Nghiên cứu phân lập cấu trúc và hoạt tính sinh học của polysaccharide từ quả bí đỏ chi cucurbita

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu phân lập, cấu trúc hoạt tính sinh học polysaccharide từ bí đỏ chi Cucurbita ĐỖ THỊ BIỂN bien.dt211204m@sis.hust.edu.vn Ngành Kỹ thuật hóa học Giảng viên hướng dẫn: TS Hồ Đức Cường Chữ ký GVHD PGS TS Thành Thị Thanh Thủy Chữ ký GVHD Viện: Kỹ thuật Hố học HÀ NỘI, 05/2023 CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn : Đỗ Thị Biển Đề tài luận văn: Nghiên cứu phân lập, cấu trúc hoạt tính sinh học polysaccharide từ bí đỏ chi Cucurbita Chuyên ngành: Kỹ thuật hóa học Mã số SV: 20211204M Tác giả, Người hướng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hội đồng ngày 14/04/2023 với nội dung sau: - Chỉnh sửa lại lỗi tả, lỗi đánh máy, lỗi in ấn toàn - Chỉnh sửa lại phần Kết luận: Tại phần kết luận 3, 4, ghi rõ “Polysaccharide P2” thay cho từ “Polysaccharide này” - Tài liệu tham khảo: Sửa lại cách viết cho thống nhất, khớp lại trích dẫn cho phù hợp với số thứ tự tài liệu tham khảo - Chương 1: Tổng quan: Phân chia lại việc phân nhóm chất cho phù hợp - Chương 4: Kết thảo luận: Kết nghiên cứu cấu trúc: Sửa lại cho phù hợp với tín hiệu thu Ngày Giáo viên hướng dẫn tháng năm Tác giả luận văn TS Hồ Đức Cường Đỗ Thị Biển PGS TS Thành Thị Thu Thủy CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG PGS TS Vũ Đình Hồng Mẫu 1c ĐỀ TÀI LUẬN VĂN Nghiên cứu phân lập, cấu trúc hoạt tính sinh học polysaccharide từ bí đỏ chi Cucurbita Giáo viên hướng dẫn Ký ghi rõ họ tên TS Hồ Đức Cường PGS TS Thành Thị Thu Thủy Lời cảm ơn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới TS Hồ Đức Cường PGS TS Thành Thị Thu Thủy tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tơi xin cảm ơn thầy Viện Kỹ thuật Hóa học- Đại học Bách Khoa Hà Nội nói chung, Bộ mơn Cơng nghệ Hóa dược Bảo vệ thực vật nói riêng ln tạo điều kiện giúp tơi hồn thành học phần luận văn thủ tục cần thiết Tôi xin cảm ơn Trung tâm Các phương pháp phổ ứng dụng- Viện Hóa học- Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thời gian trang thiết bị để hồn thành luận văn Tóm tắt nội dung luận văn Polysaccharide từ bí đỏ có tính chất đặc biệt hoạt tính sinh học phong phú nên sử dụng rộng rãi nhiều ngành kinh tế Việc sâu vào nghiên cứu thành phần hóa học, cấu trúc hoạt tính sinh học polysaccharide từ bí đỏ thuộc chi Cucurbita nhằm góp phần hoàn thiện hướng nghiên cứu mở rộng khả ứng dụng nguồn bí đỏ Việt Nam Luận văn gồm phần chính: Tổng quan tài liệu ngồi nước bí đỏ chi Cucurbita Phân lập khảo sát hoạt tính sinh học polysaccharide từ mẫu thịt bí đỏ chi Cucurbita (Cucurbita moschata D Cucurbita pepo L.) Xác định thành phần cấu trúc 01 polysaccharide phân lập Qua trình nghiên cứu, phương pháp chiết thường quy, phương pháp sắc ký (GPC) phổ (IR, NMR) khảo sát hoạt tính sinh học theo quy trình cơng bố thu kết sau: Phân lập tinh chế polysaccharide từ bí đỏ lồi C moschata D C pepo L với 02 phương pháp chiết khác Polysaccharide thu có hoạt tính chống oxy hóa, hoạt tính hạ đường huyết tốt Polysaccharide phân lập từ loài C moschata D phương pháp chiết acid thuộc dạng pectin Cấu trúc hóa học gồm mạch cấu thành acid poly-α(1→4)-ᴅ-Galacturonic α-L-Rhamnopyranose, mạch nhánh Galactose liên kết với mạch vị trí C-2 Galacturonic Pectin có độ methoxyl hóa thấp với DE= 23.3 HỌC VIÊN Ký ghi rõ họ tên Đỗ Thị Biển MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan họ bầu bí Chi Cucurbita Loài Cucurbita moschata D Cucurbita pepo L 1.2 Thành phần hóa học có bí đỏ Polysaccharide Các chất khác 1.3 Nguồn lợi bí đỏ 14 1.4 Polysaccharide polysaccharide chiết xuất từ bí đỏ 15 Tổng quan polysaccharide 16 Polysaccharide từ bí đỏ 18 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.2 Hóa chất thiết bị 23 Hóa chất 23 Thiết bị 23 2.3 Phương pháp chiết tách 24 Phương pháp chiết 24 Cơ sở phương pháp chiết 24 Quá trình chiết thực vật 24 2.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học 26 Đánh giá mơ hình động vật thực nghiệm (in vivo) 26 Ức chế enzyme α-glucosidase 26 2.5 Phương pháp xác định cấu trúc 27 Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) 27 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) 27 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 28 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 30 3.1 Thu thập xử lí mẫu 30 Mẫu tưới 30 Mẫu khô 30 3.2 Chiết tách tinh chế polysaccharide từ bí đỏ chi Cucurbita 30 Chiết nước 30 Chiết acid 31 Tinh chế polysaccharide thô 32 3.3 Xác định thành phần hóa học polysaccharide 32 Xác định thành phần đường 32 Xác định hàm lượng uronic acid 33 3.4 Đánh giá hoạt tính sinh học .33 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 33 Đánh giá hoạt tính chống tiểu đường 33 3.5 Xác định cấu trúc .35 Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) 35 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) 35 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 35 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 4.1 Kết chiết tách polysaccharide từ bí đỏ chi Cucurbita 36 4.2 Kết phân tích thành phần hóa học 37 4.3 Kết đánh giá hoạt tính sinh học 38 Kết đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 38 Kết đánh giá hoạt tính chống tiểu đường 38 4.4 Kết nghiên cứu cấu trúc 40 Kết trọng lượng phân tử phân bố trọng lượng phân tử 40 Kết nghiên cứu cấu trúc 40 HƯỚNG PHÁT TRIỂN CỦA ĐỀ TÀI TRONG TƯƠNG LAI 47 KẾT LUẬN 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC PHỔ CÁC HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP ĐƯỢC 56 PHỤ LỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CÔNG BỐ TRONG KHUÔN KHỔ LUẬN VĂN 71 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ 76 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1 Hình ảnh số lồi bí đỏ Việt Nam Hình 1.2 Polysaccharide phân lập từ dịch chiết kiềm bí đỏ Hình 1.3 Dự đoán nhu cầu sử dụng pectin Mỹ giai đoạn 2014÷2025 15 Hình 1.4 Một số đơn vị monosaccharide thường gặp 16 Hình 1.5 Các cấu trúc khơng gian Galactose 17 Hình 1.6 Pectin dẫn xuất 19 Hình 1.7 Khả chống DPPH polysaccharide bí đỏ vitamin C 21 Hình 1.8 Tác dụng chống lại gốc tự –OH polysaccharide bí đỏ vitamin C 22 Hình 2.1 Đặc điểm mẫu bí C moschata D (a) C pepo L (b) nghiên cứu 23 Hình 2.2 a, Hệ thống chiết nóng hồi lưu-b, Hệ thống chiết nóng kết hợp cánh khuấy 25 Hình 3.1 Xử lý mẫu bí đỏ 30 Hình 4.1 Phổ NMR polysaccharide P1 phân lập 36 Hình 4.2 Phổ NMR polysaccharide P2 phân lập 37 Hình 4.3 Phổ NMR polysaccharide P3 phân lập 37 Hình 4.4 Phổ NMR polysaccharide P4 phân lập 37 Hình 4.5 Sắc ký đồ GPC polysaccharide phân lập 40 Hình 4.6 Phổ IR pectin phân lập từ bí đỏ chi Cucurbita 41 Hình 4.7 Phổ 1H NMR a) 13C NMR b) pectin phân lập 42 Hình 4.8 Phổ COSY pectin phân lập 43 Hình 4.9 Phổ HSQC pectin phân lập 44 Hình 4.10 Phổ HMBC pectin phân lập 45 Hình 4.11 Cấu trúc pectin P2 phân lập từ dịch chiết acid C moschata D 46 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Sơ đồ khối thiết bị GPC 27 Sơ đồ 3.1 Sơ đồ chiết nước thịt bí đỏ chi Cucurbita 31 Sơ đồ 3.2 Sơ đồ chiết acid thịt bí đỏ chi Cucurbita 32 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Độ chuyển dịch hóa học δ (ppm) từ sở liệu sugabase dạng glucose, galactose xylose dung môi D2O 29 Bảng 4.1 Kết phân lập polysaccharide từ bí đỏ chi Cucurbita 36 Bảng 4.2 Kết thử hoạt tính chống oxy hóa P2 phân lập 38 Bảng 4.3 Khối lượng chuột trước sau thí nghiệm 38 Bảng 4.4 Nồng độ đường huyết máu chuột trước sau thí nghiệm 39 Bảng 4.5 Khả ức chế enzyme α-glucosidase mẫu nghiên cứu 39 Bảng 4.6 Kết phân tích IR pectin bí đỏ 41 Bảng 4.7: Các thành phần đường P2 43 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải BALB Balb Chủng chuột bạch tạng ni cấy phịng thí nghiệm BHA Butylated HydroxyAnisole Butylated HydroxyAnisole BHT Butylated HydroxyToluene Butylated HydroxyToluene 13 Carbon-13 nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C resonance spectroscopy C-NMR COSY Correlation spectroscosy Phổ COSY DE Dextrose Equivalent Đương lượng Dextrose- Số g đương lượng D-glucoza 100g chất khô sản phẩm DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DSS Sodium 2,2-Dimtely-2- Sodium 2,2-Dimtely-2Silapentane-5Sulfonate Silapentane-5Sulfonate GalA Galacturonic Acid Galacturonic Acid Gal Galactose Galactose Galp Galactopyranose Galactopyranose GPC Gel Permeation Chromatography Sắc ký thẩm thấu gel Gluc Glucose HMBC Heteronuclear Cohence Proton nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H resonance spectroscopy H- NMR Glucose Mutiple Bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết HG Homogalacturonan Homogalacturonan HSQC Heteronuclear single- quantum Phổ tương tác dị hạt nhân qua coherence liên kết IC50 Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm IR Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại LM Low Methoxyl Methoxyl thấp Mn Number average molecular mass Khối lượng phân tử trung bình số Mw Weight average molecular mass Khối lượng phân tử trung bình khối NMR Nuclear magnetic spectroscopy resonance RID Refractive Index Detector Detector số khúc xạ TFA Trifluoroacetic acid Trifluoroacetic acid Phổ cộng hưởng từ hạt nhân A.4 Phổ HMBC 63 64 65 66 A.5 Phổ HSQC 67 68 69 A.6 Sắc ký đồ GPC 70 PHỤ LỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CƠNG BỐ TRONG KHUÔN KHỔ LUẬN VĂN Quach Thi Minh Thu, Do Thi Bien, Ho Duc Cuong, Ngo Van Quang, Le Thi Hong Nhung, Thanh Thi Thu Thuy “Chiết tách đặc trưng cấu trúc polysaccharide từ bí đỏ Cucurbita moschata”, đăng tạp chí Khoa học & Cơng nghệ trường Đại học Công nghiệp Hà Nội, P-ISSN 1859-3585, E-ISSN 2615-9619 71 72 73 74 75 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Đề tài: Nghiên cứu phân lập, cấu trúc hoạt tính sinh học polysaccharide từ bí đỏ chi Cucurbita Tác giả luận văn: Đỗ Thị Biển Khóa: CH2021A Người hướng dẫn: TS Hồ Đức Cường PGS TS: Thành Thị Thu Thủy - Từ khóa (Keyword): Pumpkin, polysaccharide, Cucurbita, extraction, structural characteristics Nội dung tóm tắt: a) Lý chọn đề tài Polysaccharide từ bí đỏ có tính chất đặc biệt hoạt tính sinh học phong phú nên sử dụng rộng rãi nhiều ngành kinh tế Trên giới, polysaccharide từ bí đỏ nghiên cứu tương đối nhiều, Việt Nam polysaccharide từ bí đỏ chưa có nhiều công bố Do vậy, việc nghiên cứu polysaccharide từ bí đỏ thuộc chi Cucurbita nhằm sâu vào nghiên cứu thành phần hóa học, cấu trúc có đánh giá vai trị hoạt tính sinh học polysacharide có nguồn gốc từ thịt bí đỏ chi Cucurbita để góp phần hồn thiện hướng nghiên cứu polysacharide từ bí đỏ mở rộng khả ứng dụng nguồn bí đỏ Việt Nam b) Mục đích nghiên cứu luận văn, đối tượng, phạm vi nghiên cứu Mục đích nghiên cứu Xây dựng quy trình phân lập polysaccharide từ mẫu thịt bí đỏ chi Cucurbita Việt Nam (Cucurbita moschata D Cucurbita pepo L.) Khảo sát hoạt tính sinh học polysaccharide phân lập Xác định thành phần cấu trúc 01 polysaccharide phân lập Đối tượng phạm vi nghiên cứu Polysaccharide từ loài bí đỏ chi Cucurbita Việt Nam Cucurbita moschata D Cucurbita pepo L c) Tóm tắt đọng nội dung đóng góp tác giả Các nội dung đề tài: Thu thập định danh 02 lồi bí đỏ thuộc chi Cucurbita Việt Nam Chiết tách, phân lập xác định thành phần hóa học polysaccharide từ 02 lồi Đánh giá hoạt tính sinh học bao gồm chống oxy hóa chống tiểu đường polysaccharide tách chiết Nghiên cứu cấu trúc 01 polysaccharide lựa chọn Các đóng góp tác giả: Lần polysaccharide từ chi Cucurbita thu thập Việt Nam nghiên cứu d) Phương pháp nghiên cứu Chiết polysaccharide phương pháp thường quy 76 Xác định thành phần cấu trúc hóa học polysaccharide cách kết hợp phương pháp sắc ký (GPC) phổ (IR, NMR) Khảo sát hoạt tính sinh học theo quy trình công bố e) Kết luận Thu thập định danh lồi bí đỏ chi Cucurbita Việt Nam C moschata D C pepo L Phân lập tinh chế polysaccharide từ bí đỏ lồi C moschata D C pepo L với 02 phương pháp chiết khác Hàm lượng polysaccharide chiết tách dịch chiết nước, acid loài C moschata D 7.50%, 6.90%; loài C pepo L 7.27%, 5.10% Xác nhận polysaccharide phân lập có hoạt tính chống oxy hóa, hạ đường huyết tốt Polysaccharide phân lập từ loài C moschata D phương pháp chiết acid thuộc dạng pectin Cấu trúc hóa học gồm mạch α(1→4)-ᴅGalacturonic acid-α(1→2)-L-Rhamnopyranose, mạch nhánh Galactose Vị trí phân nhánh C-2 Galactorunic acid Pectin có độ methoxyl hóa thấp với DE= 23.3 77