nghiên cứu phân lập cấu trúc và chuyển hóa zerumbone có trong củ gừng gió zinggiber zerumbet thu hái tại huyện bảo lạc cao bằng

Vì vậy, để giảm bớt các tác dụng phụ của thuốc tây y thì nhiều nghiên cứu gần đây trên thế giới đã hướng đến các chất có hoạt tính kháng ung thư có trong thực vật và được chuyển hóa từ h

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

Phitsakhone SYLAPHET

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, CẤU TRÚC VÀ CHUYỂN HÓA

ZERUMBONE CÓ TRONG CỦ GỪNG GIÓ (ZINGGIBER ZERUMBET) THU HÁI TẠI HUYỆN BẢO LẠC- CAO BẰNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2022

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

Phitsakhone SYLAPHET

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, CẤU TRÚC VÀ CHUYỂN HÓA

ZERUMBONE CÓ TRONG CỦ GỪNG GIÓ (ZINGGIBER ZERUMBET) THU HÁI TẠI HUYỆN BẢO LẠC - CAO BẰNG

Ngành: HOÁ HỮU CƠ

Mã số: 8.44.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Đinh Thúy Vân

THÁI NGUYÊN - 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của

TS Đinh Thúy Vân, sự giúp đỡ của các cán bộ giáo viên trường Đại học Sư phạm- Đại học Thái Nguyên Các số liệu nêu trong luận văn là trung thực, có xuất xứ rõ ràng Một phần kết quả đã được công bố trên Tạp chí phân tích Lý, Hóa và Sinh học, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận văn này

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2022

Tác giả luận văn

Phitsakhone SYLAPHET

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ hết sức

quý báu của các tập thể và cá nhân

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới cô giáo: TS Đinh Thúy

Vân, người đã tận tình hướng dẫn, hết lòng giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể thầy, cô giáo trong khoa Hóa học, tổ bộ môn

Hữu cơ, khoa Sau đại học - Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện

giúp đỡ cho tôi nghiên cứu, học tập và hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè, các học viên đã luôn động

viên, khuyến khích giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2022

Học viên

Phitsakhone SYLAPHET

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ vi

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Phương pháp nghiên cứu 2

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Đặc điểm thực vật cây gừng gió 3

1.2 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm.) 3

1.2.1 Thành phần hóa học của tinh dầu củ Gừng gió 4

1.2.2 Thành phần hóa học của tinh dầu thân và lá Gừng gió 5

1.2.3 Thành phần hóa học của tinh dầu hoa Gừng gió 6

1.3 Các đặc trưng của zerumbone 9

1.3.1 Phân lập và chuyển hóa zerumbone 9

1.3.2 Hoạt tính sinh học của gừng gió và zerumbone 10

1.4 Những nghiên cứu chuyển hóa zerumbone 11

1.4.1 Các nghiên cứu về hợp chất chứa vòng triazol 12

1.4.2 Các phương pháp tổng hợp azide 15

Chương 2: THỰC NGHIỆM 19

2.1 Phương pháp nghiên cứu, nguyên liệu và thiết bị 19

2.1.1 Phương pháp nghiên cứu 19

2.1.2 Hóa chất và dung môi 19

2.1.3 Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất bằng sắc kí lớp mỏng 19

2.1.4 Chứng minh cấu trúc 19

2.2 Chuẩn bị nguyên liệu 20

2.3 Ly trích tinh dầu gừng gió 20

2.4 Xác định thành phần hóa học của tinh dầu 20

2.5 Phân lập zerumbone từ cao chiết ethanol củ gừng gió khô 21

2.6 Thử hoạt tính sinh học của zerumbon TL01 22

2.6.1 Thử hoạt tính kháng khuẩn trên đĩa thạch 22

2.6.2 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của TL01 22

2.6.3 Thử hoạt tính kháng oxi hóa của TL01 24

2.7.1 Chuyển hóa zerumbone TL01 thành dẫn xuất 7-bromo-2,9,9-trimethyl-6- methylenecycloundeca-2,10- dienone G2-Br 25

2.7.2 Chuyển hóa 7-bromo-2,9,9-trimethyl-6-methylenecycloundeca-2,10- dienone thành Zerumbon azid G2-Az 25

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Thành phần hóa học tinh dầu gừng gió Cao Bằng 27

3.2 Phân tích cấu trúc zerumbone bằng các phương pháp phổ 28

3.2.1 Phân tích cấu trúc của zerumbone bằng phổ IR 28

3.2.3 Phân tích cấu trúc của zerumbone bằng phổ NMR 28

3.2.4 Phân tích cấu trúc của zerumbone bằng phổ HSQC và HMBC 32

3.2.5 Phân tích phổ khối lượng của TL01 36

3.3 Kết quả thử hoạt tính sinh học của zerumbone TL01 36

3.3.1 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn 36

3.3.2 Kết quả thử hoạt tính kháng ung thư của zerumbone TL01 37

3.3.3 Kết quả thử hoạt tính kháng oxi hóa của zerumbone TL01 38

3.4 Chuyển hóa Zerumbone thành hợp chất azid 38

KẾT LUẬN 42

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

TMS Chất chuẩn

HSQC Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều biểu hiện tương

tác trực tiếp giữa H với C mà nó liên kết trực tiếp

1H-NMR Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân của hiđro

13C-NMR Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân của cacbon

COSY Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều thể hiện tương

tác của các proton gần nhau trong không gian DEPT Phương pháp ghi phổ

HMBC Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều thể hiện tương

tác xa của nguyên tử 1H với 13C

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số chỉ số hóa học của tinh dầu củ Gừng gió 4

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của tinh dầu củ Gừng gió 4

Bảng 1.3 Thành phần hóa học của tinh dầu thân, lá Gừng gió 5

Bảng 1.4 Thành phần hóa học của tinh dầu hoa Gừng gió Huế 7

Bảng 1.5 Thành phần hóa học của tinh dầu thân rễ Gừng gió Bình Định 8

Bảng 1.6 Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất tổng hợp được 14

Bảng 3.1 Thành phần hóa học tinh dầu gừng gió trồng tại Cao Bằng 27

Bảng 3.2 Bảng dữ liệu phổ quy gán của zerumbone TL01 34

Bảng 3.3 Đường kính vòng kháng khuẩn (ĐKVKK) của zerumbone TL01 37

Bảng 3.4 Kết quả thử hoạt tính kháng ung thư của zerumbone 37

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

Hình:

Hình 1.1 Cây và củ Gừng gió (Zinggiber Zerumbet) 3

Hình 1.2 Cấu trúc của một số hợp chất lai có hoạt tính tốt [14] 15

Hình 3.1 Phổ 1H-NMR của hợp chất zerumbone 29

Hình 3.2 Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất zerumbone 30

Hình 3.3 Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất zerumbone 30

Hình 3.4 Phổ 13C-NMR của hợp chất zerumbone TL01 31

Hình 3.5 Phổ DEPT của hợp chất zerumbone TL01 32

Hình 3.6 Phổ HSQC của hợp chất zerumbone 33

Hình 3.7 Tương tác gần và xa giữa C và H 35

Hình 3.8 Phổ HMBC của hợp chất zerumbone TL01 35

Hình 3.9 Phổ MS của hợp chất zerumbone TL01 36

Hình 3.10 Phổ IR của hợp chất G2-Br 39

Hình 3.11 Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất zerumbone azid 40

Hình 3.12 Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất zerumbone azid 40

Hình 3.13 Phổ 13C-NMR của hợp chất G2-Az 41

Hình 3.14 Phổ HR-MS của hợp chất G2-Az 41

Sơ đồ: Sơ đồ 1.1 Phản ứng “click” dùng xúc tác Cu(I) [23, 30] 12

Sơ đồ 1.2 Phản ứng “click” dùng xúc tác phức [Cp*(RuCl(PPh3)2] 12

Sơ đồ 1.3 Tổng hợp các hợp chất lai của dẫn xuất quinazolin 119a-d với các azid qua cầu nối triazol 13

Sơ đồ 3.1 Chuyển hóa Zerumbone thành hợp chất azid 38

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Ngày nay, ô nhiễm môi trường sống cùng thực phẩm bẩn là những nguyên nhân hàng đầu làm gia tăng số ca mắc các bệnh ung thư trên toàn cầu Việt Nam là nước mà WHO xếp nằm trong 50 nước thuộc top 2 của bản đồ ung thư (50 nước cao nhất thuộc top 1) Điều trị ung thư thường được biết đến với phương pháp hóa trị, xạ trị thuốc điều trị tây y Tuy nhiên, các liệu pháp này bộc lộ một số hạn chế như khả năng kéo dài thời gian sống của bệnh nhân thường ngắn, thông thường dưới 1 năm đi kèm với chất lượng sống bị ảnh hưởng nặng nề Người bệnh phải gánh chịu nhiều tác dụng phụ của thuốc, đặc biệt là các tác dụng phụ trên tủy xương, gây ra tình trạng thiếu máu, chảy máu và giảm sức đề kháng của cơ thể dẫn đến các khả năng nhiễm khuẩn huyết làm cho bệnh nhân sớm tử vong Vì vậy, để giảm bớt các tác dụng phụ của thuốc tây y thì nhiều nghiên cứu gần đây trên thế giới đã hướng đến các chất có hoạt tính kháng ung thư có trong thực vật và được chuyển hóa từ hợp chất thiên nhiên

Từ lâu đời Gừng gió (Zingiber zerumbet) được sử dụng là cây thuốc quen thuộc

của các dân tộc thiểu số ở miền núi phía Bắc và miền Trung Tây Nguyên Việt Nam, là loài thực vật phát triển mạnh mẽ và phân bố ở hầu hết các nước nhiệt đới Châu Á Trong cây Gừng gió thì hàm lượng tinh dầu trong củ là cao nhất Hoạt chất chính trong tinh dầu của củ Gừng gió là zerumbone và hàm lượng của nó là tiêu chuẩn để đánh giá tinh dầu Gừng gió Ở các vùng lãnh thổ khác nhau làm cho hàm lượng và thành phần hóa

học của gừng gió cũng khác nhau Tuy nhiên đến nay chưa có công trình nào công bố về

thành phần hóa học của tinh dầu gừng gió trồng tại Cao Bằng Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu phân tích thành phần hóa học của tinh dầu gừng gió, chiết tách và thử hoạt tính sinh học, kháng ung thư của zerumbone và chuyển hóa zerumbone

để bước đầu có những đánh giá về tiềm năng, cung cấp dữ liệu về sự ảnh hưởng địa chất đến thành phần tinh dầu gừng gió được trồng và thu hái tại Cao Bằng

Nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước mới đây cho thấy Zerumbon là một tác nhân phòng ngừa và chống ung thư mạnh trên 10 loại ung thư khác nhau, đặc biệt là ung thư gan và ung thư vú, phòng ngừa ung thư, chống viêm, kháng các vi sinh vật và chống virut HIV Do đó, chuyển hóa zerumbone còn nhằm tạo ra các dẫn xuất mới chứa nhóm

chức sinh học của zerumbone với hoạt tính sinh học tốt hơn nó đang là những hướng nghiên

cứu rất được quan tâm Với các lý do trên thì đề tài “Nghiên cứu phân lập, cấu trúc và

chuyển hóa zerumbone có trong củ gừng gió (Zinggiber Zerumbet) thu hái tại

huyện Bảo Lạc- Cao Bằng” có ý nghĩa khoa học và tính thời sự cao

2 Mục tiêu của đề tài

- Xác định thành phần hóa học trong tinh dầu và cao chiết cồn củ gừng gió thu hái tại Bảo Lạc- Cao Bằng

- Phân lập và xác định cấu trúc zerumbone từ cao chiết cồn củ gừng gió

- Chuyển hóa zerumbone thành một dẫn xuất

- Xác định hoạt tính sinh học của các chất phân lập được

3 Nội dung nghiên cứu

Từ mục tiêu đặt ra, đề tài có các nội dung chính sau:

1 Thu mẫu củ Gừng gió (Zingiber zerumbet) Tạo tiêu bản, xác định tên

khoa học

2 Tạo mẫu nguyên liệu thu được

3 Khảo sát thành phần phần hóa học trong tinh dầu và cao chiết cồn củ gừng gió

4 Phân lập và xác định cấu trúc zerumbone từ cao chiết cồn củ gừng gió

5 Chuyển hóa zerumbone thành một dẫn xuất

6 Xác định hoạt tính sinh học chất phân lập được

4 Phương pháp nghiên cứu

- Xử lý mẫu, ngâm chiết với các dung môi phù hợp

- Trích ly tinh dầu bằng hơi nước

- Phương pháp GC-MS xác định thành phần tinh dầu

- Phương pháp sắc ký như sắc ký cột thường, sắc ký cột với chất nhồi cột silicagel

- Phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT-IR), tử ngoại (UV-VIS), phổ khối (EI-, ESI-, HR-MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D-, 2D-NMR) để xác định cấu trúc của các chất phân lập được

- Phương pháp thử hoạt tính sinh học

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm thực vật cây gừng gió

Hình 1.1 Cây và củ Gừng gió (Zinggiber Zerumbet)

Gừng gió là cây thảo mộc, cao 1 - 1,3 m Thân rễ dạng củ, phân nhánh, lúc non màu vàng và thơm, lúc già màu trắng và đắng, có mùi thơm Thân khí sinh khỏe, mọc đứng, nhẵn Lá không cuống mọc thành 2 dãy, hình mác thuôn dài, gốc hẹp dần, đầu nhọn, dài khoảng 20 cm, rộng 5cm mặt trên nhẵn, mặt dưới có lông rải rác Bẹ lá to nhẵn, lưỡi bẹ tròn dễ gãy Cụm hoa dạng trứng, đôi khi hình trụ, kích thước 6 - 14 x 4 -

5 cm, chóp tù, mọc từ thân rễ trên một cán mập dài 20 - 30 cm phủ bởi những lá bắc xếp lớp; mép màu lục nhạt Đài hoa nhỏ, tràng hoa có ống loe thành thùy hẹp màu trắng; một nhị; bao phấn dài hơn trung đới, cánh môi rộng màu vàng nhạt Các thùy hình mác dài, màu vàng chanh; có 3 thùy, thùy phía lưng lớn hơn, kích thước 2,5 x 2 cm; các thùy bên nhỏ kích thước 1,6 x 0,7 cm; môi dài 5 cm Mép có răng tròn, màu trắng hoặc vàng, bao phấn màu vàng nhạt; bầu 3 ô, quả nang hình bầu dục, chứa ít hạt màu đen Mùa hoa

1.2.1 Thành phần hóa học của tinh dầu củ Gừng gió

Tinh dầu cây Gừng gió chủ yếu tập trung ở bộ phận củ, tinh dầu củ Gừng gió có mùi thơm nồng [6] Tinh dầu củ Gừng gió mọc ở Trị Thiên và Đắc Lắc - Việt Nam có

các chỉ số hóa học được dẫn ra trong bảng 1.1 [6]

Bảng 1.1 Một số chỉ số hóa học của tinh dầu củ Gừng gió

Vùng Chỉ số xà phòng hóa Chỉ số acid Chỉ số este

6 Caryophylen oxit 1,5 22 Terpinen-4-ol 0,1

1.2.2 Thành phần hóa học của tinh dầu thân và lá Gừng gió

Tinh dầu thân, lá và hoa Gừng gió đều có màu vàng xanh nhạt, phảng phất mùi thơm của tinh dầu hoa bưởi [6] Có khoảng 40 hợp chất tìm thấy trong tinh dầu thân, lá Gừng gió (chiếm hơn 84% và 82% tinh dầu) Năm 1995, Nguyễn Xuân Dũng và cộng

sự đã nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu thân, lá Gừng gió vùng Bình Trị Thiên, kết quả được chỉ ra trong bảng 1.3

Bảng 1.3 Thành phần hóa học của tinh dầu thân, lá Gừng gió

(%)

Lá Gừng gió (%)

TT Tên chất Thân Gừng gió

(%)

Lá Gừng gió (%)

Các chất chưa nhận biết được 15,5 17,7

1.2.3 Thành phần hóa học của tinh dầu hoa Gừng gió [6, 19]

Hơn 44 hợp chất được tìm thấy trong tinh dầu hoa Gừng gió sinh trưởng khu vực Huế (chiếm khoảng 85% tinh dầu) và được chỉ ra trong bảng 1.4

Bảng 1.4 Thành phần hóa học của tinh dầu hoa Gừng gió Huế

Hàm lƣợng (%)

Hàm lƣợng (%)

11 (E)-β-ocimen 1,3 33 Caryophylen oxit 2,2

13

2-metyl-6-metylen-1,7-octadien

Bảng 1.5 Thành phần hóa học của tinh dầu thân rễ Gừng gió Bình Định

Kết quả phân tích định lượng và nhận dạng các thành phần hóa học của tinh dầu củ,

thân, rễ, lá và hoa của cây Gừng gió (Zingiber Zerumbet Sm.) cho thấy thành phần chủ yếu

của các loại tinh dầu này là các sesquitecpen và dẫn xuất chứa oxi của chúng được xây dựng trên hai khung cacbon cơ sở là humulan và caryophylan Trong tinh dầu củ chúng chiếm đến 83,6%, tinh dầu của thân và lá có thêm dẫn xuất oxi của khung farnezan chiếm một lượng khá lớn: trong thân là 16,8%, trong lá là 22,3%

Mối liên hệ giữa 4 loại tinh dầu này dựa trên 3 thành phần: zerumbone, humulen và caryophylen với tinh dầu của củ thì zerumbone là chủ yếu (72,3%), humulen và humulen

oxit là 11,3%, caryophylen chiếm 1,5% Trong khi đó, tinh dầu của hoa thì zerumbone là 3,2%, humulen là 1,9% nhưng caryophylen lên đến 13,2%

Ở các vùng lãnh thổ khác nhau thì các thành phần này cũng khác nhau, ví dụ như tinh dầu củ Gừng gió Việt Nam vùng Bình Trị Thiên zerumbone chiếm 72,3%, humulen chiếm 4,2% Trong khi đó, tinh dầu củ Gừng gió Philippin thì zerumbone chiếm 35,5% và humulen là 17,3% Trong cây Gừng gió thì hàm lượng tinh dầu trong củ là cao nhất Vì trong tinh dầu của củ Gừng gió zerumbone là thành phần có hàm lượng lớn nhất nên nói đến tinh dầu Gừng gió là nói đến zerumbone và hàm lượng của nó là tiêu chuẩn để đánh giá tinh dầu Gừng gió

1.3 Các đặc trƣng của zerumbone

1.3.1 Phân lập và chuyển hóa zerumbone

Zerumbone là thành phần chính được phân lập từ củ Gừng gió lần đầu tiên vào năm 1960 [17], được Damodaran.N.P và các cộng sự xác định cấu trúc phân tử vào năm

1965 Hiện nay zerumbone đang được ứng dụng trong lâm sàng làm thuốc điều trị ung thư

ở giai đoạn III Do đó việc phân tích cấu trúc và xây dựng phương pháp hóa lý hiện đại để định lượng zerumon là rất có ý nghĩa khoa học

Zerumbone còn có tên là 8-oxohumulen, tên khoa học là (E,E,E)-2,6,9,9-tetrametylcycloundeca-2,6,10-trien-1-on, được phân lập chủ yếu từ tinh dầu Zermbon là tinh thể hình kim, nóng chảy ở 67-68oC và có nhiệt độ sôi (10 mmHg) là 165-167oC Ngoài ra, zerumbone đã được phân lập từ các cây: Syringa

pinnafolta; Zingiber zerumbet và một số cây thuộc chi gừng

Zerumbone là một xeton sesquitecpen đơn vòng, trong phân tử có nhóm

cacbonyl α,β không no, có ba liên kết đôi do đó khả năng chuyển hóa zerumbone rất

lớn: chuyển hóa ở các liên kết đôi (1, 2 hay cả 3 liên kết đôi) bằng các phản ứng khác nhau như cộng hợp, oxi hóa, đồng phân hóa Chuyển hóa nhóm cacbonyl bằng cách

khử hóa theo các mức độ khác nhau, như khử thành ancol, khử thành metylen bằng các phương pháp khử khác nhau, bảo toàn và không bảo toàn liên kết đôi Chuyển hoá mở vòng thành các dẫn xuất oxi hay dẫn xuất khác

Zerumbone là một tác nhân chống ung thư [40], phòng ngừa ung thư [32], chống viêm, kháng các vi sinh vật [27] và chống virut HIV [18] Do đó, chuyển hóa zerumbone còn nhằm tạo ra các sản phẩm có hoạt tính sinh học tốt hơn zerumbone và tìm ra nhóm chức sinh học của phân tử zerumbone cũng là một hướng chuyển hóa rất được quan tâm: Khử hóa nhóm cacbonyl thành ancol để nghiên cứu phản ứng tổng hợp bất đối xứng của zerumbol và xác định cấu hình tuyệt đối của nó [26] Cộng hợp vào

liên kết đôi liên hợp α,β của nhóm cacbonyl: các nghiên cứu cho thấy khi ở nhiệt độ phòng hay ở nhiệt độ thấp hơn các amin bậc 1 và bậc 2 cộng hợp vào liên kết đôi α,β

với nhóm cacbonyl tạo ra các dẫn xuất amin của zerumbone [27]

1.3.2 Hoạt tính sinh học của gừng gió và zerumbone

Như phần trên đã trình bày hàm lượng zerumbone trong củ Gừng gió rất cao, đặc biệt trong tinh dầu (73,2%) [19] Nó là thành phần chính quyết định giá trị của tinh dầu Gừng gió cũng như cặn chiết của Gừng gió Do đó, nghiên cứu hoạt chất sinh học trong Gừng gió trước hết là nghiên cứu hoạt tính sinh học của zerumbone

Hoạt tính chống ung thư là hoạt tính nổi bật của zerumbone Điều này được Takahashi.S đề cập đến năm 1988 [28] và về sau có nhiều nghiên cứu khẳng định điều này Đặc biệt năm 2005, Huang.G.C và cộng sự nghiên cứu tác dụng ức chế khối u của

zerumbone trên tế bào P-388Dl invitro, invo ở chuột và khẳng định ở nồng độ 5 mg/kg

(thể trọng chuột) thì kéo dài sự sống của chuột một cách rõ rệt [24] Zerumbone cũng

ức chế sự phát triển tế bào ung thư máu trắng dòng HL 60 ở người, ở các nồng độ 22,29; 9,12 và 2,27 µg/ml trong 6, 12 và 18 giờ, tùy theo phương thức điều trị [25]

Ngoài nghiên cứu hoạt tính chống ung thư, người ta cũng rất quan tâm nghiên cứu hoạt tính phòng ngừa ung thư và nhóm chức sinh học của phân tử zerumbone Đây

là một hướng nghiên cứu mới phát triển đầu thế kỉ này Để khảo sát hoạt tính phòng ngừa ung thư Murakami.A và cộng sự đã khảo sát hoạt tính ức chế của zerumbone đối với tác nhân gây ung thư TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate) do hoạt động của virut Epstein-Barr tạo ra Kết quả cho thấy zerumbone là một tác nhân ức chế mạnh tác nhân gây ung thư TPA (IC50 = 0,14 µM) [32]

Các nghiên cứu sâu hơn vai trò của nhóm cacbonyl α, β không no trong phân tử zerumbone của Nakamura và cộng sự cho thấy zerumbone là một tác nhân hóa học phòng ngừa (chemopreventive agent) chống lại các bệnh ung thư ruột già và ung thư da nhờ nhóm cacbonyl α, β không no của nó đã kích thích các enzym giải độc phase II của

tế bào biểu mô nuôi cấy trên chuột Còn humulen và zerumbol không có các nhóm này nên không thể hiện một tác dụng nào Các tác giả còn cho rằng đặc tính ái điện tử của nhóm cacbonyl α, β không no làm cho khả năng phản ứng ái nhân của các protein sunfuryl tốt hơn ở vị trí nhóm cacbonyl này, nhất là các tiol có phân tử lượng thấp Đó

là thực chất vai trò quan trọng của nhóm cacbonyl α,β không no trong kích thích enzym

giải độc phase II [34]

1.4 Những nghiên cứu chuyển hóa zerumbone

Vào năm 2010 Uraiwan Songsiang và cộng sự đã chỉ ra rằng dẫn xuất 3- amino, 3- amino thế có hoạt tính chống sự phát triển của 5 dòng ung thư túi mật khác nhau ở nồng độ IC50  75 M trong khi đó ở nồng độ này zerumbone không có tác dụng- đây

là một kết quả thú vị [42] Theo hướng này người ta tổng hợp rất nhiều dẫn xuất của zerumbone nhằm nâng cao hiệu quả của zerumbone Cấu tạo phân tử của Zerumbone cho thấy có nhiều khả năng tổng hợp các dẫn xuất của Zerumbone như: dẫn xuất của nhóm cacbonyl, dẫn xuất của liên kết đôi liên hợp với nhóm C=O, dẫn xuất của liên kết đôi độc lập (C6=C7) và các dẫn xuất của oix hoá mở vòng Đứng đầu trong chuyển hoá Zerumbone là các nhà khoa học Nhật Bản [31]

Năm 2016 S C Santosh Kumar và cộng sự đã nghiên cứu chuyển hóa Zerumbone thành Zerumbal và zerumbenone, hoạt tính kháng khuẩn tốt trên hai chủng

khuẩn: Samonella; E coli

1.4.1 Các nghiên cứu về hợp chất chứa vòng triazol

Triazol là hợp chất dị vòng thơm năm cạnh với 3 nguyên tử nitơ có moment lưỡng cực cao, dễ dàng tham gia quá trình hình thành liên kết hydro và các tương tác lưỡng cực với DNA, protein hoặc các tế bào Hợp chất dị vòng này không bị thủy phân trong môi trường acid và bazơ cũng như không bị phá huỷ trong quá trình khử

và oxy hóa Triazol dễ dàng được tổng hợp bằng phản ứng cộng đóng vòng kiểu 1,3 lưỡng cực với xúc tác Cu(I) hay còn gọi là phản ứng “click” [23, 30]

N N

R' R

Sơ đồ 1.2 Phản ứng “click” dùng xúc tác phức [Cp*(RuCl(PPh 3 ) 2 ]

Các triazol là nhóm hợp chất dị vòng có nhiều hoạt tính sinh học quý như kháng khuẩn, kháng nấm và chống ung thư [16, 20, 29, 35, 38] Đây là những hoạt tính tương tự như một số hợp chất nhóm imidazol, trong đó nhiều hợp chất imidazol

đã được sử dụng trong dược phẩm như kháng khuẩn (ví dụ như 5-nitroimidazol) [15],

chống nấm (muconazol) [45], thuốc an thần (midazolam) [30] Đã có rất nhiều công

trình công bố tổng hợp thành công các hợp chất lai bằng phản ứng click tạo cầu nối là nhóm 1,2,3-triazol [22, 36, 37, 39, 41] 1,2,3-triazol là hợp chất dị vòng thơm năm cạnh với 3 nguyên tử nitơ có moment lưỡng cực cao, dễ dàng tham gia quá trình hình thành liên kết hydro và các tương tác lưỡng cực với ADN, protein hoặc các tế bào Hợp chất dị vòng này không bị thủy phân trong môi trường acid và bazơ cũng như

không bị phá hủy trong quá trình oxi hóa và khử Triazol dễ dàng được tổng hợp bằng phản ứng cộng đóng vòng kiểu 1,3 lưỡng cực với xúc tác Cu(I) hay còn gọi là phản ứng “click” Bên cạnh đó, hợp chất 1,2,3-triazol cho hoạt tính chống ung thư, kháng khuẩn và kháng nấm mạnh Với những tính năng ưu việt về mặt hóa học cũng như hoạt tính sinh học, 1,2,3-triazol vừa là tác nhân vừa là cầu nối lý tưởng để lai hóa các hợp chất có dược tính khác như 4-anilinoqinazoline Việc đưa nhóm thế triazoyl có chứa vòng thơm chứa các nhóm chức NO2 và CF3 ở các vị trí khác nhau vào mạch nhánh có thể sẽ làm tăng tương tác tyrosin kinase và cải thiện tính chất hóa lý của hợp chất quinazolin ban đầu Tuy nhiên cho đến nay thì chưa có công trình nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất 4-anilinoquinazolin chứa nhóm 1,2,3 triazol ở mạch nhánh Do vậy đây là nhóm cầu nối lí tưởng để lai hóa các lớp chất có hoạt tính khác nhau, hứa hẹn tổng hợp được nhiều hợp chất cấu trúc lai có hoạt tính sinh học quý

Năm 2019 Đinh Thúy Vân và cộng sự đã tổng hợp được nhiều hợp chất lai chứa vòng triazol có hoạt tính sinh học cao đối với 3 dòng ung thư ở người: KB (ung thư biểu mô, Hep-G2 (ung thư gan) và Lu (ung thư phổi không phải tế bào nhỏ) [14]

Sơ đồ 1.3 Tổng hợp các hợp chất lai của dẫn xuất quinazolin 119a-d với các azid

qua cầu nối triazol

Thuốc thử và điều kiện: 1 equiv 4-anilinoquinazolin 119a-d, 1,1 azid equiv, 12

equiv DIPEA, 0,2 equiv CuI, THF, khuấy, 1-2 ngày, 70-90%

Bảng 1.6 Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất tổng hợp đƣợc

chất

IC 50 (KB),

µM

IC 50 (HepG2),

µM

IC 50 (Lu), µM

Năm 2000 C Yu và cộng sự đá tiến hành tổng hợp Phosphorylpyridinium azide

từ Bis (2,4-diclorophenyl) photphat theo sơ đồ sau:

Theo đó Bis (2,4-diclorophenyl) photphat làm trung gian để tiến hành phản ứng one- pot điều chế hiệu quả các ankyl azide từ các ankan với sự có mặt của 4 - (đimetylamino) pyridin làm bazơ Phosphorylpyridinium azide được cho là tác nhân kích hoạt trong những điều kiện này

Đến năm 2006 một nghiên cứu của Y Ju và các cộng sự cho thấy con đường tổng hợp các azide bằng lò vi sóng nhanh chóng và hiệu quả, con đường này thúc đẩy

sự thay thế nucleophin của alkyl halogenua hoặc tosylat bằng azid kiềm, thiocyanat hoặc sulfinat trong môi trường nước dung nạp các nhóm chức phản ứng khác nhau

Tuy nhiên theo phương pháp trên thì điều kiện phức tap, khống chế phản ứng khó, khắc phục những điều kiện phản ứng khác nghiệt theo các nghiên cứu trên thì năm 2012 M Kitamura và cộng sự đã nghiên cứu chuyển azid của 2-azido-1,3-đimetylimidazolinium hexafluorophosphat (ADMP) thành rượu tiến hành tạo ra các azid tương ứng trong điều kiện phản ứng nhẹ Các azid hữu cơ được phân lập dễ dàng vì các sản phẩm phụ hòa tan nhiều trong nước

Trong một nghiên cứu khác của G Dagousset, và các cộng sự vào năm 2014 cho thấy sự chuyển hóa azidotrifluoromethyl được xúc tác quang học của styren được thay thế cũng như các anken hoạt hóa và không hoạt hóa khác nhau bằng cách sử dụng [Ru (bpy) 3 (PF 6 ) 2] làm chất xúc tác quang và thuốc thử của Umemoto như nguồn

CF 3 cung cấp một loạt các azid hoặc amin β-trifluoromethyl hóa rộng rãi với sản lượng tốt

Năm 2015 nghiên cứu của M Dryzhakov và các cộng sự đã nghiên cứu về hiệu ứng của xúc tác trong chuyển hóa của ancol như sau:

Hiệu ứng đồng xúc tác của các hợp chất nitro cho phép acid hóa xúc tác B (C 6 F 5 ) 3· H 2 O của rượu béo bậc ba với nhiều loại cơ chất Bằng chứng động học, điện tử và quang phổ cho thấy rằng các tập hợp liên kết hydro bậc cao của các hợp chất nitro và acid là chất xúc tác acid Brønsted có hiệu quả về mặt động học

Với AgNO 3 làm chất xúc tác và K 2 S 2 O 8 làm chất oxy hóa, một phương pháp hiệu quả và tổng quát để khử cacboxyl hóa acid cacboxylic béo với tosyl azid hoặc pyridin-3-sulfonyl azid trong dung dịch nước MeCN tạo ra các ankyl azid tương ứng dưới điều kiện nhẹ Đã quan sát thấy phạm vi chất nền rộng và khả năng tương thích nhóm chức năng rộng Một cơ chế cấp tiến được đề xuất

C Liu, X Wang, Z Li, L Cui, C Li, J Am Chèm Soc , 2015 , 137 , 9820-9823

Trong quá trình nitro hóa khử cacboxyl hóa có xúc tác, một loạt các organoazid bậc ba, bậc hai và chính được điều chế từ các acid cacboxylic béo có sẵn dễ dàng bằng cách sử dụng K 2 S 2 O 8 làm chất oxy hóa và PhSO 2 N 3 làm nguồn nitơ thông qua quá trình gốc ankyl

Y Zhu, X Liu, X Wang, X Huang, T Shen, Y Zhang, X Sun, M Zou, S

Song, N Jiao, Org Lett , 2015 , 17 , 4702-4705

Phương pháp hydroazid hóa trực tiếp chống Markovnikov liên phân tử đối với olefin không hoạt tính được thúc đẩy bởi một lượng xúc tác benziodoxol ổn định ở nhiệt độ môi trường xung quanh Phương pháp này tạo điều kiện thuận lợi cho việc bổ sung trực tiếp acid hydrazoic trước đây qua nhiều loại olefin không hoạt

tính H Li, S.-J Shen, C.-L Zhu, H Xu, J Am Chèm Soc , 2019 , 141 , 9415-9421

Theo NPR Onuska và các cộng sự vào năm 2020, muối acridinium hữu cơ xúc tác quá trình hydroazid hóa chống Markovnikov của các olefin hoạt hóa dưới sự chiếu

xạ từ đèn LED xanh lam Phương pháp này có thể áp dụng cho nhiều loại styren được thay thế và một số ete vinyl, tạo ra các sản phẩm hydroazid hóa tổng hợp đa năng với năng suất tuyệt vời, trong khi styren cuối cung cấp các sản phẩm hydroazid hóa với sản lượng vừa phải

Chương 2 THỰC NGHIỆM

2.1 Phương pháp nghiên cứu, nguyên liệu và thiết bị

2.1.1 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp ngâm chiết, phân lập chất, thử hoạt tính sinh học, phương pháp nghiên cứu cấu trúc hợp chất hữu cơ: phổ IR, MS, NMR, 2D-NMR…phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy, sắc kí bản mỏng, sắc kí cột…

2.1.2 Hóa chất và dung môi

- Ethanol, n-hexane, methanol, nước cất, - Sắc ký bản được sử dụng bản mỏng

từ silica gel 60 F254 tráng trên lá nhôm của hãng Merck (Đức)

- Silica gel cỡ hạt 0,04-0,06 mm

- Thuốc thử hiện vết rên bản mỏng: CeSO4 pha trong Mo(SO4)2

2.1.3 Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất bằng sắc kí lớp mỏng

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) được sử dụng để định tính các chất và hỗn hợp sản phẩm Thông thường các chất có giá trị Rf khác nhau, màu sắc và sự phát quang khác nhau Giá trị Rf của các chất phụ thuộc vào bản chất của các chất và phụ thuộc vào dung môi làm pha động Dựa trên tính chất đó, chúng ta có thể tìm được dung môi hay hỗn hợp dung môi để tách các chất ra xa nhau (Rf khác xa nhau) hay tìm được hệ dung môi cần thiết để tinh chế các chất

c) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ 1H-NMR (500MHz) và 13C-NMR (125MHz) của các chất nghiên cứu được

đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với dung môi thích hợp và TMS là chất chuẩn, tại Trung tâm Phân tích cấu trúc - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

d) Phổ khối lượng (MS)

Phổ khối của các chất nghiên cứu được ghi trên máy Hewlett phổ LC-LTQ Orbitrap XL của hãng Thermo Scientific tại Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học

Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội

2.2 Chuẩn bị nguyên liệu

Củ gừng gió tươi được thu thập tại huyện Bảo Lạc, tỉnh Cao Bằng vào tháng 10 Nguyên liệu được thu hái từ 7-8 giờ sáng, yêu cầu củ không bị dập, héo úa, nấm mốc và sâu bệnh Sau đó rửa bằng nước sạch, đập dập trước khi cho vào thiết bị chưng cất

2.3 Ly trích tinh dầu gừng gió

Tinh dầu củ gừng gió được ly trích bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp

+ Cân 100g củ tươi, bổ sung nước cất đến tỉ lệ nguyên liệu: nước là 1:6; sử dụng

bộ cất tinh dầu nhẹ để tiến hành chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp trong thời gian thích hợp Thời gian chiết tách được tính từ khi bắt đầu có giọt dầu ngưng tụ đầu tiên

Chưng cất trong khoảng 4 giờ cho tới khi thể tích tinh dầu không tăng nữa Ngừng cất, sau 10 phút đọc thế tích tinh dầu trong ống cất để xác định hàm lượng tinh dầu (ml/l00g)

Tinh dầu thô được xử lý lọc và làm khan bằng Na2SO4 khan

Tinh dầu được bảo quản trong lọ thủy tinh tối màu ở nhiệt độ 6°C (trong ngăn mát tủ lạnh) đế tiến hành các thử nghiệm

2.4 Xác định thành phần hóa học của tinh dầu

Thành phần hóa học của tinh dầu gừng gió được xác định bằng phương pháp sắc

ký khí ghép phổ khối GC-MS tại phòng phân tích Hóa học- viện Hợp Chất Thiên Nhiên- Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

Tinh dầu gừng gió được phân tích bằng thiết bị sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS của Agilent, GC 7890A - MS 5975C Cột HP5 (30m; 0,25mm; 0,25pm) Sử dụng khí mang là He Nhiệt độ buồng bơm mẫu là 250°C, nhiệt độ đầu dò 280°C Tỉ lệ chia dòng 1:20, mẫu được pha loãng trong hexane, thể tích tiêm 1µl Chương trình nhiệt: nhiệt độ đầu 90°C, tăng 8°C/phút đến 280°C, giữ 5 phút, sử dụng thư viện phổ NIST 2011 của máy để định danh các cấu tử trong mẫu tinh dầu

2.5 Phân lập zerumbone từ cao chiết ethanol củ gừng gió khô

Cho 2,1 kg mẫu củ Gừng gió khô đã được nghiền nhỏ vào bình thủy tinh 10 lít tối màu Cho tiếp 5,0 lít cồn tuyệt đối (C2H5OH 96%)vào đến khi ngập nguyên liệu Tiến hành ngâm chiết nguyên liệu trong 7 ngày Sau đó chiết dịch lọc cồn qua phễu lọc hút chân không Dịch chiết cồn được quay cất dưới áp suất thấp để thu hồi dung môi Quá trình ngâm chiết được thực hiện lặp lại đến khi nào dịch chiết cồn có phản ứng âm tính với thuốc thử Bayers Gộp các dịch chiết này lại quay đuổi dung môi thu được cao chiết cồn Cao chiết thu được có mầu nâu đỏ, mùi thơm dễ chịu có khối lượng 459 gam

Nhồi cột silica gel kích thước (đường kính: 4cm và chiều cao: 56cm) Ổn định cột bằng dung môi hexane Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi hexane: ethyl acetate

(95:5) Thu được 1,0 gam zerumbone tinh khiết TL01 là tinh thể hình kim màu trắng,

có điểm chảy là 66-67oC

IR (KBr) cm-1: 3026; 2963; 2943; 2920; 2897; 2856; 1655; 1456; 1387; 1364; 1299; 1263; 1212; 1183; 1104; 964; 907; 847; 827; 780; 696