Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là: Mô tả thực trạng ngộ độc nấm độc tại tỉnh Bắc Kạn từ năm 2004 đến năm 2016 và đặc điểm của một số loài nấm độc mọc tại địa phương nơi xảy ra ngộ độc. Xác định độc tính của loài nấm độc trắng hình nón (Amanita virosa) mọc tại tỉnh Bắc Kạn lên một số cơ quan của động vật thực nghiệm. Khảo sát hiệu quả bảo vệ gan của thuốc silibinin và silymarin trên động vật thực nghiệm ngộ độc nấm độc trắng hình nón. Mời các bạn tham khảo!
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là nước nhiệt đới nóng ẩm có nhiều lồi nấm mọc tự nhiên, trong đó có cả nấm độc. Người dân nước ta, đặc biệt là ở các tỉnh miền núi phía Bắc nơi có nhiều nấm mọc, có thói quen thu hái và ăn nấm mọc tự nhiên nên vẫn thường xảy ra các vụ ngộ độc do ăn nhầm phải nấm độc. Tại tỉnh Bắc Kạn, theo báo cáo của Chi cục an tồn vệ sinh thực phẩm từ năm 2004 đến năm 2011 đã xảy ra nhiều vụ ngộ độc nấm độc, trong đó có những vụ cả gia đình tử vong sau ăn nấm. Từ năm 2012, ngành y tế địa phương đã triển khai các biện pháp can thiệp truyền thơng hướng dẫn người dân cách nhận dạng nấm độc và khơng ăn nấm mọc tự nhiên. Đặc điểm chi tiết các vụ ngộ độc nấm độc tại tỉnh Bắc Kạn đã diễn ra như thế nào trước và sau khi triển khai các biện pháp can thiệp phịng chống ngộ độc nấm độc tại địa phương? Ở Bắc Kạn có các lồi nấm độc nào, trong đó có nấm độc chứa amatoxin gây chết người hay khơng? Bên cạnh các biện pháp điều trị giải độc khơng đặc hiệu, thuốc silibinin bảo vệ tế bào gan (dùng đường tiêm hoặc đường uống) có tác dụng bảo vệ tế bào gan trước tác dụng gây độc của độc tố amatoxin do ngộ độc nấm độc hay khơng trên thực nghiệm, để từ đó định hướng sử dụng thuốc này trên lâm sàng? Đây là các thơng tin khoa học làm cơ sở để đưa ra các biện pháp phịng chống thích hợp nhằm giảm tỷ lệ mắc và tử vong do ngộ độc nấm độc sát với thực tế của địa phương. Từ đó đề tài “Nghiên cứu thực trạng ngộ độc, đặc điểm, độc tính của nấm độc trắng hình nón (Amanita virosa) tại Bắc Kạn và thử nghiệm thuốc điều trị trên động vật” Mục tiêu: Mơ tả thực trạng ngộ độc nấm độc tại tỉnh Bắc Kạn từ năm 2004 đến năm 2016 và đặc điểm của một số lồi nấm độc mọc tại địa phương nơi xảy ra ngộ độc Xác định độc tính của lồi nấm độc trắng hình nón ( Amanita virosa) mọc tỉnh Bắc Kạn lên một số quan của động vật thực nghiệm Khảo sát hiệu quả bảo vệ gan của thuốc silibinin và silymarin trên động vật thực nghiệm ngộ độc nấm độc trắng hình nón Tính cấp thiết Ngộ độc nấm xảy ra nhiều địa phương trong cả nước nhưng tập trung nhiều nhất các tỉnh miền núi phía bắc. Cùng một lồi nấm độc nhưng mọc ở các vùng sinh thái khác nhau thì mức độ độc cũng khác nhau. Bắc Kạn là một tỉnh miền núi phía bắc có điều kiện tự nhiên thuận lợi cho sự phát triển thực vật trong đó có các lồi nấm độc. Do vậy, số vụ ngộ độc nấm độc với tỷ lệ tử vong ở địa phương này cũng rất cao. Đóng góp mới của luận án Xác định thực trạng ngộ độc nấm tại tỉnh Bắc Kạn trong giai đoạn 2004 2016, làm cơ sở quan trọng cho việc đánh giá hiệu quả của các biện pháp can thiệp được triển khai sau này Nghiên cứu đã thống kê cho thấy ngộ độc nấm độc chủ yếu xảy ra trong thời gian từ tháng 2 đến tháng 8, nhiều nhất là các tháng 3,4 và 6. Tử vong do ngộ độc nấm chỉ xảy ra vào tháng 3 và 4 là thông tin quan trọng định hướng cho người dân cũng như ngành y tế cần nâng cao cảnh giác hơn vào các thời điểm trong năm có nấm mọc nhiều và độc tính cao Nghiên cứu tìm thấy 10 lồi nấm độc phân bố tại Bắc Kạn. Trong đó có nấm độc trắng hình nón được tìm thấy tại 6 xã thì 5 xã có xảy ra ngộ độc nấm có người tử vong. Đây cũng là lồi nấm gây chết người duy nhất tại địa phương, cần tập trung nghiên cứu sâu hơn về độc tính và các biện pháp cấp cứu, điều trị ngộ độc lồi nấm này Xác định được độc tính cấp và sự thay đổi một số chỉ tiêu về hóa sinh, huyết học, tim mạch và mơ bệnh học ở động vật thực nghiệm ngộ độc nấm độc trắng hình nón. Những thơng tin này có ý nghĩa thiết thực cho việc đưa ra các giải pháp kỹ thuật trong việc cấp cứu và điều trị ngộ độc lồi nấm độc này Silibinin và silymarin đều có hiệu quả bảo vệ tế bào gan dưới tác dụng gây độc của amatoxin trong nấm độc trắng hình nón. Bố cục luận án: Luận án có 138 trang, trong đó đặt vấn đề 2 trang, tổng quan 36 trang, đối tượng và phương pháp 22 trang, kết quả 49 trang, bàn luận 26 trang, kết luận 2 trang, kiến nghị 1 trang Luận án có 106 tài liệu tham khảo (tiếng Việt: 15, tiếng Anh: 91) Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ NẤM ĐỘC 1.1.1. Khái niệm Nấm độc là lồi nấm có chứa độc tố gây ngộ độc cho cơ thể con người và động vật khi ăn phải. Nấm là loại thực phẩm giàu dinh dưỡng, chứa nhiều protein, acid amin, vitamin, muối khống và các chất kháng sinh thêm vào đó nấm thường có mùi vị đặc trưng tạo ra sự hấp dẫn, thu hút khẩu vị của nhiều người. Tuy nhiên, khơng phải nấm nào cũng ngon và bổ, trong số loại thực phẩm rất đa dạng này có nhiều loại nấm độc 1.1.2. Phân loại nấm độc Phương pháp đơn giản và được ứng dụng nhiều nhất trong thực tế để phân biệt các lồi nấm độc là nhận biết hình thái, so sánh nấm độc và nấm khơng độc. Gần đây các tác giả đã phân loại nấm độc theo hội chứng ngộ độc nấm gồm 14 nhóm trong đó có 2 nhóm chưa xác định được độc tố 1.1.3. Tình hình ngộ độc nấm độc trên thế giới và ở Việt Nam Trên thế giới, ngộ độc nấm chiếm 2,1% trong tổng số các ca ngộ độc. Ngộ độc nấm là một trong các dạng ngộ độc xảy ra thường xun nhất với trên 12.000 ca đã được các Trung tâm chống độc ghi nhận trong năm 1996 và tính ra có 5 ca/100.000 dân Việt Nam là nước có khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều. Các vụ ngộ độc nấm độc vẫn thường xun xảy ra các tỉnh vùng cao nơi dân trí thấp, nhiều dân tộc cùng sinh sống và đời sống người dân ở đây cịn khó khăn như Hà Giang, Bắc Kạn, Cao Bằng, Thanh Hóa, Sơn La, n Bái Các cơng trình nghiên cứu về nấm độc Việt Nam cịn rất ít. Gần đây tác giả Hồng Cơng Minh và CS đã nghiên cứu về nấm độc tại một số tỉnh của Việt Nam và đã cơng bố thực trạng ngộ độc nấm độc ở các tỉnh này. 1.2. NẤM ĐỘC TRẮNG HÌNH NĨN VÀ ĐỘC TỐ AMATOXIN 1.2.1. Nấm độc trắng hình nón Nấm độc trắng hình nón trơng giống nấm độc tán trắng (Amanita verna), bình thường theo hình dáng, màu sắc rất khó phân biệt giữa hai lồi nấm này. Điểm khác biệt là khi nhỏ dung dịch 5 – 10% hydrocid kali (KOH) lên mũ nấm trắng hình nón thấy chỗ có nhỏ KOH sẽ chuyển màu vàng Khi nấm cịn nhỏ, nấm độc trắng hình nón giống với trứng gà của gà mái trắng và vẫn ẩn dưới lịng đất. Nắp của nó có hình chng, gần như nhọn, với một bề mặt trơn trượt và có mùi hơi khó chịu Khi trưởng thành, nó trở nên khơ, với ánh sáng lụa, vẫn trắng nhưng có thể trở nên sặc sỡ với màu vàng hoặc nâu ở giữa nắp của nó. Các bào tử của A. virosa có màu trắng, với đường kính từ 810 mm. Tỷ lệ chiều dài / chiều rộng nhỏ hơn 1,25. Phân bố nhiều nơi trên thế giới, đặc biệt thấy nhiều châu Âu, châu Mỹ và Canada. Tại châu Á, lồi nấm này có mọc ở vùng đơng bắc Thái Lan và đã có một số vụ ngộ độc gây chết người. Tại Việt Nam, nấm độc trắng hình nón có thể tìm thấy các tỉnh phía Bắc như Hà Giang, n Bái, Cao Bằng. 1.2.2. Độc tố Amatoxin Độc tố amatoxin tìm thấy trong khoảng 35 lồi nấm trong ba chi (Amanita, Galerina, Lepiota) chứa amatoxin Ngộ độc nấm chứa amatoxin là nguyên nhân phổ biến gây tử vong trong số các bệnh nhân ngộ độc nấm. Điều trị ngộ độc amatoxin rất khó khăn, phải càng sớm càng tốt khi có những biểu hiện lâm sàng ban đầu của ngộ độc amatoxin 1.2.2.1. Cấu trúc của amatoxin Amatoxin bao gồm loại bao gồm: αamanitin; βamanitin, γ amanitin, εamanitin, amaninamide, amanullin, proamanullin, amanin và amanullinic acid. Các ammatoxin đầu tiên được tách chiết vào năm 1941 1.2.2.2. Cơ chế gây ngộc độc Amatoxin khơng tan trong nước, hấp thu qua đường tiêu hóa vào máu rồi được chuyển đến gan thơng qua hệ thống tuần hồn. Hoạt động vận chuyển được thực hiện bằng các protein màng tế bào gan gọi là các polypeptide anion hữu cơ vận chuyển (OATP) 1B3 và chất đồng vận chuyển natri taurocholat (NTCP) làm tập trung độc tố amatoxin vào trong tế bào gan Sau vào tế bào, amatoxin gắn kết với RNA polymerase phụ thuộc DNA và làm ngưng trệ sự tổng hợp protein nội bào, dẫn đến kết quả là sự chết tế bào do apoptosis. Amatoxin là ngun nhân gây ra tình trạng hủy hoại tế bào gan trước tiên sau đó ảnh hưởng đến thận 1.2.2.3 Độc tính của amatoxin Amatoxin có độc tính cao, trên người liều gây chết cho người lớn đối với amatoxin 0,1g/kg thể trọng Có thể chiết 10 – 15mg amatoxin trong 40 gam nấm tươi. Trên động vât, một số nghiên cứu cho thấy độc tính của amatoxin đối với các lồi động vật có khác nhau. LD 50 đối với amatoxin trên chó là 0,1mg/kg thể trọng qua đường tiêm tĩnh mạch. Trên chuột cống: LD50 là 4mg/kg theo đường tiêm màng bụng. Động vật thường chết ngày thứ 2 – 7 ngày sau ngộ độc. LD50 trên chuột nhắt trắng là 300 mg/kg thể trọng theo đường tiêm ổ bụng và chuột bị chết ở ngày thứ 2 – 5 sau ngộ độc 1.3. TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG, CHẨN ĐỐN VÀ ĐIỀU TRỊ NGỘ ĐỘC NẤM CĨ CHỨA AMATOXIN 1.3.1. Triệu chứng lâm sàng chẩn đốn ngộ độc nấm có chứa amatoxin Biểu hiện lâm sàng có thể được chia làm 3 giai đoạn Giai đoạn 1: Phân có nhầy máu (xuất hiện sau ăn nấm từ 6 – 12 giờ) đau bụng quặn, nơn và đi ngồi nhiều, phân có nhầy, máu. Mất nước qua đường tiêu hóa nhiều và nặng có thể dẫn đến suy thận cấp, sốc giảm thể tích. Có thể gặp đái ra máu. Giai đoạn này bụng mềm, enzym gan (GOT, GPT), bilirubin chưa tăng nhưng có thể các rối loạn điện giải như giảm kali, giảm natri máu, toan chuyển hóa. Nếu triệu chứng xảy ra sớm trong vịng 612 giờ thường có biểu hiện tổn thương gan nặng Giai đoạn 2: Trong vịng 24 giờ, các triệu chứng tiêu hóa (đau bụng, nơn, tiêu chảy) thun giảm rõ rệt. Tuy nhiên các enzym gan và bilirubin lại tăng nhanh trong vịng 2436 giờ sau ăn, cao nhất trong vịng 6072 giờ. Với bệnh nhân nặng có thể chuyển trực tiếp từ giai đoạn 1 sang giai đọan 3 Giai đoạn 3: suy gan tối cấp và suy đa tạng (sau ăn 48 giờ 96 giờ): điển hình sau ăn 24 ngày. Trường hợp nặng gây suy gan khơng hồi phục, thường kèm theo suy thận. Một số tác giả khác lại chia ngộ độc nấm độc có amatoxin làm 4 giai đoạn, trong đó các tác giả có thêm giai đoạn tiềm ẩn từ sau khi ăn nấm đến khi xuất hiện triệu chứng đầu tiên. 1.3.2. Chẩn đốn ngộ độc nấm có chứa amatoxin 1.3.2.1. Chẩn đốn xác định dựa vào Hỏi bệnh: hỏi kỹ bệnh sử. Triệu chứng lâm sàng của đường tiêu hóa và triệu chứng về gan xuất hiện muộn Việc chẩn đốn dựa vào xác định mẫu nấm mà bệnh nhân đã ăn Lấy nước tiều tìm amatoxin: phát hiện amatoxin trong nước tiểu bằng phương pháp elisa có độ nhạy tốt và được phát hiện trong vịng 36 sau ăn nấm. Hiện nay xét nghiệm này chưa thực hiện được Việt Nam Phát amatoxin: amatoxin có thể phát phương pháp phản ứng chuỗi polymerase, sắc ký lỏng hiệu năng cao, elisa. 1.3.2.2. Chẩn đốn phân biệt Nhiễm độc thức ăn: Bệnh nhân cũng có biểu hiện triệu chứng của đường tiêu hóa đau bụng, nôn, tiêu chảy Để xác định cần xét nghiệm amatoxin trong nước tiểu Các bệnh viêm gan, suy gan cấp do các nguyên nhân khác như viêm gan nhiễm độc, viêm gan do virus, viêm gan do các nguyên nhân khác 1.3.3. Điều trị ngộ độc nấm có chứa Amatoxin 1.3.3.1. Hạn chế hấp thu độc chất Ngộ độc nấm chứa amatoxin thường xuất hiện triệu chứng muộn sau ăn nấm nên các biện pháp hạn chế hấp thu khơng có hiệu quả và dễ có biến chứng. 1.3.3.2.Tăng cường thải độc *Tăng cường thải độc qua đường tiêu hóa Than hoạt tính sẽ hấp phụ độc tố amatoxin thải qua mật vào tá tràng và hỗng tràng. Việc dùng than hoạt đa liều sẽ giúp làm giảm chu trình gan ruột của amatoxin. Than hoạt liều 0,5 g/kg (tối đa là 50g), mỗi 4 giờ. * Tăng đào thải amatoxin qua nước tiểu Một số nghiên cứu cũng cho thấy, việc làm tăng bài niệu bằng cách truyền dịch kết hợp với thuốc lợi niệu khơng làm tăng loại bỏ amatoxin một cách đáng kể. * Dẫn lưu mật Amatoxin có trong dịch vị d dày tá tràng kéo dài cho đến 60 giờ sau khi ăn phải nấm. Biện pháp hút hỗng tràng liên tục qua đườ ng mũi đượ c khuyến cáo như là một kỹ thuật đơn lẻ hoặc kết hợp với than ho ạt tính để loại bỏ dịch mật và làm gián đoạn tuần hồn gan ruột. Tuy nhiên, lợi ích thực tế của các thủ thuật này cũng chưa đượ c ghi nhận rõ ràng. * Lọc tách huyết tương hấp phụ (FPSA) Trong một thử nghiệm nhỏ trên 20 bệnh nhân bị suy gan cấp do ngộ độc Amanita phalloid cho thấy lọc tách huyết tương hấp phụ làm giảm nồng độ amantin trong nước tiểu từ 42,5 ng/ml xuống cịn 1,2 ng/ ml và khơng cần phải ghép gan. * Hệ thống tái tuần hồn hấp phụ phân tử Trong báo cáo ca lâm sàng của tác giả Shi Y và CS (2002) cũng cho thấy có tiến triển hồi phục tình trạng suy gan cấp sau bị ngộ độc amatoxin bằng biện pháp MARS * Thay huyết tương Thực hiện một mình hoặc phối hợp với MARS có tác dụng cải thiện chức năng gan. * Thận nhân tạo, lọc hấp phụ Việc loại bỏ amatoxin bằng các phương pháp thay thế thận như chạy thận nhân tạo và lọc máu hấp phụ khơng có hiệu quả với bệnh nhân có chức năng thận bình thường và khơng cải thiện tỷ lệ sống 1.3.3.3. Thuốc ức chế hấp thu amatoxin *Silibinin dihemisuccinate Silibinin là một chất chiết xuất từ tinh dầu cây cây huyết long Địa Trung Hải ở Địa Trung Hải (Silybum marianum). Silibinin ức chế sự h ấp thu amatoxin bằng polypeptide vận chuyển anion hữu cơ (OATP) 1B3 và chất đồng vận chuyển natri taurocholate (NTCP) nằm trong màng tế bào gan. Nó cải thiện sự sống cịn của tế bào gan người tiếp xúc với alpha amanitin Tác động bên tế bào bao gồm kích thích RNA polymerase type I, hiệu ứng chống oxy hoá, làm tăng tiết amatoxin vào đường mật Silibinin có hiệu nh ất dùng vịng 24 giờ sau khi ăn. Silibinin có thể đượ c sử dụng rộng rãi ở nhiều quốc gia và được dùng một liều tiêm tĩnh mạch ban đầu là 5 mg/kg, sau đó truyền tĩnh mạch liên tục với liều 20 mg/kg/ ngày trong 6 ngày hoặc cho đến khi bệnh nhân có dấu hiệu hồi phục lâm sàng. Việc khuyến cáo dùng silibinin dựa trên một nghiên cứu trên 2110 trường hợp cho thấy tỷ lệ tử vong ở 624 bệnh nhân nhận silibinin thấp so với người không điều trị silibinin (5,6% so với 10,66%). * Penicillin G Trong mơ hình nghiên cứu người và động vật độc tính amatoxin cho thấy penicillin G liều cao có thể ức chế sự hấp thu amatoxin bởi các polypeptide vận chuyển các anion hữu cơ (OATP) và giúp ngăn ngừa độc tính của tế bào. Penicillin G là một chất ức chế ít hơn về sự hấp thu amatoxin của tế bào gan ở người so với silibinin trên thực nghiệm * Ceftazidime Ngăn chặn sự hấp thu amatoxin tế bào gan. Tuy nhiên, số bệnh nhân điều trị thấp và việc sử dụng đồng thời silibinin ở tất cả các bệnh nhân không cho phép kết luận chắc chắn về hiệu quả. * Các thuốc silymarin Silymarin là một chất chiết xuất từ cây huyết long Địa Trung Hải (Silybum marianum) có chứa số flavonolignan, bao gồm silibinin (dạng tự nhiên của thuốc, silibinin dihemisuccinate). Nồng độ silibinin trong các loại viên khác nhau cũng khác nhau. Tuy nhiên, hầu hết các viên silymarin chứa khoảng 50% silibinin. Sự hấp thu qua đường uống chỉ khoảng 20 đến 40 % ở người. Khơng có hướng dẫn rõ ràng về liều uống của silymarin đối với ngộ độc nấm amatoxin. Với nồng độ silibinin 50% trong hầu hết các chiết xuất silymarin và hấp thu kém tại đường tiêu hóa do vậy cần phải uống liều khoảng 10 g viên silymarin hàng ngày để đạt được nồng độ trong huyết tương tương đương với liều silibinin tĩnh mạch (20 mg/kg/ngày). 1.3.3.4. Các thuốc chống oxy hóa Nacetylcystein (NAC): Nghiên cứu điều trị cho 2100 bệnh nhân ngộ độc nấm amatoxin cho thấy 192 bệnh nhân nhận NAC có tỷ lệ tử vong là 6,8%, thấp hơn đáng kể so với tỷ lệ tử vong trung bình là 11,6% trong số tất cả các bệnh nhân. Cimetidine và vitamin C có tác dụng chống oxy hố và bảo vệ tế bào trong các mơ hình thực nghiệm trên động vật bị ngộ độc nấm có chứa amatoxin. 1.3.3.5. Ghép gan Trong một nghiên cứu về điều trị nhiễm độc nấm amatoxin 2108 bệnh nhân, ghép gan được thực hiện trong khoảng 1,5% các trường hợp. Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu điều tra tại tỉnh Bắc Kạn - Người ngộ độc nấm độc cịn sống và người thân của người ngộ độc nấm độc đã chết của tồn bộ 94 người bị ngộ độc nấm tại tỉnh Bắc Kạn từ năm 2004 đến năm 2016 theo thống kê của Chi cục an tồn vệ sinh thực phẩm tỉnh Bắc Kạn - 40 mẫu nấm độc được tìm thấy mọc ở các địa phương nơi xảy ra các vụ ngộ độc nấm độc tại 22 xã của 7 huyện thuộc tỉnh Bắc Kạn 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu thực nghiệm 227 chuột nhắt trắng dịng Swiss, khơng phân biệt đực cái, khoẻ mạnh, cân nặng trung bình 20 ± 2 gam 184 chuột cống trắng dịng Wistar, khơng phân biệt đực cái, khoẻ mạnh, cân nặng trung bình 200 ± 20 gam 167 thỏ trắng New Zealand, khơng phân biệt đực cái, khoẻ mạnh, cân nặng 2,0 ± 0,2 kg 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Mẫu nấm độc trắng hình nón (Amanita virosa) Nấm độc trắng hình nón (Amanita virosa) tươi được thu thập vào mùa xn tại huyện Na Rì, Ba Bể, Chợ Đồn, Bạch Thơng, tỉnh Bắc Kạn được dùng để nghiên cứu sâu trên thực nghiệm về độc tính của nấm và thử nghiệm thuốc điều trị nhiễm độc trên động vật 2.2.2. Thuốc điều trị ngộ độc nấm độc trắng hình nón Legalon® SIL (Silibinin dihemisusccinate) 528,5mg Nhà sản xuất: Roltapharm/ Madaus GmbH, 51101 Cologne Legalon (Silymarin) 70mg Nhà sản xuất: Madaus Gmb, Germany 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Khảo sát thực trạng ngộ độc nấm độc * Phương pháp: Điều tra trường hợp ngộ độc nấm độc theo phương pháp điều tra cắt ngang, hồi cứu hồ sơ, số liệu, phỏng vấn người ngộ độc nấm độc cịn sống và người thân của người ngộ độc nấm độc đã chết theo mẫu phiếu thu thập thơng tin tại các gia đình bị ngộ độc nấm ở các địa phương thuộc tỉnh Bắc Kạn từ năm 2004 đến năm 2016 * Địa điểm nghiên cứu: Các gia đình bị ngộ độc nấm tại tại 22 xã thuộc 7 huyện của tỉnh Bắc Kạn * Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2011 đến 2016 * Các bước tiến hành: Xây dựng phiếu thu thập thơng tin ngộ độc Thu thập danh sách bệnh nhân và địa chỉ các gia đình bị ngộ độc nấm qua hồ sơ của Chi cục an tồn vệ sinh thực phẩm và Trung tâm y tế dự phịng, các bệnh viện thuộc Sở y tế tỉnh Bắc Kạn. Đến các gia đình có người bị ngộ độc nấm độc theo danh sách và địa chỉ đã thu thập, phỏng vấn trực tiếp bệnh nhân hoặc người nhà bệnh nhân theo các nội dung của phiếu thu thập thơng tin Xử lý thống kê ngộ độc theo các chỉ tiêu. 2.3.2. Điều tra các lồi nấm độc mọc tại địa phương xảy ra ngộ độc * Phương pháp: điều tra hồi cứu theo ca bệnh * Địa điểm nghiên cứu: Các thơn bản nơi xảy ra ngộ độc nấm tại 22 xã thuộc 7 huyện của tỉnh Bắc Kạn. Vị trí tập trung tìm kiếm nấm là các nơi người dân đã hái nấm về ăn và bị ngộ độc và mở rộng điều tra ra các khu vực có nấm mọc qua chỉ dẫn của chính quyền và nhân dân trong địa bàn điều tra * Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2011 đến 2016 * Các bước tiến hành: Xây dựng mẫu phiếu điều tra nấm độc Thu thập danh sách các vụ ngộ độc nấm, thời gian bị ngộ độc, địa chỉ các gia đình bị ngộ độc nấm qua hồ sơ của Chi cục an tồn vệ sinh thực phẩm tỉnh Bắc Kạn Đến vị trí nấm mọc, nơi gia đình đã hái nấm về ăn để điều tra Điều tra các lồi nấm lớn khác có mọc gần nơi có các lồi nấm độc đã hái về ăn để nắm bắt các lồi nấm ăn được dễ nhầm với nấm độc 10 Tiến hành điều tra, khảo sát theo mẫu phiếu điều tra, quay phim, chụp ảnh, thu mẫu nấm Điều tra các lồi nấm tại các xã khơng có các vụ ngộ độc nấm theo chỉ dẫn của chính quyền, cán bộ trạm y tế và người dân địa phương. Sau khi thu thập được mẫu nấm, tiến hành phân loại, cân cân nặng, ngâm dung mơi bảo quản, sấy mẫu nấm, làm dấu ấn bào tử (spore print), tiêu bản ngay trong ngày 2.3.3. Phương pháp xác định lồi nấm độc Lồi nấm được xác định bằng phương pháp so sánh đặc điểm và hình dạng nấm với mơ tả của Trịnh Tam Kiệt, bao gồm các đặc điểm riêng về hình thái, bào tử, phản ứng với hố chất khi đối chiếu với mẫu nấm chuẩn Nghiên cứu bào tử nấm dưới kính hiển vi (soi tươi và nhuộm tiêu bản bào tử bằng NH4OH 2,5% và thuốc thử Melzer) về cấu trúc, hình dáng, kích thước, màu sắc, Đối chiếu với mẫu bào tử chuẩn đặc trưng của lồi, để phân biệt một số lồi cùng chi và có hình thái giống nhau. Phản ứng đặc trưng với hố chất của một số lồi có hình thái và bào tử nấm giống nhau: + Test Weiland để xác định lồi nấm có chứa độc tố amatoxin + Phản ứng tạo mầu với KOH: nấm độc trắng hình nón cho màu vàng khi nhỏ dung dịch KOH 5% lên mũ hoặc cuống nấm, nấm độc tán trắng khơng chuyển màu. 2.3.4. Thu thập, bảo quản và tạo dịch nghiền nấm độc Nấm tươi sau thu hái được cân cân nặng, ghi vào nhật ký trước khi ngâm bảo quản trong lọ chứa cồn 70° đậy kín để chuyển từ Bắc Kạn về Học viện Quân y. Mẫu tiếp tục bảo quản trong cồn 70° nhiệt độ phịng liên tục cho đến khi sử dụng 15 Bảng 3.2. Mối tương quan giữa thời gian xuất hiện triệu chứng đầu tiên và tỷ lệ sống sót của bệnh nhân ngộ độc nấm Thời Sống Tử OR P gian sót vong (95%) xuất hiện TC Số Số % % đầu người người 6,5