Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn và độc tính cấp, độc tính tại chỗ của tinh dầu vỏ quả chúc (citrus hystrix) trồng ở an giang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ TRẦN ĐỖ THIÊN TRÍ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN VÀ ĐỘC TÍNH CẤP, ĐỘC TÍNH TẠI CHỖ CỦA TINH DẦU VỎ QUẢ CHÚC (Citrus hystrix) TRỒNG Ở AN GIANG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC ThS TRẦN HOÀNG YẾN ThS NGUYỄN HOÀNG YẾN Cần Thơ – 2018 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ths.Ds Trần Hồng Yến hướng dẫn tận tình, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm, giúp đỡ cho em suốt trình thực đề tài Em xin cảm ơn thầy PGS.TS Phạm Thành Suôl tạo điều kiện cho em hoàn thành tốt luận văn Em xin cảm ơn thầy PGS.TS Dương Xn Chữ, Ths.Bs Cao Thị Kim Hồng, thầy Ths.Ds Lê Thanh Vĩnh Tuyên truyền đạt kiến thức kinh nghiệm, giúp đỡ em hoàn thành tốt luận văn Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô liên môn Dược lý-Dược lâm sàng Trường Đại học Y dược Cần Thơ giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi thời gian làm luận văn Em xin gửi lời cảm ơn đến anh Cơng Vinh (lớp CKII) khơng ngại khó khăn dành thời gian để giúp đỡ hỗ trợ em thời gian nghiên cứu Cảm ơn bạn nhóm đề tài Dược lý nhóm đề tài Dược liệu khóa 39 đồng hành, nhiệt tình giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm quý báu cho Cảm ơn gia đình ln dõi theo ủng hộ, tạo điều kiện để thực tốt luận văn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Cần Thơ, ngày 14 tháng năm 2018 Trần Đỗ Thiên Trí i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Chúc 1.1.1.Giới thiệu chung mô tả 1.1.2.Phân bố, thu hái chế biến 1.1.3.Ứng dụng dân gian 1.1.4.Thành phần hóa học 1.1.5.Các nghiên cứu tác dụng dược lý hoạt tính sinh học tinh dầu Chúc 1.2 Tổng quan mơ hình thử tác dụng kháng khuẩn 1.2.1.Các vi khuẩn thường gặp 1.2.2.Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn in vitro 10 1.3 Tổng quan mơ hình thử độc tính cấp 16 1.3.1 Định nghĩa độc tính thuốc 16 1.3.2 Độc tính cấp thuốc 16 1.3.3 Tầm quan trọng việc xác định LD50 17 1.3.4 Mơ hình thử độc tính cấp 19 1.3.5 Quan sát ghi chép kết 21 1.3.6 Cách tính LD50 22 1.4 Tổng quan mơ hình thử độc tính chỗ 22 1.4.1 Mục đích thử nghiệm độc tính chỗ 22 1.4.2 Một số phương pháp nghiên cứu độc tính chỗ 23 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 ii 2.1 Đối tượng, hóa chất, vật liệu, thiết bị nghiên cứu động vật thí nghiệm 24 2.1.1.Đối tượng nghiên cứu 24 2.1.2.Động vật thí nghiệm 24 2.1.3.Hố chất dung mơi 24 2.1.4.Dụng cụ trang thiết bị 25 2.1.5.Vật liệu 25 2.1.6.Địa điểm nghiên cứu 25 2.1.7.Thời gian nghiên cứu 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1.Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu vỏ Chúc 26 2.2.2.Khảo sát độc tính cấp tinh dầu vỏ Chúc 29 2.2.3.Khảo sát độc tính chỗ tinh dầu vỏ Chúc 31 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35 3.1 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu vỏ Chúc 35 3.1.1.Kết định tính khả kháng khuẩn 35 3.1.2.Kết xác định giá trị MIC 36 3.2 Kết khảo sát độc tính cấp tinh dầu vỏ Chúc 37 3.3 Kết khảo sát độc tính chỗ tinh dầu vỏ Chúc 41 Chương BÀN LUẬN 43 4.1 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu vỏ Chúc 43 4.2 Khảo sát độc tính cấp tinh dầu vỏ Chúc 44 4.3 Khảo sát độc tính chỗ tinh dầu vỏ Chúc 47 KẾT LUẬN 49 KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt MIC Tiếng Anh Minimal inhibitory concentration MBC Minimal bactericidal concentration CFU NAD Colony forming unit Nicotinamide adenine dinucleotide Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate 50% Lethal concentration The half maximal inhibitory concentration Median lethal dose Methicillin-susceptible Staphylococcus aureus Methicillin-resistant Staphylococcus aureus Tryptic Soy Broth Tryptic Soy Agar Mueller-Hinton agar Dimethylformamid Polyethylen glycol Dimethyl sulfoxide NADP LC50 IC50 LD50 MSSA MRSA TSB TSA MHA DMF PEG DMSO Tiếng Việt Nồng độ ức chế tối thiểu Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu Đơn vị tạo khuẩn lạc Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử Liều chết 50% Tụ cầu vàng nhạy Methicillin Tụ cầu vàng kháng Methicillin iv DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Cân nặng thỏ nồng độ tinh dầu sử dụng 32 Bảng 2.2 Thang điểm đánh giá mức độ kích ứng da thỏ 34 Bảng 2.3 Đánh giá mức độ kích ứng dựa vào trị số trung bình .34 Bảng 3.1 Định tính khả kháng khuẩn .35 Bảng 3.2 Giá trị MIC chất thử nghiệm .36 Bảng 3.3 Kết khảo sát độc tính cấp tinh dầu vỏ Chúc .37 Bảng 3.4 Kết khảo sát độc tính chỗ tinh dầu vỏ Chúc 42 v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Cây Chúc (Citrus hystrix) Hình 2.1 Mơ tả hình vẽ đĩa giấy có vịng kháng khuẩn 27 Hình 2.2 Cách cấy đĩa thạch 28 Hình 2.3 Mơ hình thử nghiệm độc tính tinh dầu vỏ Chúc da bụng thỏ 33 Hình 3.1 Kết định tính khả kháng khuẩn tinh dầu vỏ Chúc 35 Hình 3.2 Giá trị MIC chủng Streptococcus pneumoniae 36 Hình 3.3 Giá trị MIC chủng Haemophilus influenzae 36 Hình 3.4 Giá trị MIC chủng Staphylococcus aureus .36 Hình 3.5 Đại thể gan (A), thận (B) liều 2500mg/Kg (PO) 38 Hình 3.6 Đại thể gan (A), thận (B) liều 3000mg/Kg (PO) 38 Hình 3.7 Đại thể gan (A), thận (B) liều 3500mg/Kg (PO) 39 Hình 3.8 Đại thể gan (A), thận (B) liều 4000mg/Kg (PO) 39 Hình 3.9 Đại thể gan (A), thận (B) liều 4500mg/Kg (PO) 40 Hình 3.10 Đại thể gan (A), thận (B) liều 5000mg/Kg (PO) 40 Hình 3.11 Kết khảo sát độc tính chỗ dầu oliu tinh dầu vỏ Chúc nồng độ 40mg/mL dầu oliu 41 Hình 3.12 Kết khảo sát độc tính chỗ tinh dầu vỏ Chúc nồng độ 80mg/mL 120mg/mL dầu oliu 42 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam đất nước có truyền thống lâu đời y học cổ truyền Từ xa xưa ông cha ta biết sử dụng loài cỏ tự nhiên để chữa trị bệnh đơn giản Qua thời gian dài khai thác, thăm dò, đúc kết, du nhập giống từ nước ngoài, nguồn gen dược liệu Việt Nam trở nên vô phong phú, đa dạng chủng loại lẫn công dụng trị liệu, đầu tư nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi điều trị Vùng An Giang với diện tích rừng rộng lớn, khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm, đặc biệt có địa hình núi trung bình đồi thấp, điều kiện thổ nhưỡng đa dạng, nguồn nước dồi dào, môi trường thuận lợi cho sinh sôi, phát triển nhiều lồi thực vật, có nhiều thuốc quý, đặc hữu, có giá trị kinh tế cao Hưởng ứng Quyết Định 1976/QĐ-TTG ngày 30/10/2013 Thủ tướng Chính phủ “Quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu đến năm 2020 định hướng đến năm 2030” với mục tiêu phát triển dược liệu thành ngành sản xuất hàng hóa, bên cạnh phải đảm bảo cân khai thác bảo tồn [14], tỉnh An Giang có động thái tích cực nghiên cứu phát triển nguồn tài nguyên dược liệu chỗ Tuy nhiên việc phát triển dược liệu thành sản phẩm hàng hóa có tác dụng trị liệu vấp phải nhiều khó khăn, tác dụng điều trị thực dược liệu dấu chấm hỏi lớn cho người tiêu dùng lẫn bác sĩ điều trị Vì yêu cầu cấp thiết đặt phải chứng minh công dụng thực tế, hết mức độ an toàn dược liệu sử dụng người Do đó, thử tiền lâm sàng bước quan trọng, có vai trị định nghiên cứu phát triển chế phẩm trị liệu Cây Chúc (citrus hystrix) loài thực vật đặc hữu An Giang, tỉnh quan tâm phát triển Dân gian dùng Chúc loại gia vị, dùng để gội đầu, trồng Chúc quanh nhà để đuổi rắn Ở Việt Nam, dược liệu Chỉ thực Chỉ xác thường sử dụng từ Chúc [11] Hiện nay, chưa có đề tài nghiên cứu tinh dầu vỏ Chúc nước công bố Trong đó, tinh dầu vỏ Chúc nghiên cứu giới chứng minh có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm tốt, đặc biệt với dòng vi khuẩn thường gặp viêm nhiễm đường hô hấp [36] Mùi tinh dầu cịn có tác dụng chống muỗi tốt [35], dùng trị liệu mùi hương để giảm stress hỗ trợ điều trị trầm cảm [23], Cây Chúc cho thấy loài đa dụng, có tiềm để phát triển thành nhiều dịng sản phẩm khác nhau, mang lại lợi ích kinh tế to lớn Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành “Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn độc tính cấp, độc tính chỗ tinh dầu vỏ Chúc (Citrus hystrix) trồng An Giang” nhằm làm rõ hoạt tính sinh học độ an toàn tinh dầu vỏ Chúc, giúp cho việc nghiên cứu tinh dầu Chúc ngày rõ ràng đồng thời góp phần nâng cao giá trị sử dụng Chúc khai thác hiệu tiềm kinh tế mà mang lại Đề tài thực với ba mục tiêu cụ thể sau: - Khảo sát tác dụng kháng khuẩn tinh dầu vỏ Chúc - Khảo sát độc tính cấp tinh dầu vỏ Chúc - Khảo sát độc tính chỗ tinh dầu vỏ Chúc 40 A B Hình 3.9 Đại thể gan (A), thận (B) liều 4500mg/Kg (PO) Nhận xét: Sau cho chuột uống tinh dầu với liều 4500mg/Kg mổ quan sát đại thể, nhận thấy khơng có biểu bất thường gan thận A B A Hình 3.10 Đại thể gan (A), thận (B) liều 5000mg/Kg (PO) Nhận xét: Sau cho chuột uống tinh dầu với liều 5000mg/Kg mổ quan sát đại thể, nhận thấy khơng có biểu bất thường gan thận 41 3.3 Kết khảo sát độc tính chỗ tinh dầu vỏ Chúc Bảng 3.4 Kết khảo sát độc tính chỗ tinh dầu (TD) vỏ Chúc  Thỏ số ……1…… cân nặng ……1,7… Kg  Phẩm xanh lam strypan tiêm lúc …12 15 phút…… a b c Dược phẩm Dược phẩm Dược phẩm Dầu oliu Cloroform NaCl 0,9% Độ kích ứng Độ kích ứng Độ kích ứng ……0…… ……7…… ……0…… Nhận xét lúc Nhận xét lúc Nhận xét lúc 14 15 phút 14 15 phút 14 15 phút d Dược phẩm Cloroform Độ kích ứng ……8…… Nhận xét lúc 14 15 phút  Thỏ số ……2…… cân nặng ……1,6…… Kg  Phẩm xanh lam strypan tiêm lúc …12 30 phút…… a b c Dược phẩm Dược phẩm Dược phẩm TD vỏ 40mg/mL Cloroform NaCl 0,9% Độ kích ứng Độ kích ứng Độ kích ứng ……0…… ……7…… ……0…… Nhận xét lúc Nhận xét lúc Nhận xét lúc 14 30 phút 14 30 phút 14 30 phút d Dược phẩm Cloroform Độ kích ứng ……8…… Nhận xét lúc 14 30 phút Hình 3.11 Kết khảo sát độc tính chỗ dầu oliu tinh dầu vỏ Chúc nồng độ 40mg/mL dầu oliu Nhận xét: Dầu oliu tinh dầu vỏ Chúc nồng độ 40mg/mL khơng gây kích ứng 42  Thỏ số ……3…… cân nặng ……1,6…… Kg  Phẩm xanh lam strypan tiêm lúc …12 45 phút…… a b c Dược phẩm Dược phẩm Dược phẩm TD vỏ 80mg/mL Cloroform NaCl 0,9% Độ kích ứng Độ kích ứng Độ kích ứng ……0…… ……8…… ……0…… Nhận xét lúc Nhận xét lúc Nhận xét lúc 14 45 phút 14 45 phút 14 45 phút d Dược phẩm Cloroform Độ kích ứng ……8…… Nhận xét lúc 14 45 phút  Thỏ số ……4…… cân nặng ……1,5…… Kg  Phẩm xanh lam strypan tiêm lúc …13 00 phút…… a b c Dược phẩm Dược phẩm Dược phẩm TD vỏ 120mg/mL Cloroform NaCl 0,9% Độ kích ứng Độ kích ứng Độ kích ứng ……0…… ……7…… ……0…… Nhận xét lúc Nhận xét lúc Nhận xét lúc 15 00 phút 15 00 phút 15 00 phút d Dược phẩm Cloroform Độ kích ứng ……8…… Nhận xét lúc 15 00 phút Hình 3.12 Kết khảo sát độc tính chỗ tinh dầu vỏ Chúc nồng độ 80mg/mL 120mg/mL dầu oliu Nhận xét: tinh dầu vỏ Chúc nồng độ 80mg/mL 120mg/mL khơng gây kích ứng Sau khoảng thời gian giờ, giờ, kết khơng có thay đổi 43 Chương BÀN LUẬN 4.1 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu vỏ Chúc Cây Chúc từ lâu sử dụng rộng rãi trong dân gian để điều trị bệnh thông thường, đặc biệt bệnh đường hô hấp Trên sở đó, với mong muốn tìm hiểu rõ tác dụng kháng khuẩn tinh dầu vỏ Chúc, nhóm nghiên cứu tiến hành định tính khả kháng khuẩn xác định giá trị MIC tinh dầu vỏ Chúc chủng vi khuẩn gây bệnh đường hơ hấp, là: Streptococcus pneumoniae ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Haemophillus influenzae ATCC 33533 Để định tính khả kháng khuẩn tinh dầu vỏ Chúc, sử dụng phương pháp khuếch tán thạch hay cụ thể kỹ thuật khoanh giấy môi trường đặc Kỹ thuật cho phép xác định chất có hoạt tính kháng khuẩn hay khơng dựa vào xuất vịng kháng khuẩn xung quanh khoanh giấy có tẩm chất cần thử hoạt tính Nếu có vịng kháng khuẩn xuất xung quanh khoanh giấy chứng tỏ chất thử có tác dụng kháng khuẩn chủng vi khuẩn thử nghiệm Đối với chất thử tinh dầu vỏ Chúc, nồng độ thử nghiệm lựa chọn 32%, mục đích để làm xuất vịng kháng khuẩn với đường kính đủ lớn, đo đạc dễ dàng Kết định tính khả kháng khuẩn tinh dầu vỏ Chúc cho thấy tinh dầu có khả kháng khuẩn Haemophillus influenzae, Streptococcus pneumoniae Staphylococcus aureus có xuất vịng kháng khuẩn với đường kính 12mm, 11mm 13mm Để xác định giá trị MIC, chúng tơi sử dụng phương pháp pha lỗng thạch Giá trị MIC nồng độ nhỏ chất thử nghiệm ức chế phát triển vi khuẩn Vì giá trị nhỏ tác dụng kháng khuẩn chất thử mạnh Kết nghiên cứu cho thấy giá trị MIC Haemophilus influenzae Streptococcus pneumoniae 1% tương đương 8,707mg/mL, Staphylococcus aureus 2% tương đương 17,414mg/mL Khi so sánh giá trị MIC tinh dầu vỏ Chúc với tinh dầu Chúc khảo sát nghiên cứu tác giả Lê Đào Họa Mi [12] thử nghiệm điều kiện 44 tương tự, kết cho thấy hoạt tính kháng khuẩn loại tinh dầu tương đương Haemophilus influenzae Streptococcus pneumoniae Điều tương đồng với nghiên cứu Vimol Srisukh cộng thực Chúc Thái Lan [36] Tuy nhiên, nghiên cứu V Srisukh, giá trị MIC tinh dầu vỏ Chúc 0,06-8,7mg/mL[36] Sự khác ảnh hưởng điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu riêng biệt nước; ngồi cịn khác trình gieo trồng, chăm sóc,… khiến cho thành phần tinh dầu vỏ Chúc hai nước khơng giống hồn tồn Mặt khác, việc chọn phương pháp thử nghiệm khác nhau, chẳng hạn lựa chọn pha lỗng mơi trường đặc hay môi trường lỏng, lựa chọn dung môi pha mẫu khác nhau,… cho kết khác Về khả ứng dụng tinh dầu vỏ Chúc, việc đưa tinh dầu với nồng độ 12% (tương đương 8,707 – 17,414mg/mL) vào dạng bào chế chấp nhận được, đồng thời nồng độ nhỏ nhiều so với mức giới hạn nồng độ khơng gây kích ứng xác lập nghiên cứu (120mg/mL) Tinh dầu có mùi thơm dễ chịu, nên không gây nhiều phiền tối sử dụng dạng khí dung hay xơng Với nồng độ từ 1-2%, tinh dầu không đắng, nồng mà đem lại cảm giác the mát dễ chịu sử dụng đường uống,… Với tình trạng khí hậu biến đổi phức tạp nay, bệnh đường hô hấp dễ xuất hiện, lây lan, gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng sống khả lao động nhân dân Dựa nhu cầu đó, ta đẩy mạnh bào chế chế phẩm xịt họng hay viên ngậm giúp phòng ngừa hỗ trợ điều trị bệnh đường hô hấp; chế phẩm xơng hay xịt phịng vừa giúp khử mùi, vừa có tác dụng ức chế phát triển vi khuẩn gây hại, phịng ngừa bệnh tật;… dễ gây ý, tin tưởng đón nhận người tiêu dùng 4.2 Khảo sát độc tính cấp tinh dầu vỏ Chúc Tuy Chúc, Chúc sử dụng rộng rãi dân gian từ lâu đời, muốn sử dụng lượng lớn tinh dầu vỏ Chúc để bào chế chế phẩm dùng cho người không vấn đề hiệu mà vấn đề an toàn 45 đáng lưu tâm Do thử nghiệm độc tính cấp lại có vai trò quan trọng, cần phải thực trước đưa sản phẩm thị trường Tinh dầu vỏ Chúc loại tinh dầu khác sử dụng khơng pha lỗng dung mơi thích hợp tinh dầu ngun chất đắng, nồng, gây cảm giác khó chịu uống Chính việc sử dụng dung mơi để pha lỗng đóng vai trị quan trọng cơng tác chuẩn bị mẫu, phải che lấp mùi vị khó chịu phải an tồn cho thể để khơng ảnh hưởng đến việc xác định độc tính tinh dầu Trong thí nghiệm này, chúng tơi chọn đường uống đường đưa thuốc vào thể nên sử dụng dung môi cồn hay chất khác có mùi vị khó chịu có độc tính Việc tạo dạng nhũ tương nước không khả thi hàm lượng tinh dầu cao Do đó, dung mơi hồ tan tinh dầu chọn dầu oliu Có thể thay loại dầu khác dầu bắp [26], dầu gạo,… Dầu oliu vừa hồ tan tinh dầu dễ dàng mà khơng làm thay đổi tính chất lý hố tinh dầu, vừa không độc hại thời gian ngắn thử nghiệm, vừa làm dịu bớt mùi vị đắng, nồng khó chịu, để chuột dễ uống Ngoài ra, dầu oliu chất dinh dưỡng, dễ hấp thu dung mơi thân dầu khác, kích thích tiết dịch mật, làm tăng khả hấp thu tinh dầu Tuy nhiên, thể tích dịch uống thân dầu cần phải cân nhắc lựa chọn cho phù hợp, chất thân dầu thường khó tiêu hóa, gây nên nhiều phản ứng bất lợi, dễ nhầm độc tính Dụng cụ đưa thuốc lựa chọn kim đầu tù Mục đích để đưa thuốc trực tiếp vào dày chuột, tránh chuột cắn vỡ dụng cụ đưa thuốc không chịu uống thuốc gây thất thoát liều dùng Kim bẻ cong theo đường thực quản, đầu mài tù để trình cho uống dễ dàng giảm mức độ ảnh hưởng cho thực quản chuột Theo hướng dẫn Bộ Y tế, thể tích thuốc tối đa dùng cho chuột nhắt đường uống 50mL/Kg = 0,5mL/10g chuột [2] Tuy nhiên sử dụng dịch uống thân dầu có đặc tính khó tiêu hóa, chuột khó hấp thu hết thể tích nói trên, thể tích dị liều ban đầu chọn 0,1mL/10g chuột Trong q trình dị liều, đa số chuột có nhiều biểu đầy chướng bụng, không ăn uống được, 46 thở hổn hển Do nghi ngờ biểu thể tích tinh dầu cho uống lớn so với khả dung nạp chuột, thể tích cho uống giảm xuống cịn 0,07mL/10g chuột Ở thể tích này, nồng độ tinh dầu đậm đặc (714,29mg/mL tương ứng với liều 5000mg/Kg) nên giảm xuống Tiếp tục dị liều với thể tích uống khơng phát biểu bất thường nào, điều chứng tỏ thể tích dùng phù hợp Về mặt phương pháp, dãy liều sử dụng để thử độc tính cấp phải liều khơng làm cho chuột chết kết thúc liều làm chết tất chuột thí nghiệm [7] Tuy nhiên, tham khảo hướng dẫn OECD [30], trường hợp mẫu cho khơng độc liều tối đa khuyến cáo 5000mg/Kg Đồng thời nồng độ tinh dầu 714,29mg/mL (tương ứng với liều 5000mg/Kg thể tích cho uống 0,07mL/10g chuột) đậm đặc, tăng nồng độ thêm khó dung nạp Vì thế, liều dùng 5000mg/Kg chọn làm liều tối ưu uống Việc cho chuột uống lượng tinh dầu nhiều lại có tính chất đắng, nồng tinh dầu vỏ Chúc khó khăn chuột khơng thể tiếp nhận ngay, liên tục đẩy đầu kim khỏi thực quản dù kim lau tinh dầu dính ngoài, đồng thời tinh dầu pha dầu oliu giảm bớt phần mùi vị khó chịu Thời gian ban đầu sau cho chuột uống, chuột có xu hướng hoảng loạn uống nhiều nước, sau trở trạng thái hoạt động bình thường Trong 72 quan sát, chuột ăn uống bình thường, khơng có biểu bất thường liệt, co giật, thở gấp, rụng lông, ghi nhận Sau 72 giờ, chuột mổ quan sát đại thể đại thể gan, thận, không ghi nhận biến đổi hình dạng màu sắc quan Tinh dầu dày ruột chuột hấp thu hết, khơng cịn thấy ứ đọng quai ruột Cho dù thử đến liều tối đa pha cho chuột uống 5000mg/Kg chuột chết, thử nghiệm dừng lại, xác định LD50 Tuy nhiên, khoảng liều 2500-5000mg/Kg x lần/ngày chuột nhắt tương đương với liều 212,5-425mg/Kg người (hệ số quy đổi 0,085 [2]), với người nặng trung bình 50Kg lượng tinh dầu nguyên chất sử dụng lần xấp xỉ 10,625- 47 21,25g/ngày, liều lớn so với liều dùng mà người uống được, nhận thấy việc xác định LD50 trường hợp khơng cần thiết khẳng định tinh dầu vỏ Chúc an toàn cho người mức liều khảo sát 4.3 Khảo sát độc tính chỗ tinh dầu vỏ Chúc Vỏ Chúc ứng dụng nhiều đời sống nhân dân từ xa xưa Tuy vỏ Chúc có mặt loại thuốc uống (chỉ thực, xác) lẫn thuốc xông giải cảm, người ta chưa phát hay ghi nhận việc vỏ gây kích ứng người Tuy nhiên, để chắn độ an toàn tinh dầu trước nghiên cứu, bào chế chế phẩm dùng ngoài, nhóm nghiên cứu định tiến hành thử nghiệm độc tính chỗ tinh dầu vỏ Chúc mơ hình gây kích ứng da thỏ theo dõi xác định mức độ kích ứng chất màu xanh lam trypan Vì chưa có chế phẩm dùng da chứa tinh dầu vỏ Chúc công bố, dãy liều thử chọn 200-600mg/Kg với thể tích cho uống chuột 0,05mL/10g chuột (tương đương nồng độ 40-120mg/mL) Dãy liều xác định khơng thể độc tính bán trường diễn nghiên cứu đối tượng vỏ Chúc An Giang tác giả Trần Hoa Xuân [16] Từ chọn ba nồng độ thử nghiệm 40mg/mL, 80mg/mL 120mg/mL Trong thí nghiệm này, dung dịch NaCl 0,9% chọn làm chất đối chứng âm dung dịch sinh lý, áp suất thẩm thấu gần tương đồng với thể khơng gây kích ứng Bên cạnh đó, chloroform dùng chứng dương với tác động kích ứng mạnh, gây bỏng Mục đích việc để tạo nên vết kích ứng rõ ràng (màu xanh) vùng da bên đối diện với vùng da thử, nhằm có sở để so sánh đánh giá sơ khả kích ứng chất thử tinh dầu Để loại trừ ảnh hưởng dung môi lên kết nghiên cứu, làm thêm mẫu thử có dầu oliu để chứng minh dung mơi khơng gây kích ứng Sau kết thúc nghiên cứu, chỗ đắp tinh dầu vỏ Chúc không quan sát thấy biểu tăng tính thấm thành mạch (khơng thấy vùng đắp chuyển sang màu xanh), hay biểu bất thường vùng da đáp tinh dầu Khi so sánh với 48 bảng so màu Bộ môn Dược lý, Trường Đại học Y dược Cần thơ, chúng tơi xác định điểm kích ứng tinh dầu vỏ Chúc điểm Điều chứng tỏ việc tiếp xúc tinh dầu Chúc với khoảng nồng độ 40-120mg/mL vòng an tồn cho da 49 KẾT LUẬN Từ mơ hình thiết lập ổn định, thông số phù hợp với điều kiện nghiên cứu phịng thí nghiệm Bộ môn Dược lý-Dược lâm sàng Trường Đại học Y dược Cần Thơ Phịng Vi sinh Cơng Nghệ Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh, chúng tơi thu kết sau: Về tác dụng kháng khuẩn: Tinh dầu vỏ Chúc có khả kháng khuẩn S.pneumoniae, H.influenzae S.aureus với giá trị MIC 1-2% Về độc tính cấp: Khi xác định LD50, cho chuột nhắt trắng uống tinh dầu vỏ Chúc đến liều 5000mg/Kg chuột, tương đương liều 425mg/Kg người, chuột khơng chết Về độc tính chỗ: Tinh dầu vỏ Chúc chưa thể độc tính chỗ sử dụng mơ hình gây kích ứng da thỏ với nồng độ tăng dần tương ứng: 40mg/mL, 80mg/mL, 120mg/mL 50 KIẾN NGHỊ - Khảo sát thêm hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu vỏ Chúc vi khuẩn khác, đặc biệt Streptococcus mutans Porphyromonas gingivalis - Mở rộng khoảng liều thử nghiệm độc tính bán trường diễn tinh dầu vỏ Chúc - Nghiên cứu chế phẩm từ tinh dầu vỏ Chúc dạng viên ngậm, thuốc xịt họng; chế phẩm dạng xông, xịt phòng, sáp thơm,… 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bộ Y tế (2012), Vi khuẩn y học, NXB Giáo dục Việt Nam, tr.33-40, 45-56, 338-344 Bộ Y Tế (2015), Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu, số 141/QĐ-K2ĐT ngày 27/10/2015, tr.10-14, 19, 24 Tào Duy Cần, Trần Sỹ Viên (2007), Cây thuốc vị thuốc thuốc Việt Nam, Nhà xuất Hà Nội, Hà Nội, tr.59-60 Võ Văn Chi (2012), Từ điển thuốc Việt Nam (bộ mới), tập 2, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr.1069-1070 Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, Tập 1, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr.690 Nguyễn Thượng Dong cộng (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc từ dược thảo, Viện Dược liệu, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr.231-241 Đỗ Trung Đàm (2014), Phương pháp xác định độc tính thuốc, NXB Y học, Hà Nội, tr.15-17, 23-27, 41, 60, 85-87, 216-222 Đại học Y dược TPHCM, khoa Y, Môn Vi sinh (2016), Vi khuẩn y học, tr.139-140, 197-198 Đại Học Y Dược Cần Thơ, khoa Dược, Bộ môn Dược lý-Dược lâm sàng (2016), Giáo trình thực tập Dược lý, tr.28-30 10 Tạ Lê Mai Hậu cộng (2016), “Thăm dị khả kích ứng da đánh giá tác dụng xua muỗi Aedes aegypti tinh dầu Phong lữ thảo (Pelargonium x hortorum L.H.Bailey)”, Tạp chí Nghiên cứu dược Thông tin thuốc, Trường Đại học dược Hà Nội, 6(7), tr.24 11 Đỗ Tất Lợi (2011), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Thời đại, Hà Nội, tr.363-364 52 12 Lê Đào Họa Mi (2017), Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn độc tính cấp, độc tính da tinh dầu Chúc (Citrus hystrix) từ An Giang, Luận văn Dược sĩ Đại học, Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, Cần Thơ 13 Phạm Xuân Sinh (2014), Dược học cổ truyền, Nhà xuất y học, Hà Nội, tr.221-222 14 Thủ tướng Chính phủ (2013), Quyết định phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu đến năm 2020 định hướng đến năm 2030, Quyết định số 1976/QĐ-TTg, ngày 30/ 10/ 2013, tr.2 15 Viện Dược liệu (2016), Danh lục thuốc Việt Nam, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr.979 16 Trần Hoa Xuân (2017), Nghiên cứu tác dụng kháng nấm độc tính bán trường diễn tinh dầu vỏ Chúc (citrus hystrix) từ An Giang, Luận văn Dược sĩ Đại học, Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, Cần Thơ Tài liệu tiếng Anh 17 Andrews J.M (2001), "BSAC standardized disc susceptibility testing method", Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 48 (Suppl S1), pp.43-57 18 Ajithkumar I.N.P., et al.(2011), “Effect of Citrus hystrix and Citrus limon extracts on antibacterial activity against human pathogens”, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, pp.1-4 19 Borusiewicz M et al (2017), “Cytostatic, cytotoxic, and antibacterial activities of essential oil isolated from Citrus hystrix”, Science Asia, 43, pp.96-106 20 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2008), Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, Eighteenth Informational Supplement, Vol 28 (1) 21 Chanthaphon S., et al (2008), “Antimicrobial activities of essential oils and crude extracts from tropical Citrus spp against food-related microorganisms”, Songklanakarin Journal of Science and Technology, 30 (Suppl 1), pp.125-131 53 22 Doreen S.H NG, et al (2011), “Preliminary evaluation on the antibacterial activities of citrus hystrix oil emulsions stabilized by tween 80 and span 80”, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Vol (Suppl 2), pp.209-211 23 Hongratanaworakit T., et al (2007), “Chemical composition and stimulating effect of Citrus hystrix oil on humans”, Flavour And Fragrance Journal, Vol 22, pp.443-449 24 Laboni B., et al (2015), “In-vivo pharmacological investigations of citrus hystrix”, International Journal of Pharmacy, (4), pp.1149-1154 25 Loh F.S., et al (2011), “Insecticidal properties of Citrus hystrix DC leaves essential oil against Spodoptera litura fabricius”, Journal of Medicinal Plants Research, Vol (16), pp.3739-3744 26 Luo M et al (2004), “Acute and Genetic Toxicity of Essential Oil Extracted from Litsea cubeba (Lour.) Pers.”, Journal of Food Protection, Vol 68 (3), pp.581-588 27 MacGowan A.P., et al (2001), "Establishing MIC breakpoints and interpretation of in vitro susceptibility tests", Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 48 (Suppl S1), pp.17-28 28 Nurhani K., et al (2013), “extraction of citrus hystrix d.c (kaffir lime) essential oil using automated steam distillation process: analysis of volatile compounds”, The Malaysian Journal of Analytical Sciences, Vol 17 (3), pp.359-369 29 OECD/OCDE 404 (2002), OECD guideline for the testing of chemicals Acute Dermal Irritation/ Corrosion, pp.2-3 30 OECD/OCDE 423 (2001), Acute oral Toxicity- acute Toxic class method, OECD guideline for testing of chemicals, pp.4 31 Putri H., et al (2013), “Cardioprotective and hepatoprotective effects of Citrus hystrix peels extract on rats model”, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 3(5), pp.371-375 54 32 Phuagphong P., et al (2015), “Mechanisms of Molluscicidal Activity of Citrus hystrix against Pomacea canaliculata”, The International Conference on Herbal and Traditional Medicine, pp.54-60 33 Rahmatika Ayu Habsari, et al (2017) “Chemical Composition of Oil Fraction Kaffir Lime (Citrus hystrix DC) as Antibacterial Activity of E.coli”, Journal of Pure and Applied Chemistry Research, 7(1), pp.32-38 34 Siti Nur Atiqah Md Othman, et al (2016), “Essential Oils from the Malaysian Citrus (Rutaceae) Medicinal Plants”, Medicines, pp.1-11 35 Soonwera M (2015), “Efficacy of essential oils from Citrus plants against mosquito vectors Aedes aegypti (Linn.) and Culex quinquefasciatus (Say)”, Journal of Agricultural Technology 2015, Vol 11(3), pp.669-681 36 Srisukh V., et al (2012), “Antibacterial activity of essential oils from Citrus hystrix (makrut lime) against respiratory tract pathogens”, Science Asia, Vol 38, pp.212-217 37 Waikedre J., et al (2010), “Chemical Composition and Antimicrobial Activity of the Essential Oils from New Caledonian Citrus macroptera and Citrus hystrix”, Chemistry & biodiversity, Vol 7, pp.871-877 38 Wungsintaweekul J., et al (2010), “Antimicrobial, antioxidant activities and chemical composition of selected Thai spices”, Songklanakarin Journal of Science and Technology, 32 (6), pp.589-598 39 Zuhra C.F., et al (2014), “Comparison of Antimicrobial and Antioxidant Activities of Essential Oils from the Leaf and Peel Citrus Hystrix”, Proceedings of the 2nd International Conference on Natural and Environmental Sciences (ICONES), pp.67-72 ... kháng khuẩn độc tính cấp, độc tính chỗ tinh dầu vỏ Chúc (Citrus hystrix) trồng An Giang? ?? nhằm làm rõ hoạt tính sinh học độ an toàn tinh dầu vỏ Chúc, giúp cho việc nghiên cứu tinh dầu Chúc ngày rõ... 2.2.1.Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu vỏ Chúc 26 2.2.2.Khảo sát độc tính cấp tinh dầu vỏ Chúc 29 2.2.3.Khảo sát độc tính chỗ tinh dầu vỏ Chúc 31 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ... sát độc tính chỗ tinh dầu vỏ Chúc 41 Chương BÀN LUẬN 43 4.1 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu vỏ Chúc 43 4.2 Khảo sát độc tính cấp tinh dầu vỏ Chúc 44 4.3 Khảo sát độc