Liệu pháp miễn dịch sử dụng tế bào lympho tự thân là một trong những liệu pháp điều trị kết hợp an toàn và khá hiệu quả cho nhiều loại ung thư hiện nay, trong đó có ung thư phổi. Mục đích của nghiên cứu là hoàn thiện quy trình tách chiết, nuôi cấy hoạt hóa tế bào gamma delta T (γδT) trên bệnh nhân ung thư phổi. 10 bệnh nhân ung thư phổi được lựa chọn vào nghiên cứu, mỗi bệnh nhân được thu thập 10 ml máu, tiến hành tách chiết, nuôi cấy hoạt hóa, tăng sinh, đánh giá hoạt tính miễn dịch. Kết quả cho thấy, số lượng tế bào γδT tách từ 10 ml máu ngoại vi của bệnh nhân ung thư phổi là 1,96x104 tế bào.
Khoa học Y - Dược Ni cấy hoạt hóa, tăng sinh tế bào gamma delta T bệnh nhân ung thư phổi Nguyễn Quý Linh1*, Tạ Thành Đạt1, Lê Văn Toàn2, Trần Vân Khánh1, Hoàng Thị Mỹ Nhung3, Trần Huy Thịnh2 Trung tâm Nghiên cứu gen - protein, Trường Đại học Y Hà Nội Bộ mơn Hóa sinh, Trường Đại học Y Hà Nội Bộ môn Sinh học tế bào, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Ngày nhận 5/9/2019; ngày chuyển phản biện 9/9/2019; ngày nhận phản biện 11/10/2019; ngày chấp nhận đăng 4/11/2019 Tóm tắt: Liệu pháp miễn dịch sử dụng tế bào lympho tự thân liệu pháp điều trị kết hợp an toàn hiệu cho nhiều loại ung thư nay, có ung thư phổi Mục đích nghiên cứu hồn thiện quy trình tách chiết, ni cấy hoạt hóa tế bào gamma delta T (γδT) bệnh nhân ung thư phổi 10 bệnh nhân ung thư phổi lựa chọn vào nghiên cứu, bệnh nhân thu thập 10 ml máu, tiến hành tách chiết, ni cấy hoạt hóa, tăng sinh, đánh giá hoạt tính miễn dịch Kết cho thấy, số lượng tế bào γδT tách từ 10 ml máu ngoại vi bệnh nhân ung thư phổi 1,96x104 tế bào Sau 14 ngày nuôi cấy, số lượng tế bào lympho thu trung bình 2,93x108, tỷ lệ sống trung bình đạt 90%, đó, tế bào γδT chiếm 83,2% quần thể tế bào thu Tế bào γδT sau nuôi cấy thể hoạt tính miễn dịch khả gây độc cho tế bào ung thư tăng tiết cytokine IFNγ Từ khóa: liệu pháp miễn dịch tự thân, tế bào gamma delta T (γδT), ung thư phổi Chỉ số phân loại: 3.1 Đặt vấn đề Ung thư phổi bệnh có tỷ lệ mắc tử vong hàng đầu số loại ung thư giới Theo ghi nhận Globocan năm 2018 [1], số ca mắc ung thư phổi toàn giới 2,1 triệu ca, chiếm 11,6% tổng số ca mắc ung thư; số ca tử vong ung thư phổi 1,76 triệu ca, chiếm 18,4% số ca tử vong ung thư Tại Việt Nam, theo Globocan năm 2018 [2], tỷ lệ mắc ung thư phổi xếp thứ hai nam giới (chiếm 18,4%, sau ung thư gan) xếp thứ ba nữ giới (chiếm 9,4%, sau ung thư vú, ung thư đại trực tràng), có 164.671 ca mắc ung thư phổi 114.871 người tử vong bệnh Trong bối cảnh đó, việc phát triển phương pháp điều trị phối hợp phương pháp điều trị nhằm nâng cao hiệu quả, cải thiện chất lượng sống, thời gian sống thêm khơng bệnh sống thêm tồn thể với bệnh nhân ung thư phổi điều có ý nghĩa Trên giới, liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân sử dụng tế bào lympho γδT phát triển để điều trị nhiều loại ung thư, bao gồm ung thư phổi cho kết ban đầu hứa hẹn [3, 4] Tế bào γδT nhận biết trực tiếp phối tử khơng phải chất peptide mà khơng cần có mặt phức hệ phù hợp mơ (MHC) Nhiều nghiên cứu rằng, tế bào γδT người nhận biết phối tử biểu tế bào khối u thể độc tính mạnh với nhiều dòng tế bào ung thư [5] Liệu * pháp miễn dịch sử dụng tế bào γδT tự thân thử nghiệm mang lại số kết khả quan Trong liệu pháp này, tế bào miễn dịch tách từ máu ngoại vi người bệnh, ni cấy tăng sinh, hoạt hóa môi trường đặc biệt truyền trở lại vào thể bệnh nhân Trong nghiên cứu trước đây, số kháng nguyên phospho sử dụng để hoạt hóa tế bào γδT Kháng nguyên tổng hợp bromophydrin pyrophosphate (BrHPP) 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP) ứng dụng thành công việc tăng sinh tế bào γδT, thử nghiệm lâm sàng bệnh nhân ung thư biểu mô thận Những thử nghiệm lâm sàng pha I cho thấy, liệu pháp miễn dịch tự thân sử dụng tế bào γδT cho kết khả quan, hứa hẹn phát triển thành liệu pháp điều trị ung thư có hiệu [6] Hiện tại, Việt Nam giai đoạn tiếp cận với liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân điều trị ung thư chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu cơng bố lĩnh vực Do đó, nghiên cứu tiến hành với mục tiêu hồn thiện quy trình phân lập, ni cấy hoạt hóa tế bào γδT bệnh nhân ung thư phổi Trong nghiên cứu này, lựa chọn sử dụng zoledronate IL-2 để hoạt hóa, tăng sinh tế bào γδT in vitro hai hóa chất biết đến có khả hoạt hóa, tăng sinh tế bào γδT cấp phép sử dụng thử nghiệm lâm sàng Tác giả liên hệ: Email: quylinh@hmu.edu.vn 62(2) 2.2020 Khoa học Y - Dược Activation culture and proliferation of γδT cells from lung cancer patients Quy Linh Nguyen1*, Thanh Dat Ta1, Van Toan Le2, Van Khanh Tran1, Thi My Nhung Hoang3, Huy Thinh Tran2 Center for Gene and Protein Research, Hanoi Medical University Department of Biochemistry, Hanoi Medical University Department of Cell Biology, University of Science, Vietnam National University, Hanoi Received September 2019; accepted November 2019 Abstract: Autologous γδT lymphocyte-based immunotherapy is currently an efficacious and safe treatment method for various types of cancer, including lung cancer The study was conducted on 10 lung cancer patients, and the γδT cells were isolated, activated, proliferated, and evaluated from 10 ml of blood of each patient The number of γδT cells isolated from 10 ml peripheral blood was 1.96x104 cells The number of cells after 14-day culture was 2.93x108, and the cell survival rate was 90% 83.2% of the cultured lymphocytes was γδT cells The cultured γδT cells exhibited immune activities, such as cytotoxic activity and increased cytokine secretion Keywords: autologous immunotherapy, gamma delta T (γδT) cells, lung cancer Classification number: 3.1 Đối tượng phương pháp Đối tượng 10 bệnh nhân ung thư phổi lựa chọn vào nghiên cứu Bệnh nhân 18 tuổi, số toàn trạng ECOG (thang điểm Nhóm hợp tác ung thư Đơng Âu - Eastern Cooperative Oncology Group) ≤ Bệnh nhân khám Bệnh viện Đại học Y Hà Nội Các bệnh nhân có bệnh lý tự miễn, dùng thuốc ức chế miễn dịch, bệnh lý mạn tính kết hợp, bệnh lý ác tính dòng tế bào lympho T bị loại trừ khỏi nghiên cứu Phương pháp Phương pháp thu thập mẫu: 10 ml máu ngoại vi bệnh nhân ung thư phổi lấy vào ống chống đông heparin, bảo quản nhiệt độ phòng xử lý vòng Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu: Kỹ thuật phân tách tế bào lympho từ máu ngoại vi: tế bào 62(2) 2.2020 miễn dịch tách phương pháp ly tâm thay đổi tỷ trọng sử dụng Ficoll 1.077 Kỹ thuật ni cấy hoạt hóa tế bào γδT: sau phân lập, tế bào nuôi cấy môi trường AIM-V chứa 10% huyết bệnh nhân có bổ sung thêm cytokine IL-2 (600 IU/ml) zoledronate (5 mM) Khi tế bào ổn định, đạt mật độ nuôi cấy cần thiết (70-80%) chuyển sang điều kiện nuôi cấy tăng sinh số lượng lớn Tổng thời gian nuôi cấy hoạt hóa tế bào lympho γδT 14 ngày Phương pháp xác định tỷ lệ tế bào sống sử dụng Trypan blue: tế bào sau phân lập từ máu ngoại vi sau nuôi cấy nhuộm với Trypan blue để đếm số lượng xác định tỷ lệ tế bào sống Kỹ thuật phân loại tế bào nuôi cấy Flow cytometry: dựa biểu marker đặc hiệu bề mặt tế bào tương ứng với giai đoạn hoạt hóa biệt hóa loại tế bào lympho Các marker sử dụng CD3, CD4, CD8, CD19, CD56 Các tế bào lympho nhuộm với kháng thể kháng marker đặc hiệu cho loại tế bào đếm máy đếm dòng chảy tế bào BD FACS Canto II Kỹ thuật Realtime PCR xác định mức độ biểu gen IFNγ, Vγ9: RNA tổng số tách chiết từ tế bào γδT kit RNeasy mini kit (Qiagen), sau tổng hợp cDNA Revert first strand cDNA synthesis kit (Thermo fisher scientific, USA) để sử dụng làm khuôn cho phản ứng Realtime PCR sử dụng cặp mồi probe đặc hiệu gen IFNγ gen Vγ9 (Thermo fisher scientific, USA) hệ thống máy QuantStudio3 (Thermo fisher scientific, USA) Kỹ thuật ELISA đánh giá khả tiết IFNγ môi trường nuôi cấy: kỹ thuật dựa nguyên lý phản ứng kết hợp kháng nguyên kháng thể, đồng thời sử dụng kháng thể gắn enzyme chất phát màu mà qua xác định nồng độ protein cần biết mẫu phân tích (ở mơi trường ni cấy) Nồng độ IFNγ môi trường nuôi cấy định lượng kỹ thuật ELISA sử dụng IFNγ human ELISA kit (Thermo fisher scientific, USA) Kỹ thuật xác định khả gây độc tế bào: tế bào ung thư phổi H640 nhuộm với chất huỳnh quang Calcein-AM, sau rửa Tế bào ung thư ni cấy với số lượng 1x104 đồng nuôi cấy với tế bào miễn dịch γδT với tỷ lệ 1:1, 1:10, 1:30 Hoạt tính gây độc xác định tín hiệu huỳnh quang giải phóng mơi trường, đo hệ thống Terascan VPC (Minerva Tech, Nhật Bản) Xử lý số liệu: số liệu nhập xử lý phần mềm thống kê SPSS 20.0 Thống kê phân tích sử dụng t-test độc lập so sánh hai nhóm Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu thuộc đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu sử dụng tế bào miễn dịch tự thân gamma delta T (γδT) diệt tự nhiên (NK) điều trị ung thư phổi” Hội đồng đạo đức Trường Đại học Y Hà Nội đồng ý thông qua giai đoạn thử nghiệm người tình nguyện khoẻ mạnh bệnh nhân ung thư Khoa học Y - Dược Kết Chuẩn hóa quy trình ni cấy hoạt hóa, tăng sinh tế bào γδT bệnh nhân ung thư phổi Sử dụng nồng độ zoledronate IL-2 khác nhau, 2,5 mM - 300 IU, 2,5 mM - 600 IU, mM - 300 IU mM - 600 IU, tiến hành nuôi cấy xác định tốc độ tăng trưởng tế bào γδT số thời điểm nuôi cấy Kết thể hình Số lượng tổng số tế bào thu sau 14 ngày nuôi cấy tăng sinh đạt cao nồng độ zoledronate - IL-2 mM - 600 IU Số lượng tế bào đạt 2,6x108 tế bào thỏa mãn yêu cầu cần đạt Tế bào lympho T đạt tỷ lệ cao với 96,6% nồng độ zoledronate IL-2 mM 600 IU, tỷ lệ tế bào γδT điều kiện ni cấy tăng sinh, hoạt hóa đạt 95% tổng số tế bào T thu Như vậy, nồng độ zoledronate IL-2 tối ưu cho ni cấy tăng sinh, hoạt hóa tế bào γδT mM 600 IU Số lượng tế bào lympho γδT tách từ bệnh nhân ung thư phổi thu sau ni cấy hoạt hóa, tăng sinh Bảng Đặc điểm tế bào thu sau nuôi cấy hoạt hóa Số lượng tế bào Tỷ lệ sống Tỷ lệ tế bào γδT BN01 1,5x108 91% 81% BN02 4,5x108 89% 83% BN03 1,1x108 92% 86% BN04 1,6x108 93% 87% BN05 4,8x108 97% 84% BN06 2,5x108 96% 82% BN07 2,8x108 90% 83% BN08 3,7x108 78% 80% BN09 3,2x108 90% 85% BN10 3,6x108 90% 81% TB 2,93x108 90,6% 83,2% TB: trung bình Bảng cho thấy, số lượng tế bào trung bình thu sau 14 ngày ni cấy hoạt hóa, tăng sinh 2,93x108, tỷ lệ tế bào γδT trung bình đạt 83,2% (hình 2) Quần thể tế bào thu sau 14 ngày nuôi cấy biểu mức độ cao gen Vγ9 mã hóa cho thụ thể bề mặt Vγ9 đặc trưng cho tế bào γδT (hình 2C) Kết chứng minh quần thể tế bào thu sau nuôi cấy chiếm tỷ lệ lớn tế bào γδT Tỷ lệ sống đạt 90,6% So sánh với trước nuôi cấy, tế bào nhân lên trung bình 14.949 lần (A) (A) (A) (A)(A) (A) Hình Đường cong sinh trưởng tế bào γδT nồng độ zoledronate/IL-2 khác 5% 5% 5%5% 5% 5% Số lượng tế bào lympho thu sau tách chiết từ máu ngoại vi bệnh nhân ung thư phổi (B) Bảng Đặc điểm tế bào thu sau phân lập từ máu(B) (B) (B) ngoại vi Số lượng tế bào Tỷ lệ sống Tỷ lệ tế bào γδT BN01 1,5x10 95% 5,1% BN02 1,8x104 94% 6,2% BN03 1,9x104 96% 5% BN04 1,2x104 95% 6,3% BN05 1,4x104 90% 6,4% BN06 2,4x104 98% 6,2% BN07 2,6x104 95% 6,1% BN08 1,9x104 92% 5,8% BN09 2,2x104 96% 6,5% BN10 2,7x104 97% 5,8% TB 1,96x10 94,8% 5,94% (B) (B) 86% 86% 86% 86% 86% 86% (C) TB: trung bình Bảng cho thấy, số lượng tế bào lympho tách từ 10 ml máu ngoại vi bệnh nhân ung thư phổi trung bình 1,96x104 Trong đó, tế bào γδT chiếm tỷ lệ trung bình 5,94% Tỷ lệ tế bào sống đạt 94,8% 62(2) 2.2020 Hình Tỷ lệ tế bào γδT thu trước sau nuôi cấy (A) Tỷ lệ tế bào γδT thu trước nuôi cấy; (B) Tỷ lệ tế bào γδT sau nuôi cấy; (C) Biểu gen mã hóa cho thụ thể Vγ9 tế bào αβT, tế bào γδT trước sau nuôi cấy *: p