Nghiên cứu phân lập, chuyển hóa và đánh giá tác dụng sinh học của steroid từ loài sao biển acanthaster planci (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - ĐINH THỊ HÀ NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, CHUYỂN HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA STEROID TỪ LOÀI SAO BIỂN ACANTHASTER PLANCI Chuyên ngành: Hóa học Hợp chất thiên nhiên Mã số: 44 01 07 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HĨA HỌC Hà Nội-2020 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Cơng nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS TS Trần Thị Thu Thủy Người hướng dẫn khoa học 2: PGS TS Ngô Đại Quang Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … …., ngày … tháng … năm 2020 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Việt Nam có nguồn tài nguyên sinh vật biển vô đa dạng phong phú với hàng trăm ngàn loài thực vật, động vật vi sinh vật khác Tuy nhiên, giá trị cung cấp nguồn dược liệu cho y học dược học lồi sinh vật biển hạn chế Trong đó, có nghiên cứu hợp chất steroid phân cực từ sinh vật biển thể hoạt tính sinh học chống lại nhiều dòng tế bào ung thư, ứng dụng y, dược học Các hoạt chất góp phần quan trọng cho lĩnh vực tổng hợp hữu Chúng trở thành hình mẫu để tổng hợp từ steroid phổ biến tự nhiên phương pháp hiệu kinh tế Lớp Sao biển thuộc ngành Da gai nguồn cung cấp dồi hợp chất steroid phân cực Lớp chất có cấu trúc đa dạng chúng thể nhiều hoạt tính sinh học như: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, chống ung thư, chống virut, ức chế thụ tinh Steroid phân cực từ biển thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học giới Ở Việt Nam có cơng trình nghiên cứu lớp chất Các nghiên cứu theo hướng phân lập hợp chất từ tự nhiên đánh giá số hoạt tính sinh học chúng Hiện nay, chưa có cơng trình sâu vào nghiên cứu phân lập, chuyển hóa hóa học đánh giá hoạt tính steroid phân lập từ sinh vật biển Sao biển Acanthaster planci loài biển phổ biến vùng biển Việt Nam, chúng mối đe dọa với tồn vong rạn san hô sống nguồn thức ăn ưu thích chúng Các nghiên cứu bước đầu thành phần hóa học biển Acanthaster planci steroid, đặc biệt steroid phân cực Điều định hướng cho tác giả lựa chọn đề tài nghiên cứu luận án là: “Nghiên cứu phân lập, chuyển hóa đánh giá tác dụng sinh học steroid từ loài biển Acanthaster planci” Mục tiêu nghiên cứu luận án Nghiên cứu thành phần hóa học lồi biển Acanthaster planci Việt Nam, thực tổng hợp dẫn xuất steroid theo định hướng hydroxyl oxime hóa từ steroid phân lập từ loài biển đánh giá hoạt tính sinh học chúng Các nội dung nghiên cứu luận án Để đạt mục tiêu trên, luận án thực nội dung sau: • Phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất từ lồi biển Acanthaster planci, đặc biệt steroid • Chuyển hóa dẫn xuất theo định hướng hydroxyl hóa oxime hóa từ steroid có hàm lượng lớn biển Acanthaster planci • Thử nghiệm số hoạt tính sinh học chất phân lập tổng hợp CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Phần tập hợp nghiên cứu nước quốc tế vấn đề: 1.1 1.2 1.3 1.4 Giới thiệu chung lớp biển (Asteroidea) Các nghiên cứu lớp chất steroid phân cực từ biển Hoạt tính sinh học hợp chất steroid phân cực từ biển Tổng quan đối tượng nghiên cứu 1.5 Tình hình nghiên cứu tổng hợp hợp chất polyhydroxysteroid hydroximinosteroid từ steroid tự nhiên CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phần mô tả thông tin đối tượng nghiên cứu; phương pháp phân lập, xác định cấu trúc hợp chất phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học 2.1 Đối tượng nghiên cứu Loài biển Acanthaster planci thu thập độ sâu 5-10 m, Vịnh Vân Phong, Nha Trang, Khánh Hòa, Việt Nam Tên lồi giám định PGS.TS Đỗ Công Thung, Viện Tài nguyên Môi trường biển – Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Mặt phía Mặt phía 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân lập Các phương pháp sắc ký sử dụng để phân lập hợp chất bao gồm: sắc ký mỏng (TLC), sắc ký cột silica gel (CC) pha thường pha đảo, sắc ký cột Polychrome 1, Sephadex LH-20, sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), dùng phương pháp kết tinh 2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc Các phương pháp sử dụng để xác định cấu trúc hóa học hợp chất bao gồm: phổ khối ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR ESI-MS), độ quay cực ([α]D), phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1H, 13C, DEPT, 1D TOCSY) hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY, ROESY) ghi máy Bruker Avance 500 MHz Bruker Avance III 700 MHz, sử dụng TMS chất chuẩn nội 2.2.3 Các phương pháp đánh giá hoạt tính 2.2.3.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào Hoạt tính gây độc tế bào hợp chất đánh giá theo phương pháp MTS thực tại: Viện hóa học hợp chất thiên nhiên – Viện HLKHCNVN (Hep G2, HeLa); Trung tâm nghiên cứu Hợp chất tự nhiên Viện Khoa học Công nghệ Hàn Quốc (KIST) (T98G); Viện Hóa sinh hữu Thái Bình Dương (PIBOC) – Viện Hàn lâm Khoa học liên bang Nga – Vladivostok (HCT-116, HT-29, RPMI-7951, T-47D, MDA-MB-231) 2.2.3.2 Phương pháp thử nghiệm khả ức chế hình thành khối u thạch mềm Các chất thử nghiệm thêm vào môi trường nuôi tế bào nồng độ không gây độc 5, 10 15 μM, ủ tuần Các khối u hình thành đo kính hiển vi phần mềm ảnh theo phương pháp Colburn Thực PIBOC – Viện Hàn lâm Khoa học LB Nga 2.2.3.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính ức chế di tế bào ung thư biểu mô tuyến vú xét nghiệm chữa lành vết thương (wound-healing assay) Các chất thử nghiệm (10 μM) đưa vào môi trường tạo vết thương khối tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MDA-MB-231 phát triển để 48 Độ đóng vùng tổn thương đo xác định phần trăm khoảng cách di chuyển tế bào Thực PIBOC – Viện Hàn lâm Khoa học LB Nga CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 3.1 Phân lập hợp chất từ loài biển Acanthaster planci Phần trình bày cách thức phân lập hợp chất từ mẫu biển A planci Việc phân tách hợp chất nêu tóm tắt sơ đồ hình 3.1 Hình 3.1 Sơ đồ phân lập hợp chất từ biển A.planci 3.2 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập 3.3 Tổng hợp dẫn xuất cholesterol Hợp chất AP7 xác định cholesterol, lựa chọn chất đầu để chuyển hóa thành dẫn xuất polyhydroxysteroid hydroximinosteroid 3.3.1 Tổng hợp dẫn xuất polyhydroxyl cholesterol 3.3.2 Tổng hợp dẫn xuất hydroximinosteroid từ cholesterol 3.4 Hoạt tính sinh học chất phân lập dẫn xuất tổng hợp 3.4.1 Hoạt tính sinh học hợp chất steroid phân cực phân lập từ biển Acanthaster planci 3.4.2 Hoạt tính gây độc tế bào dẫn xuất tổng hợp từ cholesterol Các hydroxysteroid (15c-21c), hydroximinosteroid (23c, 25c, 29c, 31c) chất trung gian (22c, 24c, 26c-28c, 30c) đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ba dòng tế bào Hep G2, HeLa T98G CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chương trình bày kết nghiên cứu phân lập, chuyển hóa xác định cấu trúc hợp chất, kết hoạt tính sinh học hợp chất thử nghiệm 4.1 Nghiên cứu thành phần hóa học lồi biển Acanthaster planci Phần trình bày chi tiết kết phân tích phổ xác định cấu trúc hóa học 14 hợp chất phân lập từ loài biển A.planci Trong có hợp chất hợp chất biết Bảng 4.21: Bảng tổng hợp chất phân lập từ biển A planci AP2 Planciside B (chất mới) AP1 Planciside A (chất mới) AP4 Planciside D AP3 Planciside C (chất mới) AP5 3-O-sulfothornasterol A AP6 5-ergost-7-en-3-ol AP7 Cholesterol AP8 Astaxanthin AP9 Thymin AP10 Uracil AP11 Acanthasglycoside G (chất mới) AP12 Pentareguloside G AP13 Acanthasglycoside A AP14 Maculoside * Dưới trình bày phân tích phổ xác định cấu trúc hóa học steroid glycoside đại diện Acanthaglycoside G (AP11): • Hợp chất AP11: Acanthaglycoside G (hợp chất mới) Hợp chất AP11 phân lập dạng chất rắn, vơ định hình Cơng thức phân tử AP11 xác định C51H81O26SNa (M = 1164) từ pic ion giả phân tử [M+Na]+ m/z 1187,4533 (tính tốn lý thuyết cho CTPT C51H81Na2O26S = 1187,4532) phổ (+) HR-ESI-MS pic ion giả phân tử [M–Na]− m/z 1141,4735 (tính tốn lý thuyết cho CTPT C51H81O26S = 1141,4737) phổ (-) HR-ESI-MS, M khối lượng phân tử AP11 Ngoài ra, phổ (–) HR-ESI-MS/MS pic ion [M–Na]− m/z 1141 xuất tín hiệu pic ion m/z 995 [(M–Na)–C6H10O4]−, 849 [(M–Na)–2xC6H10O4]−, 703 [(M–Na)–3xC6H10O4]−, 557 [(M–Na)– 4xC6H10O4]−, 411 [(M–Na)–5xC6H10O4]−, tương ứng với tín hiệu 1, 2, 3, 4, đơn vị đường 6-deoxyhexose, pic ion m/z 393 [(M–Na)–4 x C6H10O4 –C6H12O5]− tương ứng với chuỗi oligosaccharide AP11 Từ liệu phân tích phổ MS dự đốn AP11 có chứa đơn vị đường 6-deoxyhexose chuỗi carbohydrate Intens x105 3+ 1187.4533 +MS, 0.8-1.4min #44-83 11141.4735 -MS, 1.3-1.8min #76-100 1+ 437.1941 2+ 605.2223 2 1+ 526.3922 Intens x106 2570.2335 1163.4545 1+ 1269.4566 497.2043 774.6342 977.4046 424.1754 1367.4546 849.3573 1127.4573 995.4151 0 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 m/z Hình 4.21: Phổ (+) HR-ESI-MS AP11 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 Hình 4.22: Phổ (-) HR-ESI-MS AP11 Phổ 1H-NMR AP11 xuất tín hiệu nhóm –CH3 đặc trưng khung steroid bao gồm nhóm methyl góc CH3-18 (s, 0,58 ppm) CH3-19 (s, 0,94 ppm); tín hiệu vùng trường yếu CH3-21 (s, 2,08 ppm) Ngồi có tín hiệu proton olefin δH m/z 5,24 (brt, J 4,2 Hz); nhóm oxymetin liên kết với nhóm sulfate δH 4,87 (m) ppm; nhóm oxymetin liên kết trực tiếp với chuỗi carbohydrate vị trí CH-6 với δH 3,78 (m) Ở vùng trường yếu quan sát thấy tín hiệu doublet proton anome đơn vị monosaccharide δH 4,82 (1H, d, J = 7,6 Hz), 4,84 (1H, d, J = 7,9 Hz), 4,97 (1H, d, J = 6,8 Hz), 5,03 (1H, d, J = 7,7 Hz), 5,27 (1H, d, J = 7,7 Hz) Hình 4.23: Phổ 1H-NMR AP11 Hình 4.24: Phổ 13C-NMR AP11 Phổ 13C-NMR AP11 cho thấy có mặt 51 nguyên tử carbon, có nhóm CH3, nhóm CH2, 32 nhóm CH carbon bậc Sự có mặt nối đôi bị ba lần phân tử xác định δC 116,4/145,8 ppm tín hiệu carbon nhóm CH δC 102,3; 103,6; 104,9; 104,9; 106,9 ppm xác định carbon anome gốc đường Ngoài ra, vùng từ 60 – 90 ppm có tín hiệu cộng hưởng 23 ngun tử carbon liên kết trực tiếp với nguyên tử oxy, bao gồm 22 carbon oximetin có carbon phần aglycon δC 77,4 (C-3) liên kết với nhóm sulfate; δC 80,1 (C-6) liên kết với chuỗi carbohydrate; 20 carbon thuộc phân tử đường δC 73,8; 91,0; 74,4; 71,7; 82,3; 75,1; 85,7; 71,4; 84,3; 77,5; 75,7; 72,8; 73,7; 74,9; 72,3; 71,8; 76,2; 77,5; 75,5; 73,4 ppm; carbon bậc nhóm C=O δC 208,0 ppm Độ chuyển dịch hóa học phổ 1H 13C phần aglycon AP11 có dạng biết 3β,6α-dihydroxy-5α-pregn-9(11)-en-20- tương tác phổ HMBC Từ tương tác chìa khóa H-1 Quip1 H-6 (C-6) aglycon, H-1 Quip2 H-3 (C-3) Quip1, H-1 Quip3 H-4 (C-4) Quip2, H-1 Fucp H-2 (C-2) Quip3, H-1 Quip4 H-2 (C-2) Quip2 suy vị trí liên kết phân tử đường với phần đường với phần aglycon hợp chất steroid Fuc(1→2)-Qui3(1→4)-[Qui4(1→2)]Qui2(1→3)-Qui1-Aglycon Dựa vào tín hiệu phổ 1D-, 2D-NMR ta xác định giá trị carbon proton phần đường (bảng 4.9) Hình 4.26: Cấu trúc hóa học AP11 Hình 4.27: Các tương tác phổ HMBC ROESY AP11 Cấu hình đơn vị đường AP11 chứng minh phương pháp Leontein cs, kết phân tích phổ GC thu chứng minh đơn vị đường AP11 có cấu hình D Từ kết phân tích liệu phổ AP11 xác định là: muối natri 6α-O-{β-D-fucopyranosyl-(1→2)-β-D-quinovopyranosyl-(1→4)-[β-Dquinovo-pyranosyl-(1→2)]-β-D-quinovopyranosyl-(1→3)-β-D-quinovo10 pyranosyl}-6α-hydroxy-5α-pregn-9(11)-en-20-one-3β-yl sulfate Đây asterosaponin với chuỗi carbohydrate gồm hai dạng đơn vị đường β-D-fucopyranosyl β-D-quinovopyranosyl Như vậy, AP11 chất lần phân lập từ tự nhiên đặt tên acanthaglycoside G Bảng 4.8: Dữ liệu phổ phần aglycon hợp chất AP11 Cac Hab (JHz) 35,8 63,2 12,9 1,63 m 1,38 m 2,81 (brd, J 13,6 Hz) 1,89 (brq, J 12,5 Hz) 4,87 m 3,45 (brd, J 12,6Hz) 1,70 m 1,48 m 3,78 m 2,66 m 1,28 m 2,06 m ‒ ‒ 5,24 (brt, J 4,2 Hz) 2,14 brs ‒ 1,33 m 1,76 m 1,20 m 2,34 (brq, J 10,9 Hz) 1,61 m 2,51 (t, J 8,7 Hz) 0,58 s 19 19,0 0,94 s 20 21 208,0 30,8 ‒ 2,08 s C 1β 1α 2α 2β 4α 4β 7β 7α 10 11 12 13 14 15α 15β 16β 16α 17 18 a 29,3 77,4 30,6 49,1 80,1 41,3 35,4 146,0 35,8 115,8 40,4 42,3 53,5 25,3 23,0 ROESY (H→H) H-11, H3-19 H-3, H-11 HMBC (H→C) H3-19 H-1, H-5 H3-19 H-3, H-7 H3-19 H-5 H3-18, H3-19 H-1 H-14, H-17 H-12, H-17 H3-18 H3-18 H-12, H-14, H3-21 H-8, H-15, H-16 H-1, H-2, H-4, H-6, H-8 H-17 C5D5N, b 500,13 MHz, c 125,75 MHz 11 C-13, C-18 C-12, C-13, C-14, C-17 C-1, C-5, C-9, C-10 C-17, C-20 Bảng 4.9: Dữ liệu phổ NMR chuỗi đường hợp chất AP11 δCac δHab (JHz) 104,9 4,82 (d, J 7,6 Hz) Qui 73,8d 91,0 74,4 71,7d 18,2 3,97 (t, J 8,3 Hz) 3,77 (t, J 8,6 Hz) 3,55 (t, J 9,0 Hz) 3,69 m 1,60 (d, J 6,0 Hz) 103.6 4,97 (d, J 6,8 Hz) Qui 82.3 75.1 85.7 71.4 18,0 4,09 (t, J 7,6 Hz) 4,12 (t, J 8,7 Hz) 3,56 (t, J 8,7 Hz) 3,90 m 1,73 (d, J 6,1 Hz) 102,3 4,84 (d, J 7,9 Hz) 84,3 Fuc 74,9 Qui C Qui 1 ROESY H-6 of aglycon; H-3, H-5 Qui1 H-1 Qui1, H-1 Qui2 H-6 Qui1 H-1 Qui1 H-4 Qui1 HMBC (H→C) C-6 of aglycon C-1, C-3 Qui1 C-1 Qui C-3, C-6 Qui1 C-4, C-5 Qui1 H-3, H-5 Qui2; H-3 Qui1 H-1 Qui4 H-1 Qui2 H-6 Qui2, H-1 Qui3 H-1 Qui2 H-4 Qui2, H-1 Qui3 C-3 Qui1 C-4 Qui2 4,00 (t, J 8,3 Hz) H-3, H-5 Qui3; H-4, H6 Qui2 H-1 Fuc 77,5 75,7 72,8 17,7d 4,13 (t, J 9,3 Hz) 3,62 (t, J 8,9 Hz) 3,71 m 1,48 (d, J 6,0 Hz) H-1, H-5 Qui3 H-6 Qui3 H-1, H-3 Qui3 H-4 Qui3 106,9 73,7d H-3, H-5 Fuc; H-2 Qui3 72,3 71,8d 16,9 5,03 (d, J 7,7 Hz) 4,41 (dd, J 8,6; 9,5 Hz) 4,06 (dd, J 3,6; 9,5 Hz) 3,99 (d, J 4,0 Hz) 3,78 (q, J 6,5 Hz) 1,49 (d, J 6,2 Hz) H-5, H-6 Fuc H-3, H-4 Fuc H-4 Fuc C-3 Fuc C-1, C-4 Fuc C-4, C-5 Fuc 104,9 5,27 (d, J 7,7 Hz) H-3, H-5 Qui4; H-2 Qui2 C-2 Qui2 76,2 4,04 (t, J 8,8 Hz) C-2 Qui2 C-3 Qui2 C-4, C-5 Qui2 C-3 Qui3, C-1 Fuc C-2, C-4 Qui3 C-5, C-6 Qui3 C-3 Qui3 C-4, C-5 Qui3 C-2 Qui3 C-1, C-3 Fuc H-1, H-5 Fuc 12 a 77,5 75,5 73,4 17,8d 4,12 (t, J 8,8 Hz) 4,01 (t, J 8,7 Hz) 3,70 m 1,79 (d, J 6,1 Hz) H-1 Qui4 H-6 Qui4 H-1 Qui4 H-4 Qui4 C-4, C-5 Qui C5D5N, 500,13 MHz, 125,75 MHz, vị trí hốn đổi cho b c d 4.2 Chuyển hóa hóa học cholesterol Các hợp chất polyhydroxysteroid, hydroximinosteroid có mạch nhánh giống cholesterol đánh giá hợp chất tiềm có hoạt tính gây độc nhiều dòng tế bào ung thư Vì vậy, cholesterol (hợp chất AP7) lựa chọn làm nguyên liệu đầu cho phản ứng chuyển hóa tạo sản phẩm hydroxyl oxime hóa 4.2.1 Chuyển hóa dẫn xuất polyhydroxysteroid Cholesterol hydroxyl hóa để tạo nhiều nhóm OH xung quanh vị trí nối đơi C5/C6 Các tác nhân hydroxyl hóa sử dụng chủ yếu tác nhân oxy hóa có khả tạo sản phẩm dạng diol Bảy hợp chất polyhydroxysteroid (15c-21c) tổng hợp từ cholesterol theo sơ đồ 4.1 Sơ đồ 4.1 Tổng hợp dẫn xuất polyhydroxysteroid từ cholesterol 13 Tác nhân điều kiện phản ứng: (i): BH3.THF, H2O2, NaOH, oC, (15c: 71%, 16c: 9%); (ii): SeO2, dioxane, H2O, 80 oC, 80 (17c: 50%, 18c: 2,0%, 19c: 3,5%); (iii): 4% OsO4/H2O, NMO, đun hồi lưu, 48 (20c: 74%); (iv): HCOOH 88%, THF/H2O2, 12 giờ, KOH 3% MeOH (21c: 75%) Các hợp chất tổng hợp chất mới, nhiên nội dung nghiên cứu nêu phương pháp tổng hợp đơn giản hiệu so với phương pháp biết cho chất có hoạt tính qua bước phản ứng Các phương pháp đồng thời áp dụng hợp chất steroid khác từ biển để tổng hợp dẫn xuất polyhydroxysteroid 4.2.2 Chuyển hóa dẫn xuất hydroximinosteroid Các nghiên cứu gần mối liên hệ hoạt tính - cấu trúc hợp chất hydroximinosteroid cho thấy lớp chất tiềm thể nhiều hoạt tính sinh học lý thú Đồng thời, nghiên cứu vị trí nhóm oxime loại mạch nhánh vị trí C-17 khung steroid giống cholestane có hoạt tính tốt so với loại mạch nhánh khác stigmastane hay sitostane Vì vậy, cholesterol lựa chọn làm nguyên liệu đầu để tổng hợp dẫn xuất hydroximinosteroid Các sản phẩm tổng hợp có nhóm oxime vị trí C-3; C-3 C-6; vòng epoxy vị trí C-4,5 Bốn hydroximinosteroid (23c, 25c, 29c, 31c) có chất (29c, 30c) chất trung gian (15c, 22c, 24c, 26c, 27c, 28c, 30c) có chất (30c) tổng hợp theo sơ đồ 4.2 Từ cholesterol thực chuyển hóa theo hướng khác để tạo dẫn xuất trung gian có nhóm ketone (C=O) vị trí C-3 C-6; vị trí C-4,5 có liên kết đơi (22c), khơng có liên kết đơi (24c) có vòng epoxy (27c) Cuối sản phẩm ketone chuyển hóa thành hydroximinosteroid (>C=N-OH) tương ứng (23c, 25c, 29c, 31c) tác nhân hydroxylamine hydrochloride (NH2OH.HCl) pyridine theo phương pháp mô tả Javier Đặc biệt, thực oxime hóa chất 27c (có vòng epoxy vị trí C-4,5 nhóm ketone vị trí 14 C-3) thu sản phẩm có sản phẩm bị oxime hóa (29c) sản phẩm khơng bị oxime hóa bị mở vòng epoxy vị trí C4,5 (30c) Sơ đồ 4.2 Tổng hợp dẫn xuất hydroximinosteroid từ cholesterol Tác nhân điều kiện phản ứng: (i): PCC/CH2Cl2, rt, 48 (22c: 80,0 %, 24c: 82,0 %); (ii): BH3.THF/H2O2, NaOH, oC, (15c: 80,0 %); (iii): CeCl3.7H2O/NaBH4, CH2Cl2&MeOH (1:1), rt, (26c: 89,0 %); (iv): mCPBA/CH2Cl2, Dess-Martin/CH2Cl2, oC (27c: 12,3 %, 28c: 14,5 %); (v): NH2OH.HCl/Pyridine, 24 (23c: 85,0 %, 25c: 81,0 %, 29c: 19,3 %, 30c: 13,4 %, 31c: 22,5 %) Các sản phẩm chứng minh oxime hóa thành cơng có thay đổi rõ ràng chuyển dịch hóa học nhóm cacbonyl khoảng δC 195-210 ppm thành nhóm oxime δC 155-160 ppm Kết hợp phương pháp hóa lý đại phương phổ cộng hưởng từ hạt nhân cấu trúc hóa học tất sản phẩm chứng minh 4.3 Kết thử nghiệm hoạt tính sinh học 15 4.3.1 Hoạt tính hợp chất steroid glycoside phân lập từ biển Acanthaster planci a Hoạt tính sinh học hợp chất polyhydroxysteroid glycoside Hợp chất AP1 thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ba dòng tế bào HCT-116, T-47D RPMI-7951 Kết hợp chất AP1 có khả gây độc tế bào dòng tế bào HCT-116 RPMI-7951 với giá trị IC50 tương ứng 36 58 µM, so với đối chứng dương cisplatin Cả AP1 cisplatin không gây độc dòng tế bào T-47D (bảng 4.23) Bảng 4.23: Hoạt tính gây độc tế bào in vitro hợp chất AP1 Dòng tế bào (IC50 µM) AP1 Cisplatin HCT-116 36 75 T-47D >150 > 150 RPMI-7951 58 43 A B Control AP1, 15 μM C Cisplatin, 15 μM Hình 4.54: Ảnh hưởng AP1 đến tăng sinh dòng tế bào HCT-116, T-47D RPMI-7951 nồng độ 15 μM Chất AP1 ức chế tăng sinh dòng tế bào T-47D sau 72 35%, dòng tế bào RPMI-7951 sau 48 27% (hình 4.54 B, C) Trong cisplatin gần ức chế hoàn tồn phát triển dòng tế bào T-47D RPMI-7951 (hình 4.54 B, C) b Hoạt tính sinh học hợp chất asterosaponin 16 Hợp chất AP13 AP14 có khả gây độc tế bào ung thư trực tràng HT-29; tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MDA-MB-231, không gây độc tế bào ung thư sắc tố ác tính RPMI-7951 nồng độ 150 µM Giá trị nồng độ IC50 với dòng tế bào xem bảng 4.24 Hợp chất AP13 AP14 ức chế hiệu hình thành khối u dòng tế bào HT-29 dòng tế bào MDA-MB-231, hiệu với dòng tế bào RPMI-7951 Giá trị IF50 tương ứng với dòng tế bào xem bảng 4.24 Bảng 4.24: Hoạt tính gây độc tế bào ảnh hưởng tới hình thành khối u thạch mềm hợp chất asterosaponin AP11-AP14 Chất AP11 AP12 AP13 AP14 RPMI-7951 IC50, µM IF50, µM >150 >15 >150 >15 >150 15 >150 14 HT-29 IC50, µM IF50, µM >150 >15 >150 >15 109 11 90 MDA-MB-231 IC50, µM IF50, µM >150 >15 >150 >15 30 13 24 IC50: Nồng độ gây giảm 50% khả sống sót tế bào IF50: Nồng độ gây giảm 50% hình thành khối tế bào tế bào Hình 4.55: Ảnh hưởng asterosaponin AP11-AP14 đến di chuyển tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MDA-MB-231 người Hợp chất AP13 AP14 nồng độ 10 µM ngăn chặn di chuyển tế bào MDA-MB-231 với tỷ lệ tương ứng 26% 45% so với đối chứng sau 48 ủ tế bào (hình 4.55) Trong khi, hợp chất AP11 AP12 ngăn chặn di chuyển tế bào 4.3.2 Hoạt tính sinh học dẫn xuất cholesterol 17 a hoạt tính sinh học dẫn xuất polyhydroxysteroid Ba chất 16c, 18c, 21c thể hoạt tính gây độc tế bào Hep G2 với giá trị IC50 tương ứng 11,69; 11,89 6,87 μM Chỉ có chất 21c thể hoạt tính gây độc tế bào T98G với IC50 = 2,28 μM, so với đối chứng dương Paclitaxel (xem bảng 4.25) Hai cặp chất 15c 16c; 20c 21c khác cấu hình nhóm OH vị trí C-6 (6α-OH chất 15c 20c; 6β-OH chất 16c 21c) Trong chất 16c có hoạt tính gây độc dòng tế bào Hep G2 chất 21c có hoạt tính gây độc hai dòng tế bào Hep G2 T98G chất 15c 20c lại khơng thể hoạt tính phép thử Như vậy, cấu hình β nhóm OH C-6 dạng cấu trúc yếu tố định hoạt tính gây độc tế bào chúng Bảng 4.25: Hoạt tính gây độc tế bào Hep G2, T98G chất 15c-21c Chất 15c 16c 17c 18c IC50 µM Hep G2 T98G >100 >100 11,59 >100 >100 >100 11,89 >100 Chất 19c 20c 21c Paclitaxela IC50 µM Hep G2 T98G >100 >100 >100 >100 6,87 2,28 0,040 0,023 đối chứng dương b Hoạt tính sinh học dẫn xuất hydroximinosteroid chất trung gian Ba dẫn xuất 3,6-dihydroximino (23c, 25c, 31c) có hoạt tính gây độc tế bào mạnh so với 3-hydroximino-6α-hydroxy (29c) dòng tế bào thử nghiệm Chất 3,6-dihydroximino 25c khơng có liên kết đơi vị trí C4/5 ngun nhân gây hoạt tính gây độc dòng tế bào Hep G2 HeLa so với chất Δ4-3,6-dihydroximino 23c Trong chất 31c có nhóm oxime vị trí C-3, C-6 vòng epoxy vị trí C-4,5 có hoạt tính gây độc tế bào chọn lọc dòng tế bào T98G (IC50 = 2,9 μM) chất 29c có nhóm oxime vị trí C-3 vòng epoxy vị trí C-4/5 khơng có hoạt tính a 18 Bảng 4.26: Hoạt tính gây độc tế bào Hep G2, HeLa, T98G chất 22c-31c Chất 22c 23c 24c 25c 26c Paclitaxel a IC50 (µM) HepG2 HeLa >100 >100 42,4 68,6 >100 >100 >100 >100 >100 >100 0,040 0,031 Chất T98G >100 70,3 >100 69,8 >100 0,023 27c 28c 29c 30c 31c Paclitaxela IC50 (µM) HepG2 HeLa 41,8 72,4 >100 74,6 >100 >100 >100 >100 >100 >100 0,040 0,031 T98G >100 >100 >100 18,5 2,9 0,023 đối chứng dương Ba chất trung gian (27c, 28c, 30c) có xuất nguyên tố oxy C-4 C-5 có hoạt tính gây độc vừa phải dòng tế bào chất lại khơng thể hoạt tính Như vậy, steroid dạng có liên kết đơi vị trí C4/5 có liên kết với nguyên tố oxy vị trí C-4, C-5 có tác dụng tích cực hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư thử nghiệm KẾT LUẬN Đã phân lập 14 hợp chất từ loài biển Acanthaster planci Cấu trúc hợp chất xác định phương pháp phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân phương pháp hóa lý khác Các hợp chất phân lập xác định cấu trúc bao gồm: planciside A (AP1); planciside B (AP2); planciside C (AP3); planciside D (AP4); (3-Osulfothornasterol A (AP5); 5-ergost-7-en-3-ol (AP6); cholesterol (AP7); astaxanthin (AP8); thymin (AP9); uracil (AP10); acanthaglycoside G (AP11); pentareguloside G (AP12); acanthaglycoside A (AP13); maculoside (AP14) Trong có hợp chất steroid glycoside AP1, AP2, AP3 AP11 chất Ngoài ra, hợp chất pentareguloside G (AP12) lần tìm thấy loài Acanthaster planci Việt Nam Từ cholesterol tổng hợp 17 dẫn xuất, có dẫn xuất polyhydroxysteroid (15c-21c), dẫn xuất hydroximinosteroid (23c, 25c, 29c, 19 31c) dẫn xuất trung gian (22c, 24c, 26c, 27c, 28c, 30c) Các hợp chất bao gồm: cholestane-3β,6α-diol (15c); cholestane-3β,6β-diol (16c); cholestan-5ene-3β,4β-diol (17c); cholestan-5-ene-3β,7β-diol (18c); cholestan-5-ene3β,4β,7β-triol (19c); cholestane-3β,5α,6α-triol (20c); cholestane-3β,5α,6β-triol (21c); cholest-4-ene-3,6-dione (22c); (3E,6E)-dihydroximinocholest-4-ene (23c); cholestane-3,6-dione (24c); (3E,6E)-dihydroximinocholestane (25c); cholest-4-ene-3β,6α-diol (26c); 6-hydroxy-4,5-epoxycholestane-3-one (27c); 4α,5α-epoxycholestane-3,6-dione (28c); 4α,5α-epoxy-6-hydroxycholestane-3oxime (29c); 4α,5α,6α-trihydroxy-cholestane-3-one (30c); 4α,5αepoxycholestane-3,6-dioxime (31c) Trong 29c, 30c, 31c chất Đã khảo sát hoạt tính gây độc tế bào đánh giá ảnh hưởng hợp chất AP1, AP11, AP12, AP13, AP14 đến hình thành khối u thạch mềm dòng tế bào ung thư người Kết cho thấy: - Hợp chất AP1 có hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư ruột kết (HCT-116) ung thư sắc tố ác tính (RPMI-7951) với giá trị IC50 tương ứng 36 µM 58 µM Hợp chất AP1 có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào HCT-116, T-47D RPMI-7951 ảnh hưởng đến hình thành khối tế bào dòng tế bào - Hợp chất AP13 AP14 có hoạt tính gây độc nhẹ dòng tế bào ung thư đại trực tràng HT-29 với giá trị IC50 tương ứng 109 µM 90 µM; dòng tế bào ung thư biểu mơ tuyến vú MDA-MB-231 với giá trị IC50 tương ứng 30 µM 24 µM Hợp chất AP13 AP14 ức chế hiệu hình thành khối u thạch mềm hai dòng tế bào HT-29 (với giá trị IF50 tương ứng 11 µM µM) MDA-MB-231 (với giá trị IF50 tương ứng 13 µM µM); hiệu dòng RPMI-7951 (với giá trị IF50 tương ứng 15 µM 14 µM) Đã khảo sát khả ức chế di tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MDA-MB-231 phương pháp đánh giá khả chữa lành vết thương ống nghiệm hợp chất asterosaponin (AP11-AP14) Kết 20 cho thấy: hợp chất AP13 AP14 nồng độ 10 µM ngăn chặn di chuyển tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MDA-MB-231 với tỷ lệ tương ứng 26% 45% so với đối chứng sau 48 ủ tế bào Đã khảo sát hoạt tính gây độc tế bào 07 dẫn xuất polyhydroxysteroid (15c-21c), 04 dẫn xuất hydroximinosteroid (23c, 25c, 29c, 31c) 06 dẫn xuất trung gian chúng (22c, 24c, 26c, 27c, 28c, 30c) tổng hợp từ cholesterol dòng tế bào ung thư gan (Hep G2), ung thư cổ tử cung (Hela) ung thư não (T98G) Kết cho thấy: - Năm hợp chất (16c, 18c, 21c, 23c, 27c) có hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư gan (Hep G2) với giá trị IC50 tương ứng 11,59; 11,89; 6,87; 42,40; 41,80 µM - Ba hợp chất (23c, 27c, 28c) có hoạt tính yếu gây độc tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa) với giá trị IC50 tương ứng 68,6; 72,4 74,6 µM - Năm hợp chất (21c, 23c, 25c, 30c, 31c) có hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư não (T98G) với giá trị IC50 tương ứng 2,28; 70,3; 69,8; 18,5 2,9 µM Trong chất 21c 31c hai chất có tiềm để nghiên cứu đánh giá sâu hoạt tính gây độc tế bào ung thư não KIẾN NGHỊ Đối với loài biển A.planci: cần có nghiên cứu sâu thành phần hóa học, đặc biệt lớp chất polyhydroxysteroid glycoside để từ phát triển sản phẩm nâng cao sức khỏe, phòng ngừa hỗ trợ điều trị bệnh ung thư, viêm nhiễm… Tiếp tục mở rộng hướng chuyển hóa thử nghiệm hoạt tính dẫn xuất cholesterol số dòng tế bào ung thư khác 21 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Từ loài biển Acanthaster planci thu thập từ vùng biển Việt Nam phân lập 14 hợp chất Trong đó, bốn hợp chất steroid glycoside hợp chất lần phân lập từ tự nhiên, bao gồm hợp chất polyhydroxysteroid glycoside planciside A (AP1); planciside B (AP2); planciside C (AP3) hợp chất asterosaponin acanthaglycoside G (AP11) Cholesterol phân lập từ biển Acanthaster planci sử dụng làm nguyên liệu đầu chuyển hóa 17 dẫn xuất, bao gồm 07 dẫn xuất polyhydroxysteroid, 04 dẫn xuất hydroxyminosteroid, 06 dẫn xuất trung gian Các hợp chất polyhydroxysteroid tổng hợp phương pháp ngắn gọn hiệu với bước phản ứng Bốn dẫn xuất hydroxyminosteroid với nhóm oxime vị trí C-3, C-6 có liên kết đơi vị trí C4/5 có liên kết với nguyên tố oxy vị trí C-4, C-5 tổng hợp thơng qua dẫn xuất trung gian Trong số dẫn xuất tổng hợp có dẫn xuất 4α,5α-epoxy-6-hydroxycholestane-3-oxime (29c); 4α,5α,6α-trihydroxy-cholestane-3-one (30c); 4α,5α-epoxycholestane-3,6dioxime (31c) lần tổng hợp Hoạt tính gây độc tế bào hoạt tính ức chế hình thành khối u thạch mềm chống lại 05 dòng tế bào ung thư (HCT-116, HT-29, RPMI-7951, MDA-MB-231) hợp chất steroid glycoside phân lập được đánh giá Hợp chất AP1 gây độc vừa phải hai dòng tế bào HCT-116 RPMI-7951 với giá trị IC50 tương ứng 36 58 µM Hợp chất AP13 AP14 gây độc vừa phải dòng tế bào RPMI-7951, HT-29, MDA-MB231 với giá trị IC50 nằm dải từ 24 đến 109 µM Hai hợp chất AP13 AP14 có khả ức chế di tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MDA-MB-231 với tỷ lệ 26% 45% 22 Các kết liên quan đến hợp chất asterosaponin phân lập phù hợp với giả thuyết chuỗi bên ngắn hợp chất steroid có ảnh hưởng đến hoạt tính gây độc tế bào asterosaponin Các dẫn xuất tổng hợp từ cholesterol đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 03 dòng tế bào ung thư người (HepG2, HeLa, T98G) Các hợp chất 16c, 18c, 21c, 23c, 25c, 27c, 28c, 30c 31c thể khả gây độc tế bào dòng tế bào thử nghiệm Đặc biệt, hai hợp chất 21c 31c thể hoạt tính tốt chọn lọc dòng tế bào ung thư não T98G với giá trị IC50 tương ứng 2,28 2,9 µM CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN Dinh T Ha, A.A Kicha, A.I Kalinovsky, T.V Malyarenko, R.S Popov, O.S Malyarenko, S.P Ermakova, T.T.T Thuy, P.Q Long, and N.V Ivanchina Asterosaponins from the tropical starfish Acanthaster planci and their cytotoxic and anticancer activities in vitro Natural Product Research, 2019, 1-8 (SCI-E) A.A Kicha, Thi H Dinh, N.V Ivanchina, T.V Malyarenko, A.I Kalinovsky, R.S Popov, S.P Ermakova, T.T.T Tran, and L.P Doan Three new steroid biglycosides, Plancisides A, B, and C, from the starfish Acanthaster planci Nat Pro Commun., 2014, Vol 9, No.9, 1269-1274 (SCI-E) Bằng sáng chế: Hợp chất (24S)-28-O-[beta-D-galactofuranosyl-(1→5)alpha-L-arabinofuranosyl]-24-methyl-5alpha-cholestane-3beta, 4beta, 6alpha, 8, 15beta, 16beta, 28-heptol phương pháp phân lập hợp chất từ loài biển Acanthaster planci Đoàn Lan Phương, Trần Thị Thu Thủy, Đinh Thị Hà, A.A Kicha, N.V Ivanchina, T.V Malyarenko, A.I Kalinovsky, R.S Popov, S.P Ermakova, Phạm Minh Quân, Số 18377, Quyết định số 6820/QĐ-SHTT, 05/02/2018 Giải pháp hữu ích: Hợp chất [(24S)-28-O-[alpha-L-fucopyranosyl(1→2)-3-O-methyl-beta-D-xylopyrano-syl]-24-methyl-5alpha-cholestane 23 3beta,4beta,6alpha,8,15beta,16beta,28-heptol; [(24S)-28-O-[2,4-di-O-methylbeta-D-xylopyranosyl-(1→2)-alpha-L-arabino-furanosyl]-24-methyl-5alphacholestane-3beta, 4beta, 6alpha, 8, 15beta, 16beta, 28-heptol] 6-O-sulfat phương pháp phân lập hai hợp chất từ loài biển Acanthaster planci Đoàn Lan Phương, Trần Thị Thu Thủy, Đinh Thị Hà, A.A Kicha, N.V Ivanchina, T.V Malyarenko, A.I Kalinovsky, R.S Popov, S.P Ermakova, Phạm Minh Quân, Số 1637, Quyết định số 4539/QĐ-SHTT, 31/01/2018 Đoàn Lan Phương, Phạm Quốc Long, Đinh Thị Hà, Đoàn Thị Hương, Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Văn Tuyến Anh, Trần Thị Thu Thủy Thành phần hóa học lồi biển gai Acanthaster planci từ biển Việt Nam, Tạp chí hóa học, 2013, T.51, số 6ABC, 131-134 Dinh Thi Ha, D L Phuong, P Q Long, N D Quang, T T T Thuy Synthesis and cytotoxicity of polyhydroxylated cholesterol derivatives Vietnam Journal of Science and Technology, 2018, 56 (4), 467-473 Dinh Thi Ha, Baskar Salvaraja, Pham Quoc Long, Ngo Dai Quang, Do Huu Nghi, Lee Jae Wook, Tran Thi Thu Thuy Synthesis of two new hydroximinosteroids from cholesterol and their biological evaluation Vietnam Journal of Science and Technology, 2019, 57 (5), 527-538 Phạm Quốc Long, Nguyễn Anh Hưng, A.A Kicha, N.V Ivanchina, Đinh Thị Hà, A.I Kalinovsky, T.V Malyarenko, Trần Thị Thu Thủy, Đoàn Lan Phương, Trịnh Thị Thu Hương, V.A Stonik Các hợp chất steroid glycoside từ hai loài biển Việt Nam Acanthaster planci Echinaster luzonicus, Kỷ yếu Hội thảo khoa học Đa dạng sinh học hợp chất có hoạt tính sinh học, 2015, 265-269 24 ... cứu phân lập, chuyển hóa đánh giá tác dụng sinh học steroid từ loài biển Acanthaster planci Mục tiêu nghiên cứu luận án Nghiên cứu thành phần hóa học lồi biển Acanthaster planci Việt Nam, thực... cơng trình sâu vào nghiên cứu phân lập, chuyển hóa hóa học đánh giá hoạt tính steroid phân lập từ sinh vật biển Sao biển Acanthaster planci loài biển phổ biến vùng biển Việt Nam, chúng mối đe... Các nghiên cứu bước đầu thành phần hóa học biển Acanthaster planci steroid, đặc biệt steroid phân cực Điều định hướng cho tác giả lựa chọn đề tài nghiên cứu luận án là: Nghiên cứu phân lập, chuyển