể  trọng theo  đường  tiêm  ổ  bụng và   chuột bị chết ở ngày thứ 2 – 5 sau ngộ độc 1.3. TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG, CHẨN ĐỐN VÀ ĐIỀU TRỊ NGỘ  ĐỘC NẤM CĨ CHỨA AMATOXIN 1.3.1. Triệu  chứng  lâm  sàng    chẩn   đốn  ngộ   độc  nấm có  chứa  amatoxin Biểu hiện lâm sàng có thể được chia làm 3 giai đoạn ­ Giai đoạn 1: Phân có nhầy máu (xuất hiện sau ăn nấm từ  6 – 12   giờ) đau bụng quặn, nơn và đi ngồi nhiều, phân có nhầy, máu. Mất nước   qua đường tiêu hóa nhiều và nặng có thể  dẫn đến suy thận cấp, sốc   giảm thể  tích. Có thể  gặp đái ra máu. Giai đoạn này bụng mềm, enzym   gan (GOT, GPT), bilirubin chưa tăng nhưng có thể các rối loạn điện giải  như giảm kali, giảm natri máu, toan chuyển hóa. Nếu triệu chứng xảy ra   sớm trong vịng 6­12 giờ thường có biểu hiện tổn thương gan nặng  ­ Giai đoạn 2: Trong vịng 24 giờ, các triệu chứng tiêu hóa (đau  bụng, nơn, tiêu chảy) thun giảm rõ rệt. Tuy nhiên các enzym gan và  bilirubin lại tăng nhanh trong vịng 24­36 giờ sau ăn, cao nhất trong vịng  60­72 giờ. Với bệnh nhân nặng có thể  chuyển trực tiếp từ  giai đoạn 1  sang giai đọan 3 ­ Giai đoạn 3: suy gan tối cấp và suy đa tạng (sau ăn 48 giờ­ 96   giờ): điển hình sau ăn 2­4 ngày. Trường hợp nặng gây suy gan khơng hồi   phục, thường kèm theo suy thận.  Một số  tác giả  khác lại chia ngộ  độc nấm độc có amatoxin làm 4  giai đoạn, trong đó các tác giả  có thêm giai đoạn tiềm  ẩn từ  sau khi ăn  nấm đến khi xuất hiện triệu chứng đầu tiên.  1.3.2. Chẩn đốn ngộ độc nấm có chứa amatoxin 1.3.2.1. Chẩn đốn xác định dựa vào ­ Hỏi bệnh: hỏi kỹ bệnh sử.  ­ Triệu chứng lâm sàng của đường tiêu hóa và triệu chứng về gan   xuất hiện muộn ­ Việc chẩn đốn dựa vào xác định mẫu nấm mà bệnh nhân đã ăn  ­ Lấy nước tiều tìm amatoxin: phát hiện amatoxin trong nước tiểu  bằng phương pháp elisa có độ nhạy tốt và được phát hiện trong vịng 36    sau ăn nấm. Hiện nay xét nghiệm này chưa thực hiện được   Việt   Nam ­   Phát     amatoxin:   amatoxin   có   thể     phát       phương pháp phản  ứng chuỗi polymerase, sắc ký lỏng hiệu năng cao,  elisa.  1.3.2.2. Chẩn đốn phân biệt ­ Nhiễm độc thức ăn: Bệnh nhân cũng có biểu hiện triệu chứng của   đường   tiêu   hóa     đau   bụng,   nôn,   tiêu   chảy   Để   xác   định   cần   xét  nghiệm amatoxin trong nước tiểu ­ Các bệnh viêm gan, suy gan cấp do các nguyên nhân khác như viêm gan   nhiễm độc, viêm gan do virus, viêm gan do các nguyên nhân khác  1.3.3. Điều trị ngộ độc nấm có chứa Amatoxin 1.3.3.1. Hạn chế hấp thu độc chất Ngộ độc nấm chứa amatoxin thường xuất hiện triệu chứng muộn sau   ăn nấm nên các biện pháp hạn chế hấp thu khơng có hiệu quả và dễ có biến   chứng.  1.3.3.2.Tăng cường thải độc *Tăng cường thải độc qua đường tiêu hóa  Than hoạt tính sẽ hấp phụ độc tố  amatoxin thải qua mật vào tá tràng   và hỗng tràng. Việc dùng than hoạt đa liều sẽ  giúp làm giảm chu trình gan   ruột của amatoxin. Than hoạt liều 0,5 g/kg (tối đa là 50g), mỗi 4 giờ.  * Tăng đào thải amatoxin qua nước tiểu Một số  nghiên cứu cũng cho thấy, việc làm tăng bài niệu bằng cách  truyền dịch kết hợp với thuốc lợi niệu khơng làm tăng loại bỏ amatoxin một   cách đáng kể.  * Dẫn lưu mật Amatoxin có trong dịch vị  d  dày ­ tá tràng kéo dài cho đến 60 giờ  sau khi ăn phải nấm. Biện pháp hút hỗng tràng liên tục qua đườ ng mũi   đượ c khuyến cáo như  là một kỹ thuật đơn lẻ  hoặc kết hợp với than ho ạt   tính để  loại bỏ  dịch mật và làm gián đoạn tuần hồn gan ruột. Tuy nhiên,  lợi ích thực tế của các thủ thuật này cũng chưa đượ c ghi nhận rõ ràng.  * Lọc tách huyết tương hấp phụ (FPSA) Trong một thử  nghiệm nhỏ trên 20 bệnh nhân bị  suy gan cấp do ngộ  độc Amanita phalloid cho thấy lọc tách huyết tương hấp phụ làm giảm nồng  độ amantin trong nước tiểu từ 42,5 ng/ml xuống cịn 1,2 ng/ ml và khơng cần   phải ghép gan.  * Hệ thống tái tuần hồn hấp phụ phân tử  Trong báo cáo ca lâm sàng của tác giả Shi Y và CS (2002) cũng cho   thấy   có   tiến   triển   hồi   phục   tình   trạng   suy   gan   cấp   sau     bị   ngộ   độc  amatoxin bằng biện pháp MARS  * Thay huyết tương Thực hiện một mình hoặc phối hợp với MARS có tác dụng cải thiện  chức năng gan.   * Thận nhân tạo, lọc hấp phụ Việc loại bỏ  amatoxin bằng các phương pháp thay thế  thận như  chạy  thận nhân tạo và lọc máu hấp phụ khơng có hiệu quả với bệnh nhân có chức   năng thận bình thường và khơng cải thiện tỷ lệ sống 1.3.3.3. Thuốc ức chế hấp thu amatoxin *Silibinin dihemisuccinate Silibinin là một chất chiết xuất từ tinh dầu cây cây huyết long Địa  Trung Hải ở Địa Trung Hải (Silybum marianum). Silibinin ức chế sự h ấp   thu amatoxin bằng polypeptide vận chuyển anion hữu cơ (OATP) 1B3 và  chất đồng vận chuyển natri taurocholate (NTCP) nằm trong màng tế bào   gan. Nó cải thiện sự  sống cịn của tế  bào gan người tiếp xúc với alpha­ amanitin   Tác   động   bên     tế   bào     bao   gồm   kích   thích   RNA   polymerase   type   I,     hiệu   ứng   chống   oxy   hoá,     làm   tăng     tiết   amatoxin vào đường mật  Silibinin   có  hiệu     nh ất     dùng     vịng 24 giờ sau khi ăn. Silibinin có thể đượ c sử dụng rộng rãi ở nhiều  quốc gia và được dùng một liều tiêm tĩnh mạch ban đầu là 5 mg/kg,  sau đó truyền tĩnh mạch liên tục với liều 20 mg/kg/ ngày trong 6 ngày  hoặc cho đến khi bệnh nhân có dấu hiệu hồi phục lâm sàng.  Việc khuyến cáo dùng silibinin dựa trên một nghiên cứu trên 2110  trường hợp cho thấy tỷ lệ tử  vong  ở 624 bệnh nhân nhận silibinin thấp     so   với     người   không   điều   trị     silibinin   (5,6%   so   với   10,66%).  * Penicillin G Trong   mơ   hình   nghiên   cứu    người   và  động   vật     độc   tính   amatoxin cho thấy penicillin G liều cao có thể ức chế sự hấp thu amatoxin   bởi các polypeptide vận chuyển các anion hữu cơ  (OATP) và giúp ngăn   ngừa độc tính của tế bào. Penicillin G là một chất ức chế ít hơn về sự hấp   thu amatoxin của tế bào gan ở người so với silibinin trên thực nghiệm  * Ceftazidime Ngăn chặn sự  hấp thu amatoxin tế  bào gan. Tuy nhiên, số  bệnh   nhân điều trị thấp và việc sử  dụng đồng thời silibinin ở tất cả các bệnh   nhân không cho phép kết luận chắc chắn về hiệu quả.  * Các thuốc silymarin Silymarin là một chất chiết xuất từ cây huyết long Địa Trung Hải  (Silybum   marianum)   có   chứa     số   flavonolignan,   bao   gồm   silibinin   (dạng tự  nhiên của thuốc, silibinin dihemisuccinate). Nồng  độ  silibinin  trong các loại viên khác nhau cũng khác nhau. Tuy nhiên, hầu hết các viên  silymarin chứa khoảng 50% silibinin. Sự  hấp thu qua  đường uống chỉ  khoảng 20 đến 40 % ở người. Khơng có hướng dẫn rõ ràng về liều uống   của silymarin đối với ngộ độc nấm amatoxin. Với nồng độ silibinin 50%   trong hầu hết các chiết xuất silymarin và hấp thu kém tại đường tiêu hóa  do vậy cần phải uống liều khoảng 10 g viên silymarin hàng ngày để đạt  được nồng độ  trong huyết tương  tương  đương với  liều silibinin  tĩnh   mạch (20 mg/kg/ngày).  1.3.3.4. Các thuốc chống oxy hóa ­ N­acetylcystein  (NAC):  Nghiên cứu điều trị  cho 2100 bệnh nhân ngộ  độc nấm amatoxin cho thấy 192 bệnh nhân nhận NAC có tỷ lệ tử vong là   6,8%, thấp hơn đáng kể so với tỷ lệ tử vong trung bình là 11,6% trong số  tất cả các bệnh nhân.   ­ Cimetidine và vitamin C  có tác dụng chống oxy hố và bảo vệ  tế  bào   trong các mơ hình thực nghiệm trên động vật bị  ngộ  độc nấm có chứa  amatoxin.  1.3.3.5. Ghép gan        Trong một nghiên cứu về  điều trị  nhiễm độc nấm amatoxin   2108  bệnh nhân, ghép gan được thực hiện trong khoảng 1,5% các trường hợp.  Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu điều tra tại tỉnh Bắc Kạn - Người ngộ độc nấm độc cịn sống và người thân của người ngộ  độc nấm độc đã chết của tồn bộ 94 người bị ngộ độc nấm tại tỉnh Bắc  Kạn từ  năm 2004 đến năm 2016 theo thống kê của Chi cục an tồn vệ  sinh thực phẩm tỉnh Bắc Kạn - 40 mẫu nấm độc được tìm thấy mọc  ở các địa phương nơi xảy  ra các vụ ngộ độc nấm độc tại 22 xã của 7 huyện thuộc tỉnh Bắc Kạn 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu thực nghiệm ­ 227 chuột nhắt trắng dịng Swiss, khơng phân biệt đực cái, khoẻ  mạnh, cân nặng trung bình 20 ± 2 gam  ­ 184 chuột cống trắng dịng Wistar, khơng phân biệt đực cái, khoẻ  mạnh, cân nặng trung bình 200 ± 20 gam  ­ 167 thỏ trắng New Zealand, khơng phân biệt đực cái, khoẻ mạnh,   cân nặng 2,0 ± 0,2 kg  2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Mẫu nấm độc trắng hình nón (Amanita virosa) Nấm độc trắng hình nón (Amanita virosa) tươi được thu thập vào  mùa xn tại huyện Na Rì, Ba Bể, Chợ Đồn, Bạch Thơng, tỉnh Bắc Kạn  được dùng để nghiên cứu sâu trên thực nghiệm về độc tính của nấm và  thử nghiệm thuốc điều trị nhiễm độc trên động vật 2.2.2. Thuốc điều trị ngộ độc nấm độc trắng hình nón ­ Legalon® SIL (Silibinin dihemisusccinate) 528,5mg Nhà sản xuất: Roltapharm/ Madaus GmbH, 51101 Cologne ­ Legalon (Silymarin) 70mg  Nhà sản xuất: Madaus Gmb, Germany 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Khảo sát thực trạng ngộ độc nấm độc *   Phương   pháp:    Điều   tra     trường   hợp   ngộ   độc   nấm   độc   theo  phương pháp  điều  tra  cắt  ngang,  hồi  cứu  hồ   sơ,  số   liệu,  phỏng  vấn   người ngộ độc nấm độc cịn sống và người thân của người ngộ độc nấm   độc đã chết theo mẫu phiếu thu thập thơng tin tại các gia đình bị ngộ độc   nấm ở các địa phương thuộc tỉnh Bắc Kạn từ năm 2004 đến năm 2016 * Địa điểm nghiên cứu: Các gia đình bị ngộ độc nấm tại tại 22 xã thuộc  7 huyện của tỉnh Bắc Kạn * Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2011 đến 2016 * Các bước tiến hành: ­ Xây dựng phiếu thu thập thơng tin ngộ độc ­ Thu thập danh sách bệnh nhân và địa chỉ  các gia đình bị  ngộ  độc nấm  qua hồ sơ của Chi cục an tồn vệ sinh thực phẩm và Trung tâm y tế  dự  phịng, các bệnh viện thuộc Sở y tế tỉnh Bắc Kạn.  ­ Đến các gia đình có người bị ngộ độc nấm độc theo danh sách và địa chỉ  đã thu thập, phỏng vấn trực tiếp bệnh nhân hoặc người nhà bệnh nhân  theo các nội dung của phiếu thu thập thơng tin ­ Xử lý thống kê ngộ độc theo các chỉ tiêu.  2.3.2. Điều tra các lồi nấm độc mọc tại địa phương xảy ra ngộ độc * Phương pháp: điều tra hồi cứu theo ca bệnh * Địa điểm nghiên cứu: Các thơn bản nơi xảy ra ngộ độc nấm tại 22 xã   thuộc 7 huyện của tỉnh Bắc Kạn. Vị trí tập trung tìm kiếm nấm là các   nơi người dân đã hái nấm về ăn và bị ngộ độc và mở rộng điều tra ra các   khu vực có nấm mọc qua chỉ dẫn của chính quyền và nhân dân trong địa   bàn điều tra * Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2011 đến 2016 * Các bước tiến hành: ­  Xây dựng mẫu phiếu điều tra nấm độc ­  Thu thập danh sách các vụ ngộ độc nấm, thời gian bị ngộ độc, địa chỉ  các gia đình bị  ngộ  độc nấm qua hồ  sơ  của Chi cục an tồn vệ  sinh  thực phẩm tỉnh Bắc Kạn ­  Đến vị trí nấm mọc, nơi gia đình đã hái nấm về ăn để điều tra ­  Điều tra các lồi nấm lớn khác có mọc gần nơi có các lồi nấm độc đã   hái về ăn để nắm bắt các lồi nấm ăn được dễ nhầm với nấm độc 10 ­  Tiến hành điều tra, khảo sát theo mẫu phiếu điều tra, quay phim, chụp   ảnh, thu mẫu nấm ­  Điều tra các lồi nấm tại các xã khơng có các vụ ngộ độc nấm theo chỉ  dẫn của chính quyền, cán bộ trạm y tế và người dân địa phương.     ­  Sau khi thu thập được mẫu nấm, tiến hành phân loại, cân cân nặng,   ngâm dung mơi bảo quản, sấy mẫu nấm, làm dấu  ấn bào tử  (spore  print), tiêu bản ngay trong ngày 2.3.3. Phương pháp xác định lồi nấm độc Lồi nấm được xác định bằng phương pháp so sánh đặc điểm và hình  dạng nấm với mơ tả của Trịnh Tam Kiệt, bao gồm các đặc điểm riêng về  hình thái, bào tử, phản ứng với hố chất khi đối chiếu với mẫu nấm chuẩn Nghiên cứu bào tử  nấm dưới kính hiển vi (soi tươi và nhuộm tiêu   bản bào tử  bằng NH4OH 2,5% và thuốc thử  Melzer) về  cấu trúc, hình   dáng, kích thước, màu sắc,   Đối chiếu với mẫu bào tử chuẩn đặc trưng   của lồi, để phân biệt một số lồi cùng chi và có hình thái giống nhau.  Phản  ứng đặc trưng với hố chất của một số  lồi có hình thái và bào tử  nấm giống nhau:  + Test Weiland để xác định lồi nấm có chứa độc tố amatoxin + Phản  ứng tạo mầu với  KOH: nấm độc trắng hình nón cho màu  vàng khi nhỏ  dung dịch KOH 5% lên mũ hoặc cuống nấm, nấm độc tán  trắng khơng chuyển màu.   2.3.4. Thu thập, bảo quản và tạo dịch nghiền nấm độc Nấm tươi sau thu hái được cân cân nặng, ghi vào nhật ký trước khi  ngâm bảo quản trong lọ chứa cồn 70° đậy kín để chuyển từ Bắc Kạn về  Học  viện  Quân y. Mẫu tiếp tục bảo  quản  trong  cồn 70°   nhiệt độ  phịng liên tục cho đến khi sử dụng 15 Bảng 3.2. Mối tương quan giữa thời gian xuất hiện triệu chứng đầu  tiên và tỷ lệ sống sót của bệnh nhân ngộ độc nấm Thời  Sống  Tử  OR  P gian  sót vong (95%) xuất  hiện  TC  Số  Số  % % đầu  người người 6,5