Nghiên cứu phân lập, cấu trúc và chuyển hóa anethol có trong tinh dầu hồi (illicium verum hook f ) thu hái tại cao bằng

Trang 1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THONGSAVING OUNKUEA NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, CẤU TRÚC VÀ CHUYỂN HÓA ANETHOL CÓ TRONG TINH DẦU HỒI ILLICIUM VERUM HOOK.. THU HÁI TẠI CAO BẰN

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

THONGSAVING OUNKUEA

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, CẤU TRÚC VÀ

CHUYỂN HÓA ANETHOL CÓ TRONG TINH DẦU HỒI (ILLICIUM VERUM HOOK F.) THU HÁI TẠI CAO BẰNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Thái Nguyên, tháng 12 năm 2023

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

THONGSAVING OUNKUEA

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, CẤU TRÚC VÀ

CHUYỂN HÓA ANETHOL CÓ TRONG TINH DẦU HỒI (ILLICIUM VERUM HOOK F.) THU HÁI TẠI CAO BẰNG

Ngành: HOÁ HỮU CƠ

Mã số: 8.44.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Đinh Thúy Vân

Thái Nguyên - 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đã thực hiện việc kiểm tra mức độ tương đồng luận văn qua phần mềm Turnitin một cách trung thực và đạt kết quả mức độ tương đồng

……% Bản luận văn kiểm tra qua phần mềm là bản cứng đã nộp để bảo vệ trước hội đồng Nếu sai tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2023

Tác giả luận văn

THONGSAVING OUNKUEA

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đinh Thúy Vân - giảng viên hướng dẫn nghiên cứu khoa học của tôi Cô đã chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi rất tận tình trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Tôi chân thành cảm ơn Phòng Đào tạo trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Hóa cùng với các giảng viên trong khoa đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong thời gian học tập tại trường

Cảm ơn gia đình, những người thân và bạn bè luôn là chỗ dựa tinh thần của tôi, động viên tôi bước vững trên con đường sự nghiệp của mình

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2023

Tác giả luận văn

THONGSAVING OUNKUEA

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH v

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về thực vật nghiên cứu 2

1.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu về hồi trong và ngoài nước 5

1.2.1 Trong nước 5

1.2.2 Ngoài nước 7

1.3 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học 10

1.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn 10

1.3.2 Hoạt động kháng nấm 12

1.3.4 Hoạt động chống oxy hóa 13

1.3.5 Hoạt động chống viêm 14

1.4 Những nghiên cứu chuyển hóa trans- anethol thành dẫn xuất 15

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 18

2.1 Chuẩn bị nguyên liệu 18

2.2 Ly trích tinh dầu hồi 18

2.3 Xác định thành phần hóa học của tinh dầu 18

2.4 Thử hoạt tính kháng khuẩn trên đĩa thạch 20

2.5 Phân lập (E)-1-methoxy-4-(prop-1-en-1-yl)benzene (anethole) từ tinh dầu thân hồi 21

2.6 Tổng hợp dẫn xuất của anethole 22

2.6.1 Tổng hợp hợp chất TDH.V1-Br 22

2.6.2 Quy trình chung tổng hợp hợp chất TDH-A1 và TDH-A5 22

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Kết quả ly trích tinh dầu hồi 24

3.2 Kết quả khảo sát thành phần hóa học tinh dầu thân hồi thu hái tại Cao Bằng 24

3.3 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu hồi 26

3.4 Kết quả phân lập anethol từ tinh dầu thân hồi 28

3.5 Kết quả tổng hợp dẫn xuất của anethol 32

3.5.1 Tổng hợp (E)-N1-(3-(4-methoxyphenyl)allyl)benzene-1,2-diamine (THD-A1) 32

3.5.2 Tổng hợp (E)-1-(3-(4-methoxyphenyl)allyl)-1H-indole (THD-A5) 37

KẾT LUẬN 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần hóa học tinh dầu thân hồi thu háitại huyện Trà Lĩnh,

tỉnh Cao Bằng 25 Bảng 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu thân hồi 27

DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ

Hình:

Hình 1.1 Hoa và lá cây hồi 2

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của các hợp chất chọn lọc của tinh dầu I verum 9

Hình 3.1 Mẫu tinh dầu hồi được ly trích từ nguyên liệu thu hái tại Cao Bằng 24

Hình 3.2 Phổ GC-MS của tinh dầu thân hồi thu hái tại Cao Bằng 26

Hình 3.3 Phổ 1 H-NMR của hợp chất anethol TDH-V1 30

Hình 3.4 Phổ 1 H-NMR giãn của hợp chất anethol TDH-V1 30

Hình 3.5 Phổ 13 C-NMR của hợp chất anethol TDH-V1 31

Hình 3.6 Phổ 13 C-NMR giãn của hợp chất anethol TDH-V1 31

Hình 3.7 Phổ IR của hợp chất (E)-N1-(3-(4-methoxyphenyl)allyl)benzene-1,2-diamine (THD-A1) 34

Hình 3.8 Phổ 1 H-NMR của hợp chất (E)-N1-(3-(4-methoxyphenyl)allyl) benzene-1,2-diamine (THD-A1) 34

Hình 3.9 Phổ 1 H-NMR giãn của hợp chất (E)-N1-(3-(4- methoxyphenyl)allyl) benzene-1,2-diamine (THD-A1) 35

Hình 3.10 Phổ 1 H-NMR giãn của hợp chất (E)-N1-(3-(4-methoxyphenyl)allyl) benzene-1,2-diamine (THD-A1) 35

Hình 3.11 Phổ 13 C-NMR của hợp chất (E)-N1-(3-(4-methoxyphenyl)allyl) benzene-1,2-diamine (THD-A1) 36

Hình 3.12 Phổ 13 C-NMR giãn của hợp chất (E)-N1-(3-(4-methoxyphenyl) allyl)benzene-1,2-diamine (THD-A1) 36

Hình 3.13 Phổ 13 C-NMR giãn của hợp chất (E)-N1-(3-(4-methoxyphenyl) allyl)benzene-1,2-diamine (THD-A1) 37

Hình 3.14 Phổ IR của hợp chất (E)-1-(3-(4-methoxyphenyl)allyl)-1H-indole (THD-A5) 39

Hình 3.15 Phổ 1 H NMR của hợp chất (E)-1-(3-(4-methoxyphenyl)allyl)-1H-indole (THD-A5) 40

Hình 3.16 Phổ 1 H NMR giãn của hợp chất

(E)-1-(3-(4-methoxyphenyl)allyl)-1H-indole (THD-A5) 40 Hình 3.17 Phổ 1 H NMR của hợp chất (E)-1-(3-(4-methoxyphenyl)allyl)-1H-

indole (THD-A5) 41 Hình 3.18 Phổ 13 C NMR của hợp chất (E)-1-(3-(4-methoxyphenyl)allyl)-1H-

indole (THD-A5) 41 Hình 3.19 Phổ 13 C NMR giãn của hợp chất (E)-1-(3-(4-methoxyphenyl)allyl)-

1H-indole (THD-A5) 42 Hình 3.20 Phổ 13 C NMR giãn của hợp chất (E)-1-(3-(4-methoxyphenyl)allyl)-

1H-indole (THD-A5) 42

Sơ đồ:

Sơ đồ 1.1 Tổng hợp một số dẫn xuất hydroxyl của trans- anethole 15

Sơ đồ 1.2 Tổng hợp 2-(4-methoxyphenyl)-3-methyl oxiran và 1-(4-methoxy

phenyl)-2-propanol từ trans-anethol 16

Sơ đồ 1.3 Tổng hợp dẫn xuất pyrazole thế bốn 1,3,4,5 của trans- anethole 17

Sơ đồ 3.1 Tổng hợp dẫn xuất mới của anethole TDH-V1 32

MỞ ĐẦU

Theo Đỗ Tất Lợi hồi hay đại hồi hương, bát giác hồi hương có tên khoa

học là Illicium verum Hook F Thuộc họ Hồi Illiciaceae Được trồng nhiều tại

các quốc gia thuộc khu vực Đông Nam Á, Đông Á và Bắc Mỹ Từ lâu hồi được

sử dụng phổ biến trong nền ẩm thực và y học cổ truyền của các nước Trung Quốc, Việt Nam, Ấn Độ Tinh dầu của hồi có mùi thơm, vị hơi ngọt, tính ôn Dân gian xưa đã sử dụng hồi trong nhiều bài thuốc sát trùng, hỗ trợ tiêu hóa; hỗ trợ phụ nữ sau sinh có nhiều sữa; giảm đau, giảm co bóp trong điều trị đau dạ dày [1] Gần đây, trong nhiều công bố khoa học trên thế giới cho thấy tiềm năng ứng dụng của thực vật hồi đối với y học hiện đại như: các hoạt chất học được tách ra từ tinh dầu hồi có đặc tính chống oxy hóa, chống phân hủy, kháng nấm và kháng khuẩn

tốt; từ dịch chiết Illicium verum tách được shikimic acid là một nguyên liêu đầu

quan trọng để tổng hợp hoạt chất chính Oseltamivir (thuốc kháng virus Tamiflu) dùng để điều trị cúm gia cầm, kháng khuẩn, kháng vi rút [2], [3], chống oxy hóa [4] chống ung thư [5]

Anethol là thành phần chính trong tinh dầu Illicium verum mang nhiều

hoạt tính sinh học quý như kháng viêm, kháng khuẩn, kháng ung thư Là chất đầu quan trọng trong tổng hợp Anethol trithione (ATT)- hoạt chất chính của thuốc trị giảm tiết nước bọt (hỗ trợ trong điều trị ung thư, sau hóa- trị xạ)…Như vậy có thể thấy hướng nghiên cứu bán tổng hợp từ anethol thành các dẫn xuất

đang được quan tâm và phát triển Trong tương lai gần, thảo dược Illicium verum

và dạng tinh dầu sẽ trở thành đối tượng có nhiều tiềm năng trong lĩnh vực y học

Với lí do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên cứu phân lập, cấu trúc và chuyển hóa anethol có trong tinh dầu hồi (illicium verum Hook F.) thu hái tại Cao Bằng Đề tài có tính thời sự cao, để bước đầu có những đánh

gíá về tiềm năng, cung cấp dữ liệu về sự ảnh hưởng địa chất đến thành phần tinh dầu hồi Cung cấp dữ liệu về quy trình tổng hợp và hoạt tính sinh học của các chất dẫn xuất anethol

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về thực vật nghiên cứu

Hồi có tên gọi khác là Đại hồi hay còn gọi là Bát giác hồi hương, bát giác

hồi, đại hồi hương Tiếng dân tộc Tày là mác hồi Tên khoa học Illicium verum

Hook.f thuộc họ Hồi Illiciaceae, có khoảng trên 40 loài

Cây hồi chủ yếu trồng ở Quảng Tây và Quảng Đông (Trung Quốc), một

số nước như Philippin, Jamaica Tại Việt Nam trước kia thì hồi được trồng chủ yếu tại tỉnh Lạng Sơn (Văn Quán, Bình Gia, Cao Lộc, Bắc Sơn, Chi Lăng, Văn Lãng, Thị xã Lạng Sơn, Lộc Bình, Đình Lập, Tràng Định ), Quảng Ninh Theo những nghiên cứu trước đây cho thấy thì hoa hồi ở tỉnh Lạng Sơn là chất lượng nhất Tuy nhiên, ngày nay vùng trồng hồi được phát triển ở nhiều tỉnh miền núi phía bắc như Cao Bằng, Tuyên Quang, Bắc Kạn, Thái Nguyên…[1]

Hình thái học [1]

Hồi là loại cây thân gỗ, cao, mọc thẳng tuy nhiên lá, thân và cành rất giòn,

dễ gẫy Lá mọc theo chùm, có cuống và mùi thơm Hoa hồi có cánh, khi còn non

có màu xanh lá, khi chín thì khô cứng và chuyển sang màu nâu hồng Dân gian vẫn gọi là hoa hồi, nhưng thực chất đó chính là quả hồi Lá, cuống hoa và quả có chứa rất nhiều tinh dầu

Hình 1.1 Hoa và lá cây hồi

Tài liệu cổ đại viết hồi có vị cay, tính ôn, vào 4 kinh can, thận tỳ và vị Có tác dụng đuổi hàn, kiện tỳ, khai vị, dùng chữa nôn mửa, đau bụng, bụng đầy chướng, giải độc của thịt cá Những người âm hư, hỏa vượng không dùng được

Theo kinh nghiệm dân gian, hoa hồi dùng trị cảm lạnh, sốt, nôn mửa, đau bụng, các bệnh về đường hô hấp như ho, hen, khử đờm Hồi có tính sát khuẩn nên được dùng diệt khuẩn không khí, xông thư giãn cơ thể…

Theo cố Giáo sư- TSKH Đỗ Tất Lợi đã viết trong tập “Những Cây thuốc

và vị thuốc Việt Nam”, thực vật hồi được xem là một vị thuốc lâu đời dùng trong

cả đông y và tây y

Trong đông y, hồi được sử dụng làm thuốc trung tiện, kích thích tiêu hóa, bồi bổ cơ thể phụ nữ sau sinh, giúp lợi sữa Tác dụng trên hệ thần kinh, cơ (giảm đau và chống co bóp) nên được dùng trong điều trị các bệnh như đau dạ dày, đau ruột do sự co bóp mạnh

Trong ẩm thực thì hồi còn được dùng làm rượu khai vị, gia vị, trong lĩnh vực dược mỹ phẩm thì hồi còn được sử dụng làm chất tạo hương liệu làm thơm thuốc đánh răng

Tuy nhiên hồi được sử dụng với một liều lượng vừa phải, theo sự hướng dẫn của lương y Nếu sử dụng với hàm lượng quá cao sẽ dẫn đến bị ngộ độc với các biểu hiện như say, run chân tay, sung huyết não và phổi, nặng sẽ dẫn tới co giật như động kinh [6]

Khoa học nghiên cứu và ứng dụng hoa hồi vào đời sống

Các công trình Khoa học đã nghiên cứu cho thấy thực vật hồi chứa nhiều tinh dầu, hàm lượng khoảng 2-3,5%, mùi thơm rất đặc trưng Trong tinh dầu hồi hoạt chất chính là anethol chiếm từ 70-90%, còn lại có a-pinen, d-pinen, l-phellandren, safrol, terpineol, limonene Thành phần hóa học cũng như tính chất của tinh dầu khác nhau ở các bộ phận lá, thân và quả hồi Ví dụ độ đông đặc của tinh dầu lá hơi kém hơn quả Hạt hồi không mùi, chưa dầu béo

Nghiên cứu về dược lý cho thấy, anethole có tác dụng làm tăng nhu động

dạ dày và ruột, làm dịu cơn đau bụng, tăng tiết dịch đường hô hấp Thường dùng làm thuốc hóa đàm, trị ho, cảm cúm…

Hồi còn có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm tốt Ức chế sự phát triển của trực khuẩn lao ở nồng độ thấp Dịch chiết cồn từ Đại hồi có tác dụng ức chế tụ cầu vàng, cầu khuẩn viêm phổi, trực bạch cầu, trực khuẩn subtilis, thương hàn, phó thương hàn, trực khuẩn lỵ Thường dùng trị nôn mửa và ỉa chảy, bụng đầy trướng, đau ruột sán khí (đau xuyên bụng dưới lên)

Dùng làm các loại thuốc chữa một số bệnh ngoài da liên quan đến các khuẩn và nấm gây bệnh

Tinh dầu Hồi cũng có tác dụng kích thích, làm dễ tiêu, chống co giật, ức chế sự lên men ruột, gây trung tiện, long đờm và lợi tiểu nhẹ, được dùng chữa đau bụng; là thành phần của thuốc ngậm chữa ho và là thuốc xoa bóp chữa thấp khớp, thuốc chữa đau tai, sát khuẩn, trị bệnh nấm da và ghẻ

Tinh dầu hồi có mùi thơm dễ chịu, trầm ấm và thanh tịnh nên được sử dụng để xông mang lại cảm giác thư thái, tĩnh tâm Đặc biệt những nơi thanh tịnh như ở Chùa, quán chay, thiền quán

Một số bài thuốc cụ thể

- Bài thuốc chữa cảm hàn, ho sốt, đau bụng thổ tả: Tán nhuyễn hồi hương thành bột mỗi lần sử dụng 2 gram bột uống cùng với rượu, ngày uống 3,4 lần Cách khác cũng rất hiệu quả và dễ sử dụng là uống mỗi lần 4 giọt tinh dầu hồi, ngày uống 3-4 lần

- Bài thuốc chữa các bệnh liên quan đến răng miệng như hơi thở có mùi hôi, miệng hôi: nhai nuốt, mỗi ngày vài cánh hoa hồi

- Bài thuốc chữa đau lưng: Quả hồi được bỏ hạt, sau đó ngâm nước muối cho thấm rồi tiến hành sao vàng thơm, tán nhỏ, mỗi lần dùng 6-10g chung với rượu Kết hợp sử dụng lá Ngải cứu nướng nóng rồi chườm vào lưng

- Bài thuốc chữa phù thũng, cổ trướng mạn tính: Dùng 2 gram hồi hương

và hạt 8 gram bìm bìm, tán bột, chia làm 2-3 lần uống trong ngày Uống trong

- Dùng làm thuốc xoa bóp ngoài da: quả hồi được ngâm với rượu, xoa bóp khi bị đau nhức khớp, xương, tê thấp

- Chữa rắn cắn: dùng lá hồi nhai nuốt nước, lấy bã đắp

- Bài thuốc kích thích sự tiêu hoá, nôn mửa: dân gian vẫn sử dụng hoa hồi sắc thành dạng nước Mỗi ngày dùng 4-8 gram dưới dạng thuốc sắc

- Hồi còn dùng làm thuốc diệt rận, rệp và là thành phần của thuốc bơm trừ sâu bọ cho gia súc

- Một số sản phẩm thủ công như: Túi hương hoa hồi treo xe, treo tủ quần

áo, bếp, treo nơi ngủ để bảo vệ trẻ em khỏi vi khuẩn có hại trong không khí…

Bên cạnh đó, nguyên liệu hồi đã và đang được nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực hương liệu cho dược phẩm, hóa mỹ phẩm và công nghệ thực phẩm Ví

dụ như rượu khai vị, thuốc đánh răng, gia vị các món ăn…

1.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu về hồi trong và ngoài nước

1.2.1 Trong nước

Từ lâu đời, hồi (Illicium verum Hook F.) là loại cây truyền thống đem lại

nguồn thu nhập cho nhân dân ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam như Lạng Sơn, Cao Bằng, Quảng Ninh Cung cấp nguyên liệu chủ yếu là quả hồi khô phục vụ nhu cầu về ẩm thực Đứng thứ hai là tinh dầu cất từ quả và quả sấy khô (thường gọi là hoa hồi) sử dụng chủ yếu trong lĩnh vực dược phẩm và hương liệu Ngày xưa, hai quốc gia đứng đầu và độc quyền trên thế giới về sản xuất và cung cấp

các sản phẩm của cây hồi là Trung Quốc và Việt Nam Tuy nhiên hiện nay, do giá trị kinh tế cao và nhu cầu thị trường ngày càng lớn, thì hồi đang được mở rộng vùng trồng một số nước châu Á như Nhật Bản, Philippin, Indonesia…

Tinh dầu hồi chủ yếu vẫn được chiết tách từ quả, tuy nhiên hiện nay nó là mặt hàng xuất khẩu trên thị trường có giá trị kinh tế rất cao (khoảng 750 USD/1kg) Hằng năm các nước trên thế giới đã tiêu thụ khoảng 25.000 tấn tinh dầu, trong đó có các nước châu Á tiêu thụ 28%, các nước châu Mĩ tiêu thụ 26%, các nước nam Mĩ tiêu thụ 14%, các nước châu Âu tiêu thụ 20%, còn lại ở các nước khác Như vậy, có thể thấy nhu cầu sử dụng tinh dầu hồi trên thế giới là rất cao, lượng tinh dầu được ly trích từ quả hồi không đáp ứng được nhu cầu sử dụng trong đó có hợp chất anethol nói riêng Nên nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm tổng hợp được chất Anethol bằng con đường nhân tạo, nhưng sản phẩm nhân tạo này có hàm lượng độc tố cao nên bị cấm hoặc sử dụng rất hạn chế

Tại Việt Nam, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Văn Hùng, Nguyễn Quyết Chiết - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã đưa ra quy trình chiết tách acid shikimic từ cao chiết cồn quả hồi Quy mô sản xuất lên đến 35kg/mẻ Dịch chiết cồn cồn 80% được cất thu hồi dung môi, phân tán cao chiết cồn vào nước Thêm dung môi ethylacetat để tách lớp tinh dầu Cô đặc cao nước thu được sau

đó hòa tan trong ethanol 95% nóng, Sử dụng than hoạt tính để loại bổ các tạp chất màu, trong hỗn hợp ethanol – ethyl acetae (3 : 1) ở 10oC cô đặc và kết tinh

Cùng thời điểm trên còn có 2 nhóm nghiên cứu của Viện Dược liệu và Đại học Dược Hà Nội cùng nghiên cứu chiết tách shikimic acid Trong đó đó có nhóm nghiên cứu của Nguyễn Đình Luyện và cộng sự (Đại học Dược Hà Nội, Tạp chí Dược học số 2/2006, tr 8-9) tiến hành và so sánh hai quy trình chiết soxlet bằng cồn 95o với chiết bằng nước ở 60oC, quy mô phòng thí nghiệm (50

và 100g quả hồi khô), tinh chế trên cột anionit chứa 50g amberlit và thu được shikimic acid với hiệu suất từ 5-6,8%

Năm 2007, từ quả hồi Việt Nam nhóm nghiên cứu thuộc Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã phân lập được 3,4-oxo-isopropylidene-shikimic acid với hiệu suất 0,006%, hợp chất này đang được nghiên cứu làm thuốc chữa bệnh tim mạch Xuất phát từ việc nghiên cứu hợp chất này, nhóm tác giả đã tiến hành tổng hợp thành công từ acid shikimic

Gần đây, nhóm nghiên cứu thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (Bùi Quang Thuật, Bùi Thị Bích Ngọc, Nguyễn Xuân Cường, Châu Văn Minh, Phan Thị Bình, Phan Văn Kiệm (2009), Tạp chí Hóa học, Vol 47(6B): 233-239)

đã phân lập được hợp chất phenylpropanoid glycosid mới từ quả hồi

1.2.2 Ngoài nước

Theo báo cáo của John Ruwiter: hàng năm nhu cầu sử dụng các sản phẩm

từ hồi trên toàn thế giới vào khoảng 70.000 tấn, trong đó các sản phẩm được sản xuất bởi Trung Quốc vào khoảng 50.000 tấn, khoảng 6.000 tấn được sản xuất bởi Việt Nam

Từ hạt hồi, bằng phương pháp chiết xuất khí carbon dioxide và xác định sắc kí khí-lỏng hiệu năng cao (GC-MS), nhóm tác giả thuộc Viện phát triển Dược liệu Quảng Tây đã phân lập được 24 acid béo Trong đó, 4 acid béo được xác định có hàm lượng lớn như sau: 9-octadecenoic (31,04%); 9,12-octadecadienoic (24,61%); hexadecanoic (21,22%) và Octadecanoic (11,08%)

Từ quả hồi (Illicium oligandrum Merr.et Chun) đã phân lập được 5 chất thuộc nhóm neolignan

Từ quả hồi các nhà nghiên cứu của Nhật Bản đã chiết xuất hỗn hợp glucosid và polysaccharid để sử dụng làm chất có tác dụng kích thích mọc tóc

Từ dịch chiết quả hồi đã tìm thấy các acid hữu cơ như: shikimic acid, protocatechic, anisatinic, isoanisatinic Trong đó, shikimic acid là hợp chất quan trọng nhất Shikimic acid 98% là chất rắn, kết tinh màu trắng, hàm lượng có thể xác định được bằng phương pháp HPLC Trong nước Shikimic acid hòa tan rất tốt, trong các dung môi hữu cơ như chlorofoc và benzene thì không hòa tan, điểm

nóng chảy là 183-185oC Khối lượng phân tử 174,15 Công thức phân tử:

C7H10O5 Shikimic acid có trong nhiều loài thực vật, là tiền chất để sinh tổng hợp alcaloid, acid amin vòng thơm và các dẫn xuất indol Đặc biệt được sử dụng làm nguyên liệu để tổng hợp oseltamivir phosphat (tamiflu)

Các hợp chất hóa học chính có trong I verum là phenylpropanoids,

flavonoid, neolignans, monoterpenoids và sesquiterpenoids

Thành phần chủ yếu của tinh dầu thu được từ quả I verum là hợp chất phenylpropanoid trans -anethole Hàm lượng trung bình của trans -anethole

trong tinh dầu I verum là khoảng 72–92% [6, 10, 17]

Các nghiên cứu đã xác nhận rằng hàm lượng trans -anethole trong tinh dầu

phụ thuộc vào phương pháp chiết xuất được áp dụng Wang và cộng sự [18] đã

phân tích ảnh hưởng của ba kỹ thuật chiết xuất đến hàm lượng chất dễ bay hơi: chưng cất hơi nước (SD), chiết xuất bằng dung môi (SE) và chiết xuất bằng chất

lỏng siêu tới hạn (SFE) Hàm lượng trans -anethole như sau: 70,61% (SE),

77,31% (SFE) và 74,96% (SD) Ngoài ra, hàm lượng cao nhất của các hợp chất hóa học khác và chất lượng tinh dầu tốt nhất đã đạt được sau SFE Trong một

cuộc điều tra khác của Sabry và các cộng sự [19], nội dung trans-anethole thu

được bằng phương pháp chưng cất hydro (HD) nhỏ hơn (47,16%) so với SFE

được sử dụng bởi Wang và cộng sự [18]

Theo nhóm nghiên cứu của Wei và cộng sự [20] chiết xuất quả I

verum bằng rượu methylic (MA), ethyl acetate (EA) và ether dầu (PE) Hiệu suất

tách trans -anethole không hiệu quả bằng chỉ đạt 7,5% (EA), 9,7% (MA) và

10,1% (PE)

Các hợp chất khác có trong tinh dầu của quả I verum là estragole ( p -allyl anisole, methyl chavicol) (~2%), limonene (~2%) và cis -anethole (~0,5%)

[21] Tinh dầu cũng chứa monoterpenoid (bao gồm α-pinene, p -cymene,

eugenol, linalool, camphene,-myrcene, trans -ocimene, terpinen-4-ol,

α-terpineol, γ-α-terpineol, terpinolene, và γ-terpinene ) và sesquiterpenoids (bao

gồm trans -α-bergamotene, α-copaene, cubebene, cyperene, (+)-9-epiledene,

β-elemene, phellandrene, foeniculin, caryophyllene, β-caryophyllene và muurolene) [9, 22] Ngoài ra, p-anisaldehyde, 2-(1-cyclopentenyl)-furan,

α-isobornyl thiocyanoacetate và trans -chalcone đã được phát [9, 22, 23] Cấu trúc

hóa học của một số hợp chất quan trọng trong tinh dầu I verum được thể hiện

trong Hình 1.2

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của các hợp chất chọn lọc của tinh dầu I verum

Tinh dầu I verum được đặc trưng bởi mùi giống như cam thảo và ngọt

ngào Hương vị của tinh dầu rất giống với hạt hồi hoặc dầu thì là, nhưng mạnh

hơn [16] Nhóm nghiên cứu của Hasegwa và cộng sự [24] phát hiện ra rằng hợp

chất chính của I verum, quyết định mùi thơm của nó là trans -anethole, có mùi

thảo mộc thơm Các tác giả cũng tuyên bố rằng sự hiện diện của các nhóm methoxy và methyl trong các vòng benzenoid cũng quyết định mùi thơm giống

như hoa hồi đặc trưng Theo nghiên cứu của Zhang và cộng sự [25] cũng xác

định rằng thành phần hương thơm chính của tinh dầu I verum là trans anethole, p -anisaldehyde, farnesol và estragole

-Ngoài tinh dầu, quả I verum còn chứa flavonoid, chẳng hạn như kaempferol

và quercetin và glycoside của chúng, với số lượng nhỏ [6] Hơn nữa, quả I

verum cũng chứa acid shikimic [6], acid béo như acid linoleic, stearic và myristic

[9] và alkylglucoside R -sec-butyl- D –glucopyranoside [6] Hai phenolic

glucoside cụ thể mới (E)4methoxy2(1′propen1′yl)phenol1 O α L

-arabinofuranosyl-(1‴→6″)-β - D -glucopyranoside và

(E)-4-methoxy-2-(1′-propen-1′-yl)-phenol-1-

Các dẫn xuất của trans -anethole, chẳng hạn như threo -anethole glycol

và erythro -anethole glycol, đã được phát hiện trong chiết xuất lá của I

verum [6] Hợp chất

seco-cycloartane-3,4-seco-(24Z)-cycloart-4(28),24-diene-3,26-dioic acid cũng được tìm thấy có trong lá, 26-methyl ester [22],

và hai biphenyl -type neolignans, cụ thể là verimol G và verimol H [28]

Từ rễ của I verum đã phân lập được Sesquiterpene lactones và các dẫn xuất của chúng (veranisatin A–C, tashironin, tashironin A, và 11- O -debenzoyl- 11- O -2-methylcyclopent-1-enecarboxytashironin) [6, 28] Ngoài ra, phenylpropanoit chẳng hạn như illiverin A, 4-allyl-2-(3-methylbut-2-enyl)-1,6-methylenedioxybenzene-3-ol, illicinole, 3-hydroxy-4,5-methylenedioxyallyl-benzene, (−)-illicinone-A, và 4-allyl-4-(3-methylbut-2-enyl)-1,2-methylenedioxycyclohexa-2,6-dien-5-one được phân lập từ chiết xuất trong

ethanol của rễ loài này [27]

1.3 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học

1.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn

Yang và cộng sự [29] đã báo cáo rằng các chất chiết xuất trong ethanol của

quả I verum thể hiện hoạt tính kháng khuẩn chống lại các chủng phân lập kháng

thuốc lâm sàng, cụ thể là Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa và

vi khuẩn S aureus với các giá trị MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) là 0,15, 0,70 và 0,11 μg/mL, tương ứng

Benmalek và cộng sự [30] so sánh tác dụng kháng khuẩn của chiết xuất I

verum chống lại hai chủng vi khuẩn Gram dương ( S aureus ATCC 25923 và S

aureus ATCC 43300) và hai chủng vi khuẩn Gram âm ( P aeruginosa ATCC27852 và E coli ATCC 25992

Nghiên cứu của Luis và cộng sự [21] đã chứng minh rằng tinh dầu của I

verum thể hiện hoạt tính kháng khuẩn chống lại A baumannii LMG1025 và

LMG1041, với các giá trị MBC (nồng độ diệt khuẩn tối thiểu) lần lượt là 16 và

8 μg/mL

Yang và cộng sự [31] đã nghiên cứu hoạt động kháng khuẩn của chiết

xuất I verum từ lá và cành cây chống lại chín chủng kháng kháng sinh bao

gồm Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và Acinetobacter baumannii Nó đã được tiết lộ rằng SFE (siêu tới hạn CO2 chiết xuất) chiết xuất

cả từ cành và lá thể hiện hoạt tính kháng khuẩn rộng hơn chống lại tất cả các chủng được thử nghiệm so với chiết xuất TSE (chiết xuất bằng dung môi truyền thống) DIZ (vùng ức chế đĩa) cho chiết xuất SFE bằng 9–22 mm Hơn nữa, kết quả của thử nghiệm khuếch tán đĩa tiết lộ rằng chiết xuất SFE thể hiện hoạt tính mạnh hơn TSE (MIC = 0,1–4,0 mg/mL; MBC = 0,2–4,5 mg/mL) Ngoài ra,

hoạt tính kháng khuẩn cũng được đánh giá do chính các hợp chất trong I

verum: trans-anethole, anisyl aldehyde, anisyl acetone và anisyl

alcohol Nghiên cứu đã chỉ ra rằng trans-anethole thể hiện hoạt động kháng

khuẩn chỉ chống lại A baumanniichủng (MIC ≤ 0,1 mg/mL; MBC = 0,1 mg/mL) Trong trường hợp của các hợp chất còn lại (anisyl aldehyde, anisyl acetone, anisyl alcohol) hoạt tính kháng khuẩn rộng hơn (MIC = 1,5–5,0 mg/mL; MBC = 2,5–6,5 mg/mL)

Sabri và cộng sự [19] đã đánh giá các hoạt động kháng khuẩn của chiết xuất

dầu dễ bay hơi I verum và chiết xuất nước chống lại bốn chủng vi

khuẩn: Escherichia coli , Bacillus cereus , Salmonella typhi và S aureus Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng chiết xuất dầu dễ bay hơi cho thấy hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn chiết xuất nước (MIC = 6,6–10,0 μL SAF/mL và MIC = 16,4–29,6 μL SAF/mL, tương ứng)

Nhóm nghiên cứu của Li và cộng sự [32] đã đánh giá hoạt tính kháng khuẩn

của tinh dầu I verum, cũng như anisic acid và shikimic acid, có trong quả I

verum Hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá chống lại hai vi khuẩn Gram

dương: S aureus (MRSA) và S pyogenes, và ba vi khuẩn Gram âm: E coli , S

typhi và P aeruginosa Người ta nhận thấy rằng anisic acid (MIC = 400–2000

μg/mL) và shikimic acid (MIC = 400–1600 μg/mL) hiệu quả hơn tinh dầu I

verum (MIC = 1000–1600 μg/mL)

1.3.2 Hoạt động kháng nấm

Huang và cộng sự [22] đã kiểm tra hoạt tính kháng nấm của tinh dầu thu được

từ quả I verum cũng như thành phần chính của nó (trans -anethole) chống lại 11

loài nấm gây bệnh thực vật (Alternaria solani , Bipolaris maydis, Botryodiplodia theobromae, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum f sp cucumerinum, F oxysporum f sp lycopersici, F oxysporum f sp vasinfectum, Magnaporthe oryzae, Pythium aphanidermatum, Rhizoctonia ngũ cốc và Rhizoctonia

solani) Các tác giả lưu ý rằng cả tinh dầu và trans -anethole đều có tác dụng kháng

nấm mạnh Bên cạnh đó, họ cho rằng hoạt tính kháng nấm của tinh dầu có thể là do

sự hiện diện của trans -anethole

Dzamic và cộng sự [33] đã nghiên cứu hoạt tính kháng nấm của tinh dầu I

verum chống lại mười chín loài nấm (gây bệnh cho người, thực vật và thực

phẩm), cụ thể là: Alternaria alternata, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus flavus, Aspergillus terreus , Aspergillus versicolor, Aureobasidium pullulans, Candida albicans, Cladosporium cladosporioides, Cladosporium fulvium, Fusarium tricinctum, Fusarium sporotrichioides, Mucor mucedo, Penicillium funiculosum, Penicillium ochrochloron, Phomopsis helianthi, Phoma macdonaldi, Trichoderma viride và Trichophyton mentagrophytes Trong số các loài nấm này, các tác giả

đã quan sát thấy hoạt tính kháng nấm mạnh nhất đối với A alternata, A pullulans, C cladosporioides, C fulvium và P helianthi (MIC = 2,5 µg/mL)

Yazdani và cộng sự [34] đã thử nghiệm đặc tính kháng nấm của chiết xuất

ethanol của hạt P anisum và quả I verum chống lại năm loài nấm: A niger, C

albicans, Epidermophyton fluccosum, Microsporum canis và T

mentagrophytes Kết quả của họ cho thấy chiết xuất của quả I verum thể hiện

hoạt tính ức chế mạnh hơn đối với tất cả các loài được thử nghiệm (MIC = 4–16 mg/mL; nồng độ diệt nấm tối thiểu (MFC) = 8–256 mg/mL) so với chiết xuất của hạt hồi

Aly và cộng sự [35] đã phân tích hoạt tính kháng nấm của tinh dầu I

verum đối với ba loài nấm: A flavus, Aspergillus parasiticus và Fusarium

moniliforme Các tác giả lưu ý rằng tinh dầu ức chế sự phát triển của tất cả các loài được thử nghiệm theo cách phụ thuộc vào liều lượng Sự ức chế hoàn toàn

sự tăng trưởng của A flavus và A parasiticus được quan sát thấy ở 200 ppm và của F moniliforme ở 400 ppm Hơn nữa, họ đã điều tra hoạt động chống nhiễm

độc của I Verum tinh dầu chống lại tất cả các chủng nấm đã thử nghiệm và phát

hiện ra rằng phần trăm ức chế độc tố nấm mốc phụ thuộc vào nồng độ của tinh dầu, với khả năng ức chế 100% được ghi nhận ở 200 ppm

Sabri và cộng sự [19] đã đánh giá các hoạt động kháng nấm của chiết xuất

dầu dễ bay hơi I verum và chiết xuất nước chống lại bốn chủng nấm: A

ochraceous, A carbonarius, F.oxysporum, P chrysogenum Nó đã được tiết lộ rằng chiết xuất dầu dễ bay hơi cho thấy hoạt tính kháng nấm thấp hơn so với chiết xuất nước (MFC = 133,8–178,8 SAF/mL và MFC = 52,6–73,4 μL SAF/mL, tương ứng)

1.3.3 Hoạt động chống oxy hóa

Luis và cộng sự [21] đã đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu I

verum bằng cách sử dụng xét nghiệm quét gốc tự do

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) Các tác giả nhận thấy rằng tinh dầu thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh (IC50 (nồng độ ức chế tối thiểu) = 3,46%), điều này có liên quan đến hàm lượng cao phenylpropanoids (92,2%) bao gồm cả trans -

anethole Họ cho rằng các liên kết đôi của trans -anethole và tác dụng hiệp đồng của các thành phần khác nhau của tinh dầu I verum đã góp phần vào hoạt động

chống oxy hóa quan sát được

Dinesha và cộng sự [36] đã phân tích hoạt tính chống oxy hóa của chiết xuất

nước từ bột quả I verum và nhận thấy rằng ở nồng độ 25 µg/mL, dịch chiết thể

hiện hoạt tính chống oxy hóa đáng kể chống lại H2O2 và bảo vệ chống lại tổn thương DNA Các tác giả cũng đã nghiên cứu tiềm năng chống oxy hóa bằng cách sử dụng xét nghiệm DPPH và báo cáo rằng hoạt tính chống oxy hóa của chiết xuất được nghiên cứu có liên quan đến hàm lượng polyphenol cao

Cheng-Hong và cộng sự [37] đã thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa của

chiết xuất ethanolic của bột quả I verum, được phân đoạn bằng hexane, ethyl

ether, chloroform, ethyl acetate và CO2 siêu tới hạn, bằng phép thử DPPH Họ phát hiện ra rằng các phân đoạn ethyl ether và ethyl acetate cho thấy khả năng chống oxy hóa cao nhất (IC50 = 57,43 và 38,60 ppm, tương ứng) Ngoài ra, phần ethyl acetate có tổng hàm lượng phenolic và flavonoid tổng cao nhất, có thể liên quan đến tác dụng chống oxy hóa đã được xác nhận của chất chiết xuất

Li và cộng sự [32] đã đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu I

verum, cũng như acid anisic và acid shikimic Hoạt tính chống oxy hóa được

đánh giá bằng xét nghiệm DPPH cho thấy rằng dầu hồi, acid anisic và acid shikimic thể hiện hoạt tính chống oxy hóa nhẹ so với hydroxytoluene butylat hóa (BHT) (IC 50 = 1,32 mg/mL), với IC 50 tương ứng với 9,88, 8,04 và tương ứng là 8,96 mg/mL

1.3.4 Hoạt động chống viêm

Sung và cộng sự [38] đã xác nhận hoạt động chống viêm của chiết xuất

ethanolic của quả I verum đối với dòng tế bào tế bào sừng của con người

(HaCaT) Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chất chiết xuất đã ngăn chặn sự biểu hiện mRNA của các cytokine tiền viêm IL-6 và IL-1β do TNF-α/IFN-γ gây ra Hơn nữa, chiết xuất quy định việc kích hoạt các chemokine TARC/CCL17 và MDC/CCL22 Ngoài ra, sự chuyển vị của nhân tố hạt nhân NF-κB vào nhân tế

bào, quá trình phosphoryl hóa và thoái hóa iκBα đều bị ức chế Trans -anethole được phân lập từ chiết xuất I verum (~2,14%) cũng cho thấy hoạt tính chống

viêm bằng cách giảm biểu hiện protein của TARC, MDC và các cytokine IL-6

và IL-1β

1.4 Những nghiên cứu chuyển hóa trans- anethol thành dẫn xuất

Năm 2005 Rosemayre S Freire và các cộng sự tổng hợp thành công một

số dẫn xuất của trans -anethole [1-methoxy-4-(1-propenyl)-benzen] bằng cách

đưa các nhóm hydroxyl vào liên kết đôi của nửa propenyl Hai loại phản ứng đã được thực hiện: (i) oxy hóa/khử thủy ngân tạo thành hai sản phẩm, dẫn xuất mono-hydroxyl, 1-hydroxy-1-(4-methoxyphenyl)-propane (2) và ở mức độ thấp

hơn là dẫn xuất dihydroxyl, 1, Phản ứng epoxid hóa

2-dihydroxy-1-(4-methoxyphenyl)-propane (3) và (ii) với acid m -chloroperbenzoic cũng tạo thành hai sản phẩm là dẫn xuất dihydroxyl (3) và chất tương ứng m -chloro-benzoic

acid mono-ester, 1-hydroxy-1(4-metoxyphenyl)-2- m-chlorobenzoyl-propan

(4) Cấu trúc của các hợp chất này được xác nhận chủ yếu bằng dữ liệu phổ khối

lượng, IR, 1 H và 13 C NMR Hoạt tính của anethole và các dẫn xuất hydroxyl hóa được đánh giá bằng các xét nghiệm chống oxy hóa, chống viêm và bảo vệ

dạ dày Các hợp chất (2) và (3) là chất chống oxy hóa hoạt động mạnh hơn (1)

và (4) Trong thử nghiệm chống viêm, anethole cho thấy hoạt tính thấp hơn so

với các dẫn xuất hydroxyl hóa Anethole và ở mức độ thấp hơn là các dẫn xuất

của nó 2 và 4 cho thấy hoạt động bảo vệ dạ dày đáng kể Tất cả các hợp chất

được thử nghiệm không làm thay đổi đáng kể tổng số tế bào bạch cầu

Sơ đồ 1.1 Tổng hợp một số dẫn xuất hydroxyl của trans- anethol

Năm 2011 Jiang Ping cùng các cộng sự đã tổng hợp thành công hai dẫn xuất của anethol là 2-(4-methoxyphenyl)-3-methyl oxiran và 1-(4-methoxy

phenyl)-2-propanol với hiệu suất tổng hợp 2-(4-methoxyphenyl)-3-methyl oxiran lên đến 91% Cấu trúc của hai hợp chất này được xác định bằng phổ IR

và GC-MS

Sơ đồ 1.2 Tổng hợp 2-(4-methoxyphenyl)-3-methyl oxiran và 1-(4-methoxy

phenyl)-2-propanol từ trans-anethol

Bằng phản ứng cộng vòng 1,3 lưỡng cực Yahya Ben Soumane và cộng sự

(2021) đã tổng hợp thành công 3 dẫn xuất pyrazole thế bốn 1,3,4,5 của trans-

anethole Phản ứng tạo ra một đồng phân regio duy nhất Cấu trúc của các hợp chất này đã được nghiên cứu bằng phương pháp quang phổ khác nhau như 1H,

13C NMR và HRMS

Dẫn xuất 1,2-pyrazolin 3 được tổng hợp bằng phương pháp được mô tả

trong sơ đồ 1.3 Hỗn hợp (1,28 mmol) của trans-anethole 1 và của acid

N-phenylarylohydrazonic tương ứng tiền chất clorua 2 trong dung môi (diclomethan, cloroform, hoặc benzen) (15 mL), thêm từng giọt trietylamin (1,35 mmol) Hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ và theo dõi diễn biến của phản ứng bằng TLC Sau đó Kết thúc phản ứng, thu hồi dung môi được dưới áp suất giảm Pha hữu cơ được làm khô bằng sodium sulfat khan, sau

đó lọc và cô đặc dưới áp suất giảm để thu được sản phẩm thô Dầu thô thu được Sản phẩm được tinh chế bằng silica gel CC sử dụng hexan/ethyl acetate (9:1 v/v)

để tách pyrazolin

Sơ đồ 1.3 Tổng hợp dẫn xuất pyrazole thế bốn 1,3,4,5 của trans- anethol

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2.1 Chuẩn bị nguyên liệu

Đối tượng nghiên cứu là tinh dầu hồi được ly trích từ thân, thu hái tại huyện Trà Lĩnh của tỉnh Cao Bằng Nguyên liệu được thu hái vào tháng 5, từ 7-

8 giờ sáng Yêu cầu thân hồi không bị dập, không héo úa, sâu bệnh, rửa sạch và tráng lại bằng nước cất, sau đó cắt nhỏ và cho vào dụng cụ chưng cất lôi cuốn hơi nước

2.2 Ly trích tinh dầu hồi

Tinh dầu hồi được ly trích bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp

+ Chuẩn bị các mẫu nguyên liệu tươi với khối lượng100g mỗi mẫu

+ Bổ sung nước cất đến tỉ lệ: nguyên liệu÷ nước là 1÷6

Các mẫu nguyên liệu và nước được cho vào bộ chưng cất tinh dầu nhẹ với thể tích 1000 ml Tiến hành chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp trong thời gian thích hợp để thu tinh dầu Thời gian chiết tách được tính từ khi bắt đầu có giọt dầu ngưng tụ đầu tiên Sau khoảng thời gian là 10 phút tiến hành ghi thể tích tinh dầu trong ống đựng, ngừng cất khi thể tích tinh dầu không tăng nữa

Đo lại thể tích tinh dầu cực đại để xác định hàm lượng tinh dầu (ml/l00g) Chiết lấy tinh dầu thô, làm khan bằng Na2SO4 khan, xử lý lọc và bảo quản trong

lọ thủy tinh tối màu ở nhiệt độ 6°C (trong ngăn mát tủ lạnh) để tiến hành các thử

nghiệm tiếp theo

2.3 Xác định thành phần hóa học của tinh dầu

Mẫu tinh dầu thân hồi được phân tích bằng thiết bị sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS tại khoa Hóa học trường Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội: Agilent, GC 7890A - MS 5975C Cột HP5 (30m; 0,25mm; 0,25pm) Sử dụng khí mang là He Nhiệt độ buồng bơm mẫu là 250°C, nhiệt

độ đầu dò 280°C Tỉ lệ chia dòng 1:20, mẫu được pha loãng trong hexane, thể tích tiêm 1µl Chương trình nhiệt: nhiệt độ đầu 90°C, tăng 8°C/phút đến

280°C, giữ 5 phút, sử dụng thư viện phổ NIST 2011 của máy để định danh các cấu tử trong mẫu tinh dầu

Phương pháp sắc ký khí – quang phổ khối (GC-MS) là phương pháp được

sử dụng để nghiên cứu các mẫu chất lỏng, khí hoặc rắn Cơ sở lý thuyết của phương pháp này là kết hợp các tính năng của sắc ký khí và quang phổ khối để phân tích thành phần các cấu tử trong mẫu nghiên cứu Tính ưu việt của phương pháp này là cho phép phát hiện lượng vế của chất đó trong mẫu thử

Cũng đồng thời qua thiết bị này có thể phân lập và định lượng được các hợp chất hóa học Điều này làm cho hệ thống sắc ký khí – quang phổ khối trở nên lý tưởng cho việc phân tích hàng trăm hợp chất trọng lượng phân tử tương đối thấp được tìm thấy trong các vật liệu môi trường

Bước đầu tiên trong quá trình phân tích bằng máy sắc ký khí là mẫu được hóa hơi hoàn toàn thành pha khí Sau đó được phân tách trên cột mao quản được phủ một pha tĩnh (lỏng hoặc rắn) Các hợp chất này được đẩy bằng khí mang trơ như heli, hydro hoặc nitơ Khi các thành phần của hỗn hợp được tách ra, mỗi hợp chất sẽ rửa giải khỏi cột vào thời điểm khác nhau tùy theo điểm sôi và độ phân cực của nó Thời gian rửa giải được gọi là thời gian lưu của hợp chất Sắc kí khí có khả năng phân giải các hỗn hợp phức tạp hoặc dịch chiết mẫu chứa hàng trăm hợp chất

Khi các thành phần rời khỏi cột sắc kí khí, chúng sẽ bị ion hóa và phân mảnh bằng máy quang phổ khối nhờ sử dụng nguồn ion hóa điện tử hoặc hóa học Các phân tử và mảnh bị ion hóa sau đó được tăng tốc thông qua máy phân tích khối lượng của thiết bị, thường là bẫy tứ cực hoặc bẫy ion Ở đây các ion

được phân tách dựa trên tỷ lệ khối lượng trên điện tích (m/z) khác nhau của

chúng Việc thu thập dữ liệu GC-MS có thể được thực hiện ở chế độ quét toàn

bộ, để bao quát nhiều tỷ lệ m/z hoặc chế độ giám sát ion (SIM) đã chọn, để thu

thập dữ liệu cho khối lượng quan tâm cụ thể

Các bước cuối cùng của quy trình liên quan đến việc phát hiện và phân tích ion, với các ion phân mảnh xuất hiện dưới dạng hàm số theo tỷ lệ m/z của

chúng Trong khi đó, diện tích pic tỷ lệ thuận với lượng hợp chất tương ứng Khi một mẫu phức tạp được phân tách bằng GC-MS, nó sẽ tạo ra nhiều pic khác nhau trong sắc ký đồ khí và mỗi pic tạo ra một phổ khối duy nhất được sử dụng để nhận dạng hợp chất Bằng cách sử dụng các thư viện phổ khối có sẵn trên thị trường, các hợp chất chưa biết và chất phân tích mục tiêu có thể được xác định

và định lượng

Thành phần hóa học của các mẫu đã được xác định bằng cách so sánh với tài liệu tham khảo về chỉ số IR và thư viện của Viện tiêu chuẩn và Công nghệ Quốc gia (NIST)

2.4 Thử hoạt tính kháng khuẩn trên đĩa thạch

Các chủng vi khuẩn gây bệnh được lựa chọn để thử nghiệm là:

Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng) gây bệnh ngoài da; Pseudomonas

aeruginosa (Trực khuẩn mủ xanh); Escherichia coli Các chủng vi khuẩn này

được phòng thí nghiệm Vi sinh của Khoa Sinh học thuộc Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên phân lập và nuôi cấy Các chủng khuẩn được bảo quản trong điều kiện lạnh sâu

Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu theo Hadacek

và cộng sự (2000) Khả năng kháng khuẩn được đánh giá bằng đường kính vòng kháng khuẩn Chuẩn bị các chủng vi khuẩn

+ Vi khuẩn được nuôi cấy và lưu trữ bảo quản dưới nhiệt độ thấp 4oC Chọn 1 khuẩn lạc từ ống lưu trữ đưa vào ống nghiệm chứa 2ml môi trường LB, nuôi lắc ở 370C trong 14- 16h

+ Sử dụng phương pháp đo mật độ quang (OD) để đo mật độ vi khuẩn sau khi nuôi cấy trong môi trường LB Bước sóng thích hợp là 625nm

+ Tiến hành đổ thạch trong môi trường LB, để nguội Sử dụng dụng cụ chang đã được tiệt trùng tạo khuẩn lạc trên môi trường thạch LB

Để thử hoạt tính trên đĩa petri, bước đầu tiên là cấy trải 200 μL dịch khuẩn, nồng độ tương đương 4-5.108 CFU/ml lên bề mặt thạch có chứa môi trường LB