Nuôi cấy hoạt hóa và đánh giá tính đáp ứng miễn dịch của tế bào lympho gamma delta t từ bệnh nhân ung thư phổi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Quý Linh NUÔI CẤY HOẠT HĨA VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA TẾ BÀO LYMPHO GAMMA DELTA T (γδT) TỪ BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Quý Linh NI CẤY HOẠT HĨA VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA TẾ BÀO LYMPHO GAMMA DELTA T (γδT) TỪ BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung PGS.TS Trần Huy Thịnh Hà Nội – Năm 2019 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: PGS.TS Hồng Thị Mỹ Nhung, Trưởng Bộ mơn Sinh học tế bào, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội PGS.TS Trần Huy Thịnh, phó Trưởng Bộ mơn Hóa sinh, Phó giám đốc Trung tâm kiểm định chất lượng xét nghiệm y học, Trường Đại học Y Hà Nội, người hướng dẫn khoa học, người thầy định hướng, tận tình truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu tạo điều kiện thuận lợi suốt trình học tập nghiên cứu để tơi hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến GS.TS.BS Tạ Thành Văn, Hiệu trưởng Trường Đại học Y Hà Nội, Giám đốc Trung tâm nghiên cứu Gen-protein, Trường Đại học Y Hà Nội , PGS.TS.BS Trần Vân Khánh, Trưởng Bộ môn Bệnh học phân tử, Khoa Kỹ thuật Y Học, phó Giám đốc tồn thể cán Trung tâm nghiên cứu Genprotein, Trường đại học Y Hà Nội, nơi tơi gắn bó 10 năm, tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, làm việc nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS BS Nguyễn Thanh Bình anh chị Kỹ thuật viên Khoa Xét nghiệm Huyết Học bệnh viện Nhi Trung Ương tận tình giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu để tơi hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bệnh nhân người tình nguyện giúp đỡ để tơi thực nghiên cứu Cuối xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dưỡng tình u thương cha mẹ tơi, vợ hai trai người thân gia đình bạn bè, người bên tôi, động viên chỗ dựa vững cho yên tâm học tập hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày 02 tháng 09 năm 2019 Học viên NGUYỄN QUÝ LINH i Nghiên cứu thực với hỗ trợ kinh phí Đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu sử dụng tế bào miễn dịch tự thân Gamma Delta T (γδT) diệt tự nhiên (NK) điều trị ung thư phổi”, mã số: KC.10.26/16-20, thuộc chương trình: “Nghiên cứu ứng dụng phát triển cơng nghệ tiên tiến phục vụ bảo vệ chăm sóc sức khỏe cộng đồng”, KC.10/16-20 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi Nguyễn Quý Linh, học viên cao học khóa 26 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, khoa Sinh học, chuyên ngành Sinh học thực nghiệm, xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn khoa học PGS.TS Trần Huy Thịnh PGS.TS Hồng Thị Mỹ Nhung Cơng trình khơng trùng lập với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thơng tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, phần kết Đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu sử dụng tế bào miễn dịch tự thân Gamma Delta T (γδT) diệt tự nhiên (NK) điều trị ung thư phổi”đã chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày 02 tháng 09 năm 2019 Người viết cam đoan NGUYỄN QUÝ LINH iii MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ C n TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan un t p ổi 1.1.1 Dịch tễ học ung thư phổi 1.1.2 Các yếu tố nguy 1.1.3 Đáp ứng miễn dịch ung thư phổi 1.2 Tổng quan liệu pháp tế bào miễn dịch tự t ân γδT tách từ máu ngoại vi tron điều trị un t phổi 10 1.2.1 Giám sát miễn dịch né tránh đáp ứng miễn dịch ung thư 10 1.2.2 Vi môi trường quanh khối u tính sinh miễn dịch ung thư phổi 12 1.2.3 Liệu pháp miễn dịch điều trị ung thư 12 1.2.4 Các liệu pháp miễn dịch dùng điều trị ung thư 15 1.2.5 Vai trò, đặc điểm chức tế bào γδT 20 1.2.6 Sự hoạt hoá nhận diện tế bào ung thư tế bào T 22 1.2.7 Cơ chế tác dụng kháng ung thư tế bào T 24 1.2.8 Liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân điều trị ung thư 26 1.2.9 Ni cấy hoạt hố, biệt hố tăng sinh tế bào T ứng dụng liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân điều trị ung thư 28 1.2.10 Ứng dụng tế bào T điều trị ung thư phổi 30 C n ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 Đối t ợng nghiên cứu 33 2.1.1 Cỡ mẫu 33 2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn tiêu chuẩn loại trừ đối tượng nghiên cứu 33 22 P n p áp n iên cứu 34 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 34 2.2.2 Nội dung số nghiên cứu thu thập ban đầu 35 2.2.3 Phương pháp thu thập mẫu 36 iv 2.2.4 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất nghiên cứu 36 2.2.5 Các phương pháp kỹ thuật sử dụng 38 2.3 Xử lý số liệu 43 2.4 Đạo đức nghiên cứu 44 C n KẾT QUẢ 45 3.1 Chuẩn hóa quy trình phân lập, ni cấy tế bào γδT mẫu n ời khỏe mạnh 45 3.2 Số l ợng tế bào miễn dịc γδT t u đ ợc sau nuôi cấy 52 3.2.1 Số lượng tế bào miễn dịch γδT thu sau ni cấy người tình nguyện khỏe mạnh 52 3.2.2 Số lượng tế bào miễn dịch γδT thu sau nuôi cấy bệnh nhân ung thư phổi 55 3 Xác định tỷ lệ tế bào γδT tron quần thể tế bào t u đ ợc sau nuôi cấy 57 3.3.1 Xác định tỷ lệ tế bào γδT quần thể tế bào sau nuôi cấy người khỏe mạnh 58 3.3.2 Xác định tỷ lệ tế bào γδT quần thể tế bào sau nuôi cấy bệnh nhân ung thư phổi 61 Đán iá mức độ hoạt hóa hoạt tính tế bào miễn dịc γδT sau nuôi cấy 64 3.4.1 Khả tiết IFNγ tế bào γδT vào môi trường nuôi cấy sau hoạt hóa, tăng sinh 64 3.4.2 Hoạt tính gây độc cho tế bào tế bào γδT sau nuôi cấy 70 KẾT LUẬN 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Đáp ứng miễn dịch ung thư phổi Hình 1.2 Tác dụng chemokine TAMs MDSCs 10 Hình 1.3: Quá trình hoạt hoá, nhận diện kháng nguyên đáp ứng miễn dịch kháng ung thư tế bào T 23 Hình 1.4: Cơ chế tác dụng kháng ung thư tế bào γδT 25 Hình 1.5: Minh hoạ giai đoạn q trình sử dụng liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân T điều trị ung thư 27 Hình 1.6: Minh hoạ khả ly giải tế bào ung thư phổi thực nghiệm tế bào T tách từ máu ngoại vi người, ni cấy hoạt hố với kháng ngun phosphor 31 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm mô tả tiến cứu 35 Hình 2.2 Liệu trình phân lập, ni cấy hoạt hóa tăng sinh tế bào γδT 36 Hình 3.1: Đường cong sinh trưởng tế bào miễn dịch nồng độ zoledromate IL-2 khác 45 Hình 3.2: Hình ảnh tế bào miễn dịch γδT sau nuôi cấy nồng độ zoledronate/IL-2 khác 46 Hình 3.3: Hình ảnh xác định tỷ lệ tế bào γδT quần thể tế bào thu sau nuôi cấy nồng độ zoledronate IL-2 khác 47 Hình 3.4: Hình ảnh tế bào người khỏe mạnh C02 trước sau ni cấy 53 Hình 3.6: Hình ảnh tế bào bệnh nhân ung thư BN01 trước sau nuôi cấ 56 Hình 3.7: Hình ảnh tế bào bệnh nhân ung thư BN05 trước sau nuôi cấy 57 Hình 3.8: Kết đếm dòng chảy tế bào xác định tỷ lệ tế bào γδT mẫu C02 59 Hình 3.9: Kết đếm dòng chảy tế bào xác định tỷ lệ tế bào γδT mẫu BN06 62 Hình 3.10: Mức độ biểu mRNA IFNγ tế bào γδT trước sau nuôi cấy 66 Hình 3.11: Nồng độ IFNγ mơi trường tế bào trước sau nuôi cấy 68 Hình 3.12: Hoạt tính gây độc tế bào tế bào lympho γδT sau 14 ngày nuôi cấy 71 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm loại tế bào lympho T 20 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 41 Bảng 2.2 Trình tự mồi gen IFNγ Vγ9 41 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng Realtime PCR 42 Bảng 3.1: Số lượng tế bào miễn dịch γδT nuôi cấy nồng độ zoledronate IL-2 khác 45 Bảng 3.2: Tỷ lệ tế bào lympho T γδT quần thể tế bào thu sau nuôi cấy 48 Bảng 3.3: Số lượng tế bào nhóm người tình nguyện khỏe mạnh sau ni cấy 52 Bảng 3.4: Số lượng tế bào nhóm bệnh nhân ung thư phổi thu sau nuôi cấy 55 Bảng 3.5: Tỷ lệ tế bào γδT người tình nguyện khỏe mạnh trước sau nuôi cấy 58 Bảng 3.6: Tỷ lệ tế bào γδT bệnh nhân ung thư phổi trước sau nuôi cấy 61 Bảng 3.7: Kết đánh giá mức độ biểu mRNA IFNγ trước sau nuôi cấy 64 Bảng 3.8: Nồng độ IFNγ trước sau nuôi cấy hoạt hóa (pg/ml) 67 vii ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư phổi bệnh có tỷ lệ mắc tử vong hàng đầu số loại ung thư giới Theo ghi nhận Globocan năm 2018, số ca mắc ung thư phổi toàn giới 2,1 triệu ca, chiếm 11,6% tổng số ca mắc ung thư số ca tử vong ung thư phổi 1,76 triệu ca, chiếm 18,4% tổng số ca tử vong ung thư [11] Tại Mỹ, nước có hệ thống y tế đại phát triển, theo ACS ước tính năm 2019 có 234.030 ca mắc mới, chiếm 13% tổng số ca mắc ung thư 142.670 ca tử vong [110] Tại Việt Nam, theo Globocan năm 2018, tỷ lệ mắc ung thư phổi xếp thứ hai nam giới (chiếm 18,4%, sau ung thư gan) xếp thứ ba nữ giới (chiếm 9,4%, sau ung thư vú, ung thư đại trực tràng), có 164.671 ca mắc ung thư phổi 114.871 người tử vong bệnh [38] Từ đó, việc phát triển phương pháp điều trị việc phối hợp phương pháp điều trị nhằm nâng cao hiệu quả, cải thiện chất lượng sống, thời gian sống thêm không bệnh sống thêm toàn thể với bệnh nhân ung thư phổi điều có ý nghĩa Trên giới nay, liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân phát triển để điều trị nhiều loại ung thư, bao gồm ung thư phổi cho kết ban đầu hứa hẹn [8,49,141] Từ năm 2017, trường Đại học Y Hà Nội thiết lập quy trình tách, ni cấy hoạt hóa, biệt hóa tăng sinh tạo khối tế bào miễn dịch tự thân T-CD8 Bộ Y Tế cho ứng dụng liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân T-CD8 điều trị thử nghiệm lâm sàng năm loại ung thư sau: ung thư phổi, ung thư gân, ung thư vú, ung thư dày, ung thư đại trực tràng Việc triển khai đề tài “Nghiên cứu sử dụng tế bào miễn dịch tự thân gamma delta ɣδT diệt tự nhiên NK điều trị ung thư phổi” trường Đại học Y Hà Nội, Học viện Quân Y, Bệnh viện K Trung ương thiết thực cung cấp thêm liệu pháp điều trị cho bệnh nhân ung thư nước ta Với liệu pháp này, bệnh nhân cần đến sở lấy lượng máu định, sau trở nhà quay lại sở để truyền tế bào miễn dịch ni cấy hoạt hóa, biệt hóa tăng sinh sau tuần Hiệu phương pháp phụ thuộc nhiều vào việc tối ưu hóa mơi trường 32 Dunn GP, Old LJ, Schreiber RD The immunobiology of cancer immunosurveillance and immunoediting Immunity 2004;21(2):137-148 doi:10.1016/j.immuni.2004.07.017 33 Ellis LM, Hicklin DJ VEGF-targeted therapy: mechanisms of anti-tumour activity Nat Rev Cancer 2008;8(8):579-591 doi:10.1038/nrc2403 34 Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, et al Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012 Int J Cancer 2015;136(5):E359-386 doi:10.1002/ijc.29210 35 Freed-Pastor WA, Mizuno H, Zhao X, et al Mutant p53 disrupts mammary tissue architecture via the mevalonate pathway Cell 2012;148(1-2):244-258 doi:10.1016/j.cell.2011.12.017 36 Gaffen SL, Liu KD Overview of interleukin-2 function, production and clinical applications Cytokine 2004;28(3):109-123 doi:10.1016/j.cyto.2004.06.010 37 Gao Y, Yang W, Pan M, et al Gamma delta T cells provide an early source of interferon gamma in tumor immunity J Exp Med 2003;198(3):433-442 doi:10.1084/jem.20030584 38 Global Cancer Observatory http://gco.iarc.fr/ Accessed August 28, 2019 39 Gober H-J, Kistowska M, Angman L, Jenö P, Mori L, De Libero G Human T cell receptor gammadelta cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells J Exp Med 2003;197(2):163-168 doi:10.1084/jem.20021500 40 Gomes AQ, Martins DS, Silva-Santos B Targeting γδ T Lymphocytes for Cancer Immunotherapy: From Novel Mechanistic Insight to Clinical Application Cancer Res 2010;70(24):10024-10027 doi:10.1158/00085472.CAN-10-3236 77 41 Grievink HW, Luisman T, Kluft C, Moerland M, Malone KE Comparison of Three Isolation Techniques for Human Peripheral Blood Mononuclear Cells: Cell Recovery and Viability, Population Composition, and Cell Functionality Biopreservation Biobanking 2016;14(5):410-415 doi:10.1089/bio.2015.0104 42 de Groot PM, Wu CC, Carter BW, Munden RF The epidemiology of lung cancer Transl Lung Cancer Res 2018;7(3):220-233 doi:10.21037/tlcr.2018.05.06 43 Grulich AE, van Leeuwen MT, Falster MO, Vajdic CM Incidence of cancers in people with HIV/AIDS compared with immunosuppressed transplant recipients: a meta-analysis Lancet Lond Engl 2007;370(9581):59-67 doi:10.1016/S0140-6736(07)61050-2 44 Haji-Fatahaliha M, Hosseini M, Akbarian A, Sadreddini S, Jadidi-Niaragh F, Yousefi M CAR-modified T-cell therapy for cancer: an updated review Artif Cells Nanomedicine Biotechnol 2016;44(6):1339-1349 doi:10.3109/21691401.2015.1052465 45 Hiraoka K, Miyamoto M, Cho Y, et al Concurrent infiltration by CD8+ T cells and CD4+ T cells is a favourable prognostic factor in non-small-cell lung carcinoma Br J Cancer 2006;94(2):275-280 doi:10.1038/sj.bjc.6602934 46 Humans IWG on the E of CR to Chemical Agents and Related Occupations International Agency for Research on Cancer; 2012 47 Huntington ND, Legrand N, Alves NL, et al IL-15 trans-presentation promotes human NK cell development and differentiation in vivo J Exp Med 2009;206(1):25-34 doi:10.1084/jem.20082013 78 48 Hwang S-J, Cheng LS-C, Lozano G, Amos CI, Gu X, Strong LC Lung cancer risk in germline p53 mutation carriers: association between an inherited cancer predisposition, cigarette smoking, and cancer risk Hum Genet 2003;113(3):238-243 doi:10.1007/s00439-003-0968-7 49 Iliopoulou EG, Kountourakis P, Karamouzis MV, et al A phase I trial of adoptive transfer of allogeneic natural killer cells in patients with advanced non-small cell lung cancer Cancer Immunol Immunother CII 2010;59(12):1781-1789 doi:10.1007/s00262-010-0904-3 50 Introna M, Golay J, Rambaldi A Cytokine Induced Killer (CIK) cells for the treatment of haematological neoplasms Immunol Lett 2013;155(1-2):27-30 doi:10.1016/j.imlet.2013.09.017 51 Ishigami S, Natsugoe S, Tokuda K, et al Tumor-associated macrophage (TAM) infiltration in gastric cancer Anticancer Res 2003;23(5A):4079-4083 52 Ishimoto T, Sawayama H, Sugihara H, Baba H Interaction between gastric cancer stem cells and the tumor microenvironment J Gastroenterol 2014;49(7):1111-1120 doi:10.1007/s00535-014-0952-0 53 Kakimi K, Matsushita H, Murakawa T, Nakajima J γδ T cell therapy for the treatment of non-small cell lung cancer Transl Lung Cancer Res 2013;3(1):23-33-33 54 Kalos M, June CH Adoptive T cell transfer for cancer immunotherapy in the era of synthetic biology Immunity 2013;39(1):49-60 doi:10.1016/j.immuni.2013.07.002 55 Keir ME, Butte MJ, Freeman GJ, Sharpe AH PD-1 and its ligands in tolerance and immunity Annu Rev Immunol doi:10.1146/annurev.immunol.26.021607.090331 79 2008;26:677-704 56 Kilinc MO, Aulakh KS, Nair RE, et al Reversing tumor immune suppression with intratumoral IL-12: activation of tumor-associated T effector/memory cells, induction of T suppressor apoptosis, and infiltration of CD8+ T effectors J Immunol Baltim Md 1950 2006;177(10):6962-6973 doi:10.4049/jimmunol.177.10.6962 57 Kim R Cetuximab and panitumumab: are they interchangeable? Lancet Oncol 2009;10(12):1140-1141 doi:10.1016/S1470-2045(09)70312-2 58 Kligerman S, White C Epidemiology of lung cancer in women: risk factors, survival, and screening AJR Am J Roentgenol 2011;196(2):287-295 doi:10.2214/AJR.10.5412 59 Kobayashi H, Tanaka Y, Yagi J, Minato N, Tanabe K Phase I/II study of adoptive transfer of γδ T cells in combination with zoledronic acid and IL-2 to patients with advanced renal cell carcinoma Cancer Immunol Immunother 2011;60(8):1075-1084 doi:10.1007/s00262-011-1021-7 60 Kondo M, Izumi T, Fujieda N, et al Expansion of Human Peripheral Blood γδ T Cells using Zoledronate J Vis Exp 2011;(55):3182 doi:10.3791/3182 61 Kondo M, Sakuta K, Noguchi A, et al Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional gammadelta T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy Cytotherapy 2008;10(8):842-856 doi:10.1080/14653240802419328 62 Kong Y, Cao W, Xi X, Ma C, Cui L, He W The NKG2D ligand ULBP4 binds to TCRgamma9/delta2 and induces cytotoxicity to tumor cells through both TCRgammadelta and NKG2D doi:10.1182/blood-2008-12-196287 80 Blood 2009;114(2):310-317 63 Lafont V, Sanchez F, Laprevotte E, et al Plasticity of gamma delta T cells: impact on the anti-tumor response Front Immunol 2014;5 doi:10.3389/fimmu.2014.00622 64 Lanier LL Up on the tightrope: natural killer cell activation and inhibition Nat Immunol 2008;9(5):495-502 doi:10.1038/ni1581 65 Lapteva N, Durett AG, Sun J, et al Large-scale ex vivo expansion and characterization of natural killer cells for clinical applications Cytotherapy 2012;14(9):1131-1143 doi:10.3109/14653249.2012.700767 66 Lazennec G, Richmond A Chemokines and chemokine receptors: new insights into cancer-related inflammation Trends Mol Med 2010;16(3):133144 doi:10.1016/j.molmed.2010.01.003 67 Lee W, Jiang Z, Liu J, et al The mutation spectrum revealed by paired genome sequences from a lung cancer patient Nature 2010;465:473 68 Legut M, Cole DK, Sewell AK The promise of γδ T cells and the γδ T cell receptor for cancer immunotherapy Cell Mol Immunol 2015;12(6):656-668 doi:10.1038/cmi.2015.28 69 Li R, Wang C, Liu L, et al Autologous cytokine-induced killer cell immunotherapy in lung cancer: a phase II clinical study Cancer Immunol Immunother CII 2012;61(11):2125-2133 doi:10.1007/s00262-012-1260-2 70 Li S, Schmitz KR, Jeffrey PD, Wiltzius JJW, Kussie P, Ferguson KM Structural basis for inhibition of the epidermal growth factor receptor by cetuximab Cancer Cell 2005;7(4):301-311 doi:10.1016/j.ccr.2005.03.003 71 Li W, Kubo S, Okuda A, et al Effect of IL-18 on expansion of gammadelta T cells stimulated by zoledronate and IL-2 J Immunother Hagerstown Md 1997 2010;33(3):287-296 doi:10.1097/CJI.0b013e3181c80ffa 81 72 Lisiecka U, Kostro K Mechanisms of tumour escape from immune surveillance J Vet Res 2016;60(4):453-460 doi:10.1515/jvetres-2016-0068 73 Livak KJ, Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods San Diego Calif 2001;25(4):402-408 doi:10.1006/meth.2001.1262 74 Llosa NJ, Geis AL, Thiele Orberg E, Housseau F Interleukin-17 and type 17 helper T cells in cancer management and research Immunotargets Ther 2014;3:39-54 doi:10.2147/ITT.S56529 75 Lundin J, Kimby E, Björkholm M, et al Phase II trial of subcutaneous antiCD52 monoclonal antibody alemtuzumab (Campath-1H) as first-line treatment for patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) Blood 2002;100(3):768-773 doi:10.1182/blood-2002-01-0159 76 Mantovani A, Bottazzi B, Colotta F, Sozzani S, Ruco L The origin and function of tumor-associated macrophages Immunol Today 1992;13(7):265270 doi:10.1016/0167-5699(92)90008-U 77 Massagué J TGFbeta in Cancer Cell 2008;134(2):215-230 doi:10.1016/j.cell.2008.07.001 78 Mellman I, Coukos G, Dranoff G Cancer immunotherapy comes of age Nature 2011;480(7378):480-489 doi:10.1038/nature10673 79 Mentlik James A, Cohen AD, Campbell KS Combination Immune Therapies to Enhance Anti-Tumor Responses by NK Cells Front Immunol 2013;4 doi:10.3389/fimmu.2013.00481 80 Mittal D, Gubin MM, Schreiber RD, Smyth MJ New insights into cancer immunoediting and its three component phases elimination, equilibrium and escape Curr Opin Immunol 2014;27:16-25 doi:10.1016/j.coi.2014.01.004 82 81 Morgan RA, Dudley ME, Wunderlich JR, et al Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes Science 2006;314(5796):126-129 doi:10.1126/science.1129003 82 Munk RB, Sugiyama K, Ghosh P, et al Antigen-Independent IFN-γ Production by Human Naïve CD4+ T Cells Activated by IL-12 Plus IL-18 PLOS ONE 2011;6(5):e18553 doi:10.1371/journal.pone.0018553 83 Murdoch C, Muthana M, Coffelt SB, Lewis CE The role of myeloid cells in the promotion of tumour angiogenesis Nat Rev Cancer 2008;8(8):618-631 doi:10.1038/nrc2444 84 Nakajima J, Murakawa T, Fukami T, et al A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous gammadelta T cells Eur J Cardio-Thorac Surg Off J Eur Assoc Cardio-Thorac Surg 2010;37(5):1191-1197 doi:10.1016/j.ejcts.2009.11.051 85 Narayan K, Sylvia KE, Malhotra N, et al Intrathymic programming of effector fates in three molecularly distinct γδ T cell subtypes Nat Immunol 2012;13(5):511-518 doi:10.1038/ni.2247 86 Ness-Schwickerath KJ, Jin C, Morita CT Cytokine requirements for the differentiation and expansion of IL-17A- and IL-22-producing human Vgamma2Vdelta2 T cells J Immunol Baltim Md 1950 2010;184(12):72687280 doi:10.4049/jimmunol.1000600 87 Nilsson C, Aboud S, Karlén K, Hejdeman B, Urassa W, Biberfeld G Optimal blood mononuclear cell isolation procedures for gamma interferon enzymelinked immunospot testing of healthy Swedish and Tanzanian subjects Clin Vaccine Immunol CVI 2008;15(4):585-589 doi:10.1128/CVI.00161-07 83 88 Ostrand-Rosenberg S, Sinha P Myeloid-derived suppressor cells: linking inflammation and cancer J Immunol Baltim Md 1950 2009;182(8):44994506 doi:10.4049/jimmunol.0802740 89 Paust S, von Andrian UH Natural killer cell memory Nat Immunol 2011;12(6):500-508 90 Qin Z, Schwartzkopff J, Pradera F, et al A critical requirement of interferon gamma-mediated angiostasis for tumor rejection by CD8+ T cells Cancer Res 2003;63(14):4095-4100 91 Racila E, Link BK, Weng W-K, et al A polymorphism in the complement component C1qA correlates with prolonged response following rituximab therapy of follicular lymphoma Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res 2008;14(20):6697-6703 doi:10.1158/1078-0432.CCR-08-0745 92 Ratto GB, Cafferata MA, Scolaro T, et al Phase II study of combined immunotherapy, chemotherapy, and radiotherapy in the postoperative treatment of advanced non-small-cell lung cancer J Immunother Hagerstown Md 1997 2000;23(1):161-167 93 Remark R, Becker C, Gomez JE, et al The Non–Small Cell Lung Cancer Immune Contexture A Major Determinant of Tumor Characteristics and Patient Outcome Am J Respir Crit Care Med 2015;191(4):377-390 doi:10.1164/rccm.201409-1671PP 94 Rezvani K, Rouce RH The Application of Natural Killer Cell Immunotherapy for the Treatment of Cancer Front Immunol 2015;6:578 doi:10.3389/fimmu.2015.00578 95 Ribot JC, Ribeiro ST, Correia DV, Sousa AE, Silva-Santos B Human γδ thymocytes are functionally immature and differentiate into cytotoxic type 84 effector T cells upon IL-2/IL-15 signaling J Immunol Baltim Md 1950 2014;192(5):2237-2243 doi:10.4049/jimmunol.1303119 96 Roelofs AJ, Jauhiainen M, Mönkkönen H, Rogers MJ, Mönkkönen J, Thompson K Peripheral blood monocytes are responsible for γδ T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP Br J Haematol 2009;144(2):245-250 doi:10.1111/j.1365-2141.2008.07435.x 97 Rosenblatt J, Wu Z, Vasir B, et al Generation of tumor-specific T lymphocytes using dendritic cell/tumor fusions and anti-CD3/CD28 J Immunother Hagerstown Md 1997 2010;33(2):155-166 doi:10.1097/CJI.0b013e3181bed253 98 Rutella S, Iudicone P, Bonanno G, et al Adoptive immunotherapy with cytokine-induced killer cells generated with a new good manufacturing practice-grade protocol Cytotherapy 2012;14(7):841-850 doi:10.3109/14653249.2012.681038 99 Sabado RL, Balan S, Bhardwaj N Dendritic cell-based immunotherapy Cell Res 2017;27(1):74-95 doi:10.1038/cr.2016.157 100 Sadeghi S, Sanati MH, Taghizadeh M, Mansouri P, Jadali Z Study of Th1/Th2 balance in peripheral blood mononuclear cells of patients with alopecia areata Acta Microbiol Immunol Hung 2015;62(3):275-285 doi:10.1556/030.62.2015.3.5 101 Sakamoto M, Nakajima J, Murakawa T, et al Adoptive immunotherapy for advanced non-small cell lung cancer using zoledronate-expanded γδTcells: a phase I clinical study J Immunother Hagerstown Md 1997 2011;34(2):202211 doi:10.1097/CJI.0b013e318207ecfb 85 102 Salih HR, Rammensee H-G, Steinle A Cutting edge: down-regulation of MICA on human tumors by proteolytic shedding J Immunol Baltim Md 1950 2002;169(8):4098-4102 doi:10.4049/jimmunol.169.8.4098 103 Sangiolo D Cytokine Induced Killer Cells as Promising Immunotherapy for Solid Tumors J Cancer 2011;2:363-368 104 Santillan AA, Camargo CA, Colditz GA A meta-analysis of asthma and risk of lung cancer (United States) Cancer Causes Control 2003;14(4):327-334 doi:10.1023/A:1023982402137 105 Schreiber RD, Old LJ, Smyth MJ Cancer immunoediting: integrating immunity’s roles in cancer suppression and promotion Science 2011;331(6024):1565-1570 doi:10.1126/science.1203486 106 Scotet E, Martinez LO, Grant E, et al Tumor recognition following Vgamma9Vdelta2 T cell receptor interactions with a surface F1-ATPaserelated structure and apolipoprotein A-I Immunity 2005;22(1):71-80 doi:10.1016/j.immuni.2004.11.012 107 Shin S, El-Diwany R, Schaffert S, et al Antigen recognition determinants of gammadelta T cell receptors Science 2005;308(5719):252-255 doi:10.1126/science.1106480 108 Sica A, Allavena P, Mantovani A Cancer related inflammation: the macrophage connection Cancer Lett 2008;267(2):204-215 doi:10.1016/j.canlet.2008.03.028 109 Sidorchuk A, Agardh EE, Aremu O, Hallqvist J, Allebeck P, Moradi T Socioeconomic differences in lung cancer incidence: a systematic review and meta-analysis Cancer Causes doi:10.1007/s10552-009-9300-8 86 Control CCC 2009;20(4):459-471 110 Siegel RL, Miller KD, Jemal A Cancer statistics, 2019 CA Cancer J Clin 2019;69(1):7-34 doi:10.3322/caac.21551 111 Silva-Santos B, Serre K, Norell H γδ T cells in cancer Nat Rev Immunol 2015;15(11):683-691 doi:10.1038/nri3904 112 Simoni D, Gebbia N, Invidiata FP, et al Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Novel Aminobisphosphonates Possessing an in Vivo Antitumor Activity Through a γδ-T Lymphocytes-Mediated Activation Mechanism J Med Chem 2008;51(21):6800-6807 doi:10.1021/jm801003y 113 Smyth MJ, Cretney E, Kelly JM, et al Activation of NK cell cytotoxicity Mol Immunol 2005;42(4):501-510 doi:10.1016/j.molimm.2004.07.034 114 Smyth MJ, Cretney E, Kershaw MH, Hayakawa Y Cytokines in cancer immunity and immunotherapy Immunol Rev 2004;202:275-293 doi:10.1111/j.0105-2896.2004.00199.x 115 So T, Takenoyama M, Mizukami M, et al Haplotype loss of HLA class I antigen as an escape mechanism from immune attack in lung cancer Cancer Res 2005;65(13):5945-5952 doi:10.1158/0008-5472.CAN-04-3787 116 Stankovic B, Bjørhovde HAK, Skarshaug R, et al Immune Cell Composition in Human Non-small Cell Lung Cancer Front Immunol 2018;9:3101 doi:10.3389/fimmu.2018.03101 117 Tan1 WK, Tay2 JC, Zeng3 J, et al Expansion of Gamma Delta T Cells - A Short Review on Bisphosphonate and K562-Based Methods 2018;2(3):6-12 118 Tanaka Y, Morita CT, Tanaka Y, Nieves E, Brenner MB, Bloom BR Natural and synthetic non-peptide antigens recognized by human gamma delta T cells Nature 1995;375(6527):155-158 doi:10.1038/375155a0 87 119 Tanaka Y, Murata-Hirai K, Iwasaki M, et al Expansion of human γδ T cells for adoptive immunotherapy using a bisphosphonate prodrug Cancer Sci 2018;109(3):587-599 doi:10.1111/cas.13491 120 Tang X, Varella-Garcia M, Xavier AC, et al Epidermal growth factor receptor abnormalities in the pathogenesis and progression of lung adenocarcinomas Cancer Prev Res Phila Pa 2008;1(3):192-200 doi:10.1158/1940-6207.CAPR-08-0032 121 Taylor R, Najafi F, Dobson A Meta-analysis of studies of passive smoking and lung cancer: effects of study type and continent Int J Epidemiol 2007;36(5):1048-1059 doi:10.1093/ije/dym158 122 Teschner D, Wenzel G, Distler E, et al In vitro stimulation and expansion of human tumour-reactive CD8+ cytotoxic T lymphocytes by anti- CD3/CD28/CD137 magnetic beads Scand J Immunol 2011;74(2):155-164 doi:10.1111/j.1365-3083.2011.02564.x 123 Thedrez A, Harly C, Morice A, Salot S, Bonneville M, Scotet E IL-21mediated potentiation of antitumor cytolytic and proinflammatory responses of human V gamma 9V delta T cells for adoptive immunotherapy J Immunol Baltim Md 1950 2009;182(6):3423-3431 doi:10.4049/jimmunol.0803068 124 Thompson KJ, Roelofs AAJ, Jauhiainen M, Mönkkönen H, Moenkkoenen J, Rogers MJ Activation of γδ T cells by bisphosphonates Adv Exp Med Biol 2009;658:11-20 doi:10.1007/978-1-4419-1050-9_2 125 Thun MJ, Carter BD, Feskanich D, et al 50-year trends in smoking-related mortality in the United States N Engl J Med 2013;368(4):351-364 doi:10.1056/NEJMsa1211127 126 Timmerman JM, Levy R Cancer vaccines: pessimism in check Nat Med 2004;10(12):1279; author reply 1279-1280 doi:10.1038/nm1204-1279a 88 127 Torre LA, Siegel RL, Jemal A Lung Cancer Statistics Adv Exp Med Biol 2016;893:1-19 doi:10.1007/978-3-319-24223-1_1 128 Truong T, Hung RJ, Amos CI, et al Replication of Lung Cancer Susceptibility Loci at Chromosomes 15q25, 5p15, and 6p21: A Pooled Analysis From the International Lung Cancer Consortium JNCI J Natl Cancer Inst 2010;102(13):959-971 doi:10.1093/jnci/djq178 129 Van Acker HH, Anguille S, Willemen Y, et al Interleukin-15 enhances the proliferation, stimulatory phenotype, and antitumor effector functions of human gamma delta T cells J Hematol OncolJ Hematol Oncol 2016;9(1):101 doi:10.1186/s13045-016-0329-3 130 Vesely MD, Kershaw MH, Schreiber RD, Smyth MJ Natural innate and adaptive immunity to cancer Annu Rev Immunol 2011;29:235-271 doi:10.1146/annurev-immunol-031210-101324 131 Viey E, Fromont G, Escudier B, et al Phosphostim-activated gamma delta T cells kill autologous metastatic renal cell carcinoma J Immunol Baltim Md 1950 2005;174(3):1338-1347 doi:10.4049/jimmunol.174.3.1338 132 Vinay DS, Ryan EP, Pawelec G, et al Immune evasion in cancer: Mechanistic basis and therapeutic strategies Semin Cancer Biol 2015;35 Suppl:S185-S198 doi:10.1016/j.semcancer.2015.03.004 133 Voskoboinik I, Smyth MJ, Trapani JA Perforin-mediated target-cell death and immune homeostasis Nat Rev Immunol 2006;6(12):940-952 doi:10.1038/nri1983 134 Waldmann TA The interleukin-2 receptor on normal and malignant lymphocytes Adv Exp Med Biol 1987;213:129-137 doi:10.1007/978-1-46845323-2_13 89 135 Weber CE, Kuo PC The tumor microenvironment Surg Oncol 2012;21(3):172-177 doi:10.1016/j.suronc.2011.09.001 136 Wei C, Wang W, Pang W, et al The CIK cells stimulated with combination of IL-2 and IL-15 provide an improved cytotoxic capacity against human lung adenocarcinoma Tumour Biol J Int Soc Oncodevelopmental Biol Med 2014;35(3):1997-2007 doi:10.1007/s13277-013-1265-2 137 Wilhelm M, Kunzmann V, Eckstein S, et al Gammadelta T cells for immune therapy of patients with lymphoid malignancies Blood 2003;102(1):200-206 doi:10.1182/blood-2002-12-3665 138 Winstone TA, Man SFP, Hull M, Montaner JS, Sin DD Epidemic of lung cancer in patients with HIV infection Chest 2013;143(2):305-314 doi:10.1378/chest.12-1699 139 Wrobel P, Shojaei H, Schittek B, et al Lysis of a broad range of epithelial tumour cells by human gamma delta T cells: involvement of NKG2D ligands and T-cell receptor- versus NKG2D-dependent recognition Scand J Immunol 2007;66(2-3):320-328 doi:10.1111/j.1365-3083.2007.01963.x 140 Xiao Y-F, Jie M-M, Li B-S, et al Peptide-Based Treatment: A Promising Cancer Therapy J Immunol Res 2015;2015:761820 doi:10.1155/2015/761820 141 Yang YJ, Park JC, Kim HK, Kang JH, Park SY A trial of autologous ex vivoexpanded NK cell-enriched lymphocytes with docetaxel in patients with advanced non-small cell lung cancer as second- or third-line treatment: phase IIa study Anticancer Res 2013;33(5):2115-2122 142 Yoshikawa T, Takahara M, Tomiyama M, Nieda M, Maekawa R, Nakatsura T Large-scale expansion of γδ T cells and peptide-specific cytotoxic T cells using zoledronate for adoptive immunotherapy Int J Oncol 2014;45(5):18471856 doi:10.3892/ijo.2014.2634 90 143 Zhang H, Chen J Current status and future directions of cancer immunotherapy J Cancer 2018;9(10):1773-1781 doi:10.7150/jca.24577 144 Zhang J, Yan Y, Yang Y, et al High Infiltration of Tumor-Associated Macrophages Influences Poor Prognosis in Human Gastric Cancer Patients, Associates With the Phenomenon of EMT Medicine (Baltimore) 2016;95(6):e2636 doi:10.1097/MD.0000000000002636 145 Zhao J, Zhao J, Perlman S Differential effects of IL-12 on Tregs and nonTreg T cells: roles of IFN-γ, IL-2 and IL-2R PloS One 2012;7(9):e46241 doi:10.1371/journal.pone.0046241 146 Zheng W, Blot WJ, Liao ML, et al Lung cancer and prior tuberculosis infection in Shanghai Br J Cancer 1987;56(4):501-504 doi:10.1038/bjc.1987.233 147 Zheng X, Hu Y, Yao C The paradoxical role of tumor-infiltrating immune cells in lung cancer Intractable Rare Dis Res 2017;6(4):234-241 doi:10.5582/irdr.2017.01059 148 Zhou L, Ivanov II, Spolski R, et al IL-6 programs T(H)-17 cell differentiation by promoting sequential engagement of the IL-21 and IL-23 pathways Nat Immunol 2007;8(9):967-974 doi:10.1038/ni1488 149 Zhou L, Lopes JE, Chong MMW, et al TGF-beta-induced Foxp3 inhibits T(H)17 cell differentiation by antagonizing RORgammat function Nature 2008;453(7192):236-240 doi:10.1038/nature06878 150 Zitvogel L, Apetoh L, Ghiringhelli F, André F, Tesniere A, Kroemer G The anticancer immune response: indispensable for therapeutic success? J Clin Invest 2008;118(6):1991-2001 doi:10.1172/JCI35180 91 ... thư phổi , với mục tiêu sau: Xây dựng quy trình phân lập ni cấy ho t hóa t bào γ T tách t bệnh nhân ung thư phổi Bước đầu đánh giá t nh đáp ứng miễn dịch t bào γ T tách t bệnh nhân ung thư phổi. .. để thực bước t m hiểu liệu pháp sử dụng t bào gamma delta T (γδ) điều trị ung thư phổi, tiến hành nghiên cứu “Ni cấy ho t hóa đánh giá t nh đáp ứng miễn dịch t bào γ T tách t bệnh nhân ung thư. .. chế tho t miễn dịch. T bào ung thư phổi giảm biểu phân t MHC-I trình ung thư ph t triển, điều chỉnh t nh nhạy cảm t bào ung thư với ly giải t bào T- CD8 NK [115] Thêm vào đó, t bào ung thư phổi