Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người thành tế bào tiết insulin và đánh giá khả năng sản xuất insulin của tế bào biệt hóa

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU BIỆT HĨA TẾ BÀO GỐC TRUNG MƠ MÁU CUỐNG RỐN NGƯỜI THÀNH TẾ BÀO TIẾT INSULIN VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT INSULIN CỦA TẾ BÀO BIỆT HÓA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN GV Th.S PHẠM VĂN PHÚC SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN THỊ PHƯƠNG DUNG MSSV: 3064379 LỚP: CNSHTT K32 Cần Thơ, tháng 11/2010 i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU BIỆT HĨA TẾ BÀO GỐC TRUNG MƠ MÁU CUỐNG RỐN NGƯỜI THÀNH TẾ BÀO TIẾT INSULIN VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT INSULIN CỦA TẾ BÀO BIỆT HÓA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN GV Th.S PHẠM VĂN PHÚC SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN THỊ PHƯƠNG DUNG MSSV: 3064379 LỚP: CNSHTT K32 Cần Thơ, tháng 11/2010 ii PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (ký tên) SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) Phạm Văn Phúc Nguyễn Thị Phương Dung DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) i LỜI CẢM ƠN Luận văn kết sáu tháng nghiên cứu phòng Thí nghiệm Ứng dụng Tế bào gốc trường Đại học Khoa học Tự nhiên mà tâm huyết em sau năm đại học mà em khơng ngừng cố gắng viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại học Cần Thơ Lời cảm ơn chân thành trước tiên em xin gửi ñến thầy Phan Kim Ngọc, người ñã ñem ñến cho em ý tưởng khơi dậy niềm ñam mê nghiên cứu lĩnh vực tế bào gốc Em xin chân thành cảm ơn thầy Phạm Văn Phúc hướng dẫn tận tình tạo ñiều kiện tốt ñể em thực ñề tài Rất cảm ơn anh Đồn Chính Chung, người ñã tận tình bảo, chia sẻ kinh nghiệm làm việc giúp ñỡ em xuyên suốt thời gian em làm việc phòng thí nghiệm tế bào gốc Cảm ơn anh Nguyễn Thanh Tâm, anh Phạm Quốc Việt, chị Vũ Bích Ngọc anh chị bạn ñang làm việc lab tế bào gốc ñã nhiệt tình giúp đỡ chia kinh nghiệm làm việc kinh nghiệm sống để em hồn thiện Cảm ơn thầy cô viện Nghiên cứu Phát triển Cơng nghệ Sinh học tích cực hỗ trợ, nhắc nhở giúp ñỡ em thời gian làm ñề tài Cảm ơn tất bạn lớp Công nghệ Sinh học tiên tiến khóa 32 quan tâm, chia động viên em vượt qua khó khăn để hồn thành cơng việc Trên hết, xin gửi lời tri ân sâu sắc ñến ba mẹ, người ñã cho sinh ra, ni dạy lớn lên tình u thương vơ bờ bến Cảm ơn ba mẹ ln ủng hộ định ln bên cạnh động viên cổ vũ cho hoàn cảnh Sáu tháng làm việc phòng thí nghiệm tế bào gốc qng thời gian em khơng qn vừa phải đối mặt với bao điều khó khăn vừa ñược nếm trải vui buồn mẻ Cuộc sống mới, môi trường làm việc mới, bạn bè kiến thức hồn tồn trở ngại lớn ngăn cản em theo ñuổi ii khác vọng Mặc dù vậy, em ln tự an ủi động viên kiên trì theo đuổi đam mê dù biết phía trước nhiều khó khăn vất vả Điều mà em đạt sau khóa luận khơng kinh nghiệm làm việc mà kiến thức thành tựu mới, kỹ thuật mà trước em chưa ñược tiếp xúc Hơn nữa, ñiều ñáng quý mà em học ñược nơi ñây phong thái làm việc tích cực động, phương pháp đối mặt giải tình khó khăn nghiên cứu khoa học, cách cư xử với bạn bè, ñồng nghiệp người xã hội Em tin tất em góp nhặt nơi hành trang vững ñể em bắt ñầu cho tương lai tươi sáng ñầy thử thách sau iii TĨM TẮT Tiểu đường loại bệnh tự miễn, gây tế bào miễn dịch công tế bào beta tuyến tụy dẫn đến thiếu hụt insulin điều hòa lượng đường máu Cho đến nay, có nhiều phương pháp chữa trị tiểu đường nói chung có tính chất tạm thời kèm theo tác dụng khơng mong muốn, khơng thể sử dụng để điều trị dứt ñiểm cho bệnh nhân Tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn nguồn tế bào gốc ñầy tiềm ứng dụng ñiều trị tiểu ñường, ñặc biệt tiểu đường loại Bằng cách biệt hóa tế bào gốc thành tế bào tiết insulin chuyển vào thể bệnh nhân, liệu pháp tế bào gốc giúp ñiều trị triệt ñể bệnh tiểu ñường tương lai gần Trong nghiên cứu này, tế bào gốc trung mơ thu nhận từ máu cuống rốn trẻ sơ sinh đánh giá thơng qua hình thái, khả tăng sinh biểu marker bề mặt Các tế bào sau cảm ứng tiền biệt hóa L- DMEM có bổ sung β-mercaptoethanol, Nicotinamide FBS 48 giờ, sau biệt hóa H- DMEM bổ sung β-mercaptoethanol, Nicotinamide FBS Hiệu biệt hóa đánh giá thơng qua tiêu chuẩn: thay đổi hình thái, sản xuất insulin biểu gen chuyên biệt tế bào tiết insulin Kết phân tích cho thấy tế bào phân lập từ máu cuống rốn tế bào gốc trung mô cần thu nhận Sau ngày biệt hóa, tế bào cảm ứng bắt đầu co lại hình thành cụm Cụm tế bào có hình thái giống cụm tiểu đảo bắt màu đỏ thẫm với DTZ vào ngày biệt hóa thứ 12 Khi phân tích Real Time PCR, tế bào biểu gen Insulin, Ngn 3, sau ngày biệt hóa biểu gen Insulin, Pdx1, Ngn sau ngày 12 ngày biệt hóa Kết nhuộm dithizon hóa miễn dịch tế bào sau 12 ngày biệt hóa với kháng thể kháng insulin cho thấy tế bào biệt hóa có khả sản xuất insulin tế bào beta ñảo tụy Từ khóa: Tiểu đường loại 1, tế bào gốc trung mơ, máu cuống rốn, tế bào tiết insulin, Reverse Transcription Realtime PCR i MỤC LỤC Trang KÝ TÊN HỘI ĐỒNG LỜI CẢM ƠN TÓM TẮT i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vii TỪ VIẾT TẮT x CHƯƠNG 1- GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn ñề 1.2 Mục tiêu ñề tài CHƯƠNG 2- LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tế bào gốc 2.2 Máu cuống rốn 2.3 Tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn 2.3.1 Tế bào gốc trung mô 2.3.2 Đặc ñiểm tế bào gốc trung mô máu cuống rốn 2.3.3 Ưu việc sử dụng tế bào gốc trung mô máu cuống rốn 2.4 Bệnh tiểu ñường 2.4.1 Tình hình phát triển bệnh tiểu ñường giới việt nam 2.4.2 Phân loại bệnh tiểu ñường 2.4.3 Các phương pháp ñiều trị tiểu ñường 11 2.4.4 Tế bào tiết insulin 15 2.5 Một số phương pháp biệt hóa tế bào gốc trung mơ máu cuống rốn thành tế bào tiết insulin 19 ii 2.5.1 Biệt hóa hóa chất 20 2.5.2 Biệt hóa chuyển gen 21 CHƯƠNG 3- PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu 23 3.1.1 Vật liệu 23 3.1.2 Dụng cụ thiết bị 24 3.1.3 Hóa chất 26 3.2 Phương pháp nghiên cứu 29 3.2.1 Thu nhận máu cuống rốn 29 3.2.2 Nuôi cấy chọn lọc tế bào gốc trung mô ứng viên từ máu cuống rốn người 30 3.2.3 Đánh giá ñặc ñiểm tế bào gốc trung mơ ứng viên thu nhận từ máu cuống rốn người 33 3.2.4 Cảm ứng biệt hóa tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người thành tế bào tiết insulin 34 3.2.5 Đánh giá hiệu biệt hóa 35 CHƯƠNG 4- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập nuôi cấy tế bào gốc trung mô ứng viên Ficoll từ máu cuống rốn người 40 4.2 Xác ñịnh ñặc ñiểm tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn 44 4.2.1 Hình thái tế bào ứng viên 44 4.2.2 Khả tăng sinh tự làm 45 4.2.3 Sự biểu số marker bề mặt 46 4.3 Đánh giá biểu gen sản xuất inlulin tế bào ñược cảm ứng biệt hóa 49 4.3.1 Sự thay ñổi kiểu hình khả bắt màu với Dithizon tế bào iii biệt hóa 49 4.3.2 Kết nhuộm hóa miễn dịch tế bào 53 4.3.3 Kết biểu gen chuyên biệt mẫu tế bào biệt hóa 54 CHƯƠNG 5- KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 61 5.2 Đề nghị 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1 Thông tin primer dùng nghiên cứu 23 Bảng 3.2 Danh sách dụng cụ dùng nghiên cứu 24 Bảng 3.3 Danh sách thiết bị dùng nghiên cứu 25 Bảng 4.1 Kết phân tích marker bề mặt tế bào ứng viên 46 Bảng 4.2 Kết biểu gene tế bào sau phân tích Tm sản phẩm khuếch đại bời RT-qPCR 56 Bảng 4.3 Kết phân tích melting curve SYBR gen tế bào trước biệt hóa (xem phụ chương) Bảng 4.4 Kết phân tích quantification SYBR gen tế bào trước biệt hóa (xem phụ chương) Bảng 4.5 Kết phân tích +/- SYBR gen tế bào trước biệt hóa (xem phụ chương) Bảng 4.6 Kết phân tích melting curve gen tế bào ngày biệt hóa (xem phụ chương) Bảng 4.7 Kết phân tích quantification SYBR gen tế bào ngày biệt hóa (xem phụ chương) Bảng 4.8 Kết phân tích +/- Assay SYBR gen tế bào ngày biệt hóa (xem phụ chương) Bảng 4.9 Kết phân tích melting curve gen tế bào ngày biệt hóa (xem phụ chương) Bảng 4.10 Kết phân tích quantification SYBR gen tế bào ngày biệt hóa (xem phụ chương) Bảng 4.11 Kết phân tích +/- Assay SYBR tế bào ngày biệt hóa (xem phụ chương) v Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32tt – 2010 Trường ĐHCT Bảng 4.2 Kết biểu gene tế bào sau phân tích Tm sản phẩm khuếch ñại RT-qPCR ngày 12 ngày + + + + GADPH + + PDX1 + + + NGN3 + + + INSULIN GLUT Kết phân tích Tm cho thấy: tế bào chưa biệt hóa khơng biểu gen Insulin, glut2, Pdx1, Ngn3 Sau ngày biệt hóa, có biểu Insulin Ngn3 Gen Insulin, Pdx1 Ngn3 biểu mạnh vào ngày 12 đó, Glut2 khơng biểu tất ngày ñược khảo sát (b) (a) 7000 GADPH 6500 8000 8000 7500 7500 7000 7000 6500 6500 6000 6000 5500 5500 5000 5000 GADPH GAD 6000 5000 F lu o r e s c e n c e (n o rm ) F luores c e nc e (norm ) 4500 F lu o r e s c e n c e (n o rm ) 5500 4500 4500 4000 4000 3500 3500 3000 3000 2500 2500 2000 2000 1500 1500 1000 1000 500 500 500 0 4000 3500 3000 Ngn3 Ngn Insulin Insuli Pdx1 Pdx1 Glut Glut2 2500 2000 1500 1000 (c) 8500 8500 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Cycle 0 Ngn Ngn3 8000 8000 7500 7500 7000 7000 GADP GADPH 6500 6500 6000 6000 5000 5000 Inluli Inlulin 4500 4500 F lu o r e s c e n c e ( n o r m ) F luo F luo res res c enc c enc e e(norm (norm ) ) 5500 5500 4000 4000 3500 3500 Pdx Pdx1 3000 3000 2500 2500 Glut Glut2 2000 2000 1500 1500 1000 1000 500 500 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Cycle Cycle 02 13 35 46 57 68 79 810 911 1012 1113 1214 1315 1416 1517 1618 1719 1820 1921 2022 2123 2224 2325 2426 2527 2628 2729 2830 2931 3032 3133 3234 3335 3436 3537 3638 3739 3840 39 40 Cycle Cycle (d) 7000 6800 6600 6400 6200 6000 5800 5600 5400 5200 5000 4800 4600 4400 4200 4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 -200 -400 Ngn3 GADPH Insulin Pdx1 Glut2 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Cycle Hình 4.14 Kết phân tích Real-time PCR: (a) Tế bào chưa cảm ứng biệt hóa; (b) Tế bào ngày biệt hóa; (c) Tế bào ngày biệt hóa; (d) Tế bào 12 ngày biệt hóa Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 56 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32tt – 2010 Trường ĐHCT Sự ñịnh lượng tương ñối gen khảo sát phân tích dựa vào giá trị Ct sản phẩm khuếch đại cơng thức 2-∆∆Ct Kết sau xử lý ñược biểu diễn biểu đồ cột (Hình 4.15; 4.16; 4.17; 4.18) Dựa vào kết ñịnh lượng tương ñối ta thấy: gen Insulin Ngn3 biểu từ ngày biệt hóa thứ 4, đạt giá trị cao vào ngày biệt hóa thứ giảm biểu vào ngày 12 Mặt khác, gen Insulin bắt ñầu biểu mức thấp sau ngày biệt hóa Sự biểu gen tăng liên tục ngày ngày 12 q trình biệt hóa Nhiều nghiên cứu cho thấy tế bào tiết insulin biểu gen chun biệt có vai trò trưởng thành chức tế bào gen marker Insulin, Glucagon, Glut gen mã hóa nhân tố phiên mã Pdx1, NeuroD, Ngn3 Ngn3 mã hóa protein Neurogenin3 biểu chuyên biệt tế bào tiền thân tuyến tụy suốt trình phát triển phơi Nhiều nghiên cứu cho thấy Ngn3 khởi đầu q trình biệt hóa tế bào thành tiểu đảo Ngn3 ñịnh phát triển chức tế bào beta tế bào khác tuyến tụy Sự biểu gen Ngn3 tế bào khảo sát chứng tỏ tế bào có đặc điểm tế bào hệ nội tiết có khả tiết Gia tri dinh luong tuong doi insulin Biểu Ngn3 Hình 4.15 Kết ñịnh lượng tương ñối biểu gen Ngn3 Kết phân tích cho thấy Pdx1 bắt ñầu biểu vào ngày thứ trình biệt hóa tiếp tục tăng vào ngày 12 Nhiều nghiên cứu cho thấy Pdx1 gen khởi ñầu trình hình thành tế bào tiết insulin Sự biểu Pdx1 dẫn đến kích Chun ngành Cơng nghệ Sinh học 57 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32tt – 2010 Trường ĐHCT hoạt hàng loạt gen chức khác dẫn ñến trưởng thành tế bào ñảo tụy Pdx1 dịch mã ngồi nhân kết hợp với nhân tố hoạt hóa khác Ngn3 bám vào promoter gen mục tiêu khởi ñầu trình phiên mã Trong nghiên cứu này, vào ngày cảm ứng biệt hóa thứ 4, tế bào biểu gen Insulin Ngn3 không biểu gen Pdx1 hàm lượng mRNA gen Pdx1 ban ñầu chưa ñủ ñể sản phẩm PCR biểu màu SYBGREEN Biểu Pdx1 Hình 4.16 Kết định lượng tương ñối biểu gen Pdx1 Biểu Glut2 Hình 4.17 Kết định lượng tương đối biểu gen Glut2 Glut2 mã hóa cho protein màng Glut 2, protein có nhiệm vụ vận chuyển glucose vào tế bào tiết insulin kích hoạt túi tiết tăng cường tiết insulin ngoại bào Vì vai trò thiết yếu chức tế bào tiết insulin, Glut2 trở thành gen chuyên biệt dùng nhận diện tế bào beta mức ñộ phân tử Tuy nhiên, Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 58 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32tt – 2010 Trường ĐHCT kết nghiên cứu này, gen Glut2 suốt thời gian biệt hóa gen Insulin hoạt động protein Insulin phóng thích mơi trường Điều xảy Glut2 biểu yếu, sản phẩm mRNA khơng đủ ñể biểu màu phản ứng qPCR Ngoài ra, biểu sai lệch gene Glut2, Pdx1 điều kiện ni cấy invitro khác biệt với phát triển tế bào invivo nên biểu gen khơng mong đợi Biểu Insulin Hình 4.18 Kết định lượng tương đối biểu gen Insulin Sự biểu insulin tế bào cảm ứng biệt hóa nghiên cứu có xu hướng tăng thời gian biệt hóa dài Sự biểu gen Insulin tăng liên tục từ ngày đến ngày 12 q trình biệt hóa Sự gia tăng biểu gen Insulin phù hợp với thời gian biệt hóa chứng tỏ tiếp xúc với glucose thời gian dài tế bào có xu hướng tiết nhiều insulin Điều xảy với tế bào beta tuyến tụy, nồng ñộ ñường máu mức cao thời gian dài, tế bào beta ñáp ứng cách tiết insulin nội bào môi trường Sự gia tăng biểu Insulin qua ngày biệt hóa giải thích thời gian khảo sát biệt hóa, tế bào tác động nhân tố kích thích thời gian dài hoàn chỉnh chức biểu tăng cường phiên mã mRNA gen Insulin Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 59 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32tt – 2010 Trường ĐHCT Như vậy, có số sai lệch biểu gen chuyên biệt tế bào cảm ứng so với nghiên cứu trước, nhìn chung, kết phân tích RT-qPCR hợp lý chứng tỏ tế bào biệt hóa thành cơng Chun ngành Cơng nghệ Sinh học 60 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32tt – 2010 Trường ĐHCT CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Phương pháp ly tâm ñẳng tỷ trọng với dung dịch Ficoll- HyPaque có khả phân lập MSC với hiệu suất cao.Tế bào gốc trung mô ứng viên có đặc điểm nhận diện tế bào gốc trung mơ hình thái, khả tăng sinh làm biểu marker bề mặt Tế bào gốc trung mơ thu nhận có khả biệt hóa thành tế bào tiết insulin cảm ứng với tác nhân biệt hóa glucose, nicotinamide, 2mercaptoethanol Các tế bào biệt hóa biểu gen Insuin, Pdx1, Ngn3 không biểu Glut2 suốt thời gian khảo sát Ngoài biểu gen Insulin mức độ phiên mã, tế bào xác định có khả tiết insulin Như q trình biệt hóa đánh giá tương đối thành cơng 5.2 Đề nghị Vì thời gian kinh phí có giới hạn nên thí nghiệm luận văn mang tính chất thử nghiệm Để nâng cao tính thuyết phục khả ứng dụng thực tiễn nghiên cứu này, nghiên cứu cần khảo sát sâu biểu gen chuyên biệt tế bào biệt hóa, đồng thời đánh giá thay ñổi lượng insulin số protein liên quan ñược sản xuất từ tế bào biệt hóa suốt thời gian ni cấy Ngồi ra, thử nghiệm in vivo cần ñược tiến hành ñể ñánh giá chức ñiều trị lâm sàn tế bào cảm ứng biệt hóa Chun ngành Cơng nghệ Sinh học 61 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đồn Chính Chung, 2008 Luận văn tốt nghiệp Biệt hóa tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người thành tế bào tiết insulin hoá chất Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Lê Ngọc Châu, 2009 Luận văn tốt nghiệp Thử nghiệm ñiều trị tiểu ñường tế bào gốc trung mơ máu cuống rốn mơ hình chuột Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Nxb Giáo Dục Phạm Hồng Sơn, 2004 Kỹ thuật sinh học phân tử Nhà xuất Đại học Huế Phạm Hùng Vân 2009 PCR real time PCR vấn ñề áp dụng thường gặp Nhà Xuất Y học Tp.HCM Tr 9-40 Phạm Thành Hổ, 2006 Nhập môn công nghệ sinh học Nxb Giáo Dục Phan Kim Ngọc- Phạm Văn Phúc, Trương Định 2009 Công nghệ tế bào gốc Nxb Giáo Dục Phan Kim Ngọc, Đồn Chính Chung, Trương Hải Nhung, Dương Thị Thư, Nguyễn Thị Minh NGuyệt, Vũ Bích Ngọc, Phạm Văn Phúc 2010 Điều Trị bệnh tiểu ñường type cách Ghép tế bào tiết Insulin biệt hóa từ tế bào gốc trung mô người Kỷ Yếu Hội Nghị Sinh Học Phân Tử hóa sinh y học tồn quốc lần thứ Tr 33-45 Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc 2007 Công nghệ sinh học người ñộng vật Nxb Giáo Dục Vũ Văn Phụng, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp 2007 Công nghệ sinh học Tập Nxb Giáo Dục Tiếng Anh Ammon B Peck, Li Yin, and Vijayakumar Ramiya 2004 Animal Models to Study Adult Stem Cell-derived, In Vitro-generated Islet Implantation ILAR Journal Vol.45 No pp 259-267 Caridad Martinez,Ted J Hofmann, Roberta Marino, Massimo Dominici, and Edwin M Horwitz 2007 Human bone marrow mesenchymal stromal cells express the neural ganglioside GD2: a novel surface marker for the identification of MSCs Blood Vol.109 No 10 pp 4245-4248 Hiromitsu Kajiyama1, Tatsuo S Hamazaki, Makoto Tokuhara, Shinji Masui, Koji Okabayashi, Kiyoshi Ohnuma, Shigeharu Yabe, Kazuki Yasuda, Shoichi Ishiura, Hitoshi Okochi and Makoto Asashima 2009 Pdx1-transfected adipose tissue-derived stem cells differentiate into insulin-producing cells in vivo and reduce hyperglycemia in diabetic mice The International Journal Of Developmental Biology Vol.45 pp 699-705 Huijuan Yuan, Jie Li, Ning Xin, Zhigang Zhao, Guijun Qin, 2010 Expression of Pdx1 mediates differentiation from mesenchymal stem cells into insulinproducing cells Mol Biol Rep Springer Netherlands Karenbieback, Susannekern, Haraldklüter, Hermanneichler 2004 Critical Parameters for the Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Umbilical Cord Blood Stemcell Vol.22 pp.625–634 Li-Bo Chen, Xiao-Bing Jiang, Lian Yang 2004 Differentiation of rat marrow mesenchymal stem cells into pancreatic islet beta-cells World J Gastroenterol Vol.10 No.20 pp 3016-3120 Lynn Kisselbach, Michael Merges, Alexis Bossie and Ann Boyd 2009 CD90 Expression on human primary cells and elimination of contaminating fibroblasts from cell cultures Method in Cell Science Meng Wang, Yuan Yang, Dongming Yang, Fei Luo, Wenjie Liang, Shuquan Guo1 and Jianzhong Xu 2008 The immunomodulatory activity of human umbilical cord bloodderived mesenchymal stem cells in vitro Immunology pp 220–232 NZ SUN & HS JI 2009 In Vitro Differentiation of Human Placenta-derived Adherent Cells into Insulin-producing Cells The Journal of International Medical Research Vol.37 pp 400-406 Oscar K Lee, Tom K Kuo, Wei-Ming Chen, Kuan-Der Lee, Shie-Liang Hsieh, and Tain-Hsiung Chen 2004 Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from umbilical cord blood Blood Vol 103 No pp 1669- 1675 R A Musina, E S Bekchanova, G T Sukhikh 2005 Comparison of Mesenchymal Stem Cells Obtained from Different Human Tissues Cell Technologies in Biology and Medicine Vol No pp 504-509 Suheir Assady, Gila Maor, Michal Amit, Joseph Itskovitz-Eldor,1,2 Karl L Skorecki, and Maty Tzukerman 2001 Insulin Production by Human Embryonic Stem Cells Diabetes Vol.50 pp.1691- 1697 Susan Hawes and Martin F Pera 2006 Identification and maintance of cell lineage progenitors derived from human ES cells Essential of stem cell biology pp 355-361 Takahisa Fujikawa, Seh-Hoon Oh, Liya Pi,Heather M Hatch, Tom Shupe, and Bryon E Petersen, June 2005.Teratoma Formation Leads to Failure of Treatment for Type I Diabetes Using Embryonic Stem Cell-Derived Insulin-Producing Cells American Journal of Pathology Vol.166 No Yanhua Li, Rui Zhang, Haifa Qiao, Heping Zhang, Yunfang Wang, Hongfeng Yuan, Qinbin Liu, Daqing Liu, Lin Chen, Xuetao Pei 2007 Generation of insulinproducing cells from PDX-1 gene-modified human mesenchymal stem cells Cellular Physiology Vol.211 No.1 pp 36–44 Yusuke Moritoh, Eiji Yamato, Yumiko Yasui, Satsuki Miyazaki, and Jun-ichi Miyazaki 2003 Analysis of Insulin-Producing Cells During In Vitro Differentiation From Feeder-Free Embryonic Stem Cells Diabetes Vol.52 pp 1163- 1168 Trang web http://books.google.com.vn/books?id=BG5paiwd5hgC&pg=PA893&lpg=PA893&dq =identify+MSCs+by+marker&source=bl&ots=buXVAy4li&sig=TZtCRvu2ni6NqNwwQWT5bURrJ4&hl=vi&ei=uA5ATMjROs3XcZOqlakP&sa=X&oi=book_result&ct=res ult&resnum=1&ved=0CBsQ6AEwAA#v=onepage&q=identify%20MSCs%20by%20 marker&f=false (10/11/2010) http://care.diabetesjournals.org/content/27/suppl_1/s5.full (10/11/2010) http://daithaoduong.com/Bien-chung/Bien-chung-cua-benh-Dai-thao-duong (10/11/2010) http://daithaoduong.com/Dai-thao-duong/Tong-quan-Dai-thao-duong (10/11/2010) http://diabetes.niddk.nih.gov/dm/pubs/pancreaticislet/ (10/11/2010) http://themedicalbiochemistrypage.org/insulin.htmlS (10/11/2010) http://www.ctv.ca/servlet/ArticleNews/story/CTVNews/20070410/diabetes_stem_070 410?s_name=&no_ads= (10/11/2010) http://www.daithaoduong.net.vn/index.php?option=com_content&view=article&id=1 38&catid=39&Itemid=117&lang=vi (10/11/2010) http://www.daithaoduong.net.vn/index.php?option=com_content&view=article&id=1 38&catid=39&Itemid=117&lang=vi (10/11/2010) http://www.mayoclinic.com/health/type-1diabetes/DS00329/DSECTION=complications (10/11/2010) http://www.who.int/diabetes/en/ (10/11/2010) PHỤ LỤC Phục lục kết Hình 4.18 Temperature profile phản ứng RT-qPCR phân tích gen tế bào trước biệt hóa Bảng 4.3 Kết phân tích melting curve SYBR gen tế bào trước biệt hóa Bảng 4.4 Kết phân tích quantification SYBR gen tế bào trước biệt hóa Bảng 4.5 Kết phân tích +/- SYBR gen tế bào trước biệt hóa Hình 4.19 Temperature profile phản ứng RT-qPCR phân tích gen tế bào ngày biệt hóa Bảng 4.6 Kết phân tích melting curve gen tế bào ngày biệt hóa Bảng 4.7 Kết phân tích quantification SYBR gen tế bào ngày biệt hóa Bảng 4.8 Kết phân tích +/- Assay SYBR gen tế bào ngày biệt hóa Hình 4.20 Temperature profile phản ứng RT-qPCR phân tích gen tế bào ngày biệt hóa Bảng 4.9 Kết phân tích melting curve gen tế bào ngày biệt hóa Bảng 4.10 Kết phân tích quantification SYBR gen tế bào ngày biệt hóa Bảng 4.11 Kết phân tích +/- Assay SYBR tế bào ngày biệt hóa Hình 4.21 Temperature profile phản ứng RT-qPCR phân tích gen tế bào 12 ngày biệt hóa Bảng 4.12 Kết phân tích melting curve gen tế bào 12 ngày biệt hóa Bảng 4.13 Kết phân tích quantification SYBR gen tế bào 12 ngày biệt hóa Bảng 4.14 Kết phân tích +/- Assay SYBR gen tế bào 12 ngày biệt hóa Bảng 4.15 Giá trị định lượng tương đối biểu gen theo cơng thức 2-∆∆Ct Relative Pdx1 Relative Glut Relative Insulin Relative Ngn3 expression expression expression expression 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 1.00 1.00 0.00 13.64 1.38 1.17 0.00 21.41 0.78 n0 n4 n8 n12 Phụ lục phương pháp Giá trị ñịnh lượng tương ñối= 2-∆∆Ct ∆∆Ct = (CT,Target - CT,GADPH)Timex - (CT,Target - CT,GADPH)Time0 Thời ñiểm gen bắt ñầu biểu ñược gọi thời gian ban ñầu time Thời ñiểm cần khảo sát biểu gen ñược gọi time x GADPH gen ñối chứng, ñược dùng làm chuẩn để só sánh biểu gen mục tiêu Giá trị 2-∆∆Ct lớn chứng tỏ mức biểu gen cao ... rốn người - Biệt hóa tế bào gốc trung mơ máu cuống rốn người thành tế bào tiết insulin hóa chất - Đánh giá biểu gen chun biệt tế bào biệt hóa đánh giá khả tiết insulin tế bào biệt hóa Chuyên ngành... nhiều nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc thành tế bao tiết insulin chưa tạo tế bào tiết insulin có khả điều trị lâm sàn Từ lý nêu trên, tơi thực đề tài Nghiên cứu biệt hóa tế bào tiết insulin từ tế bào. .. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tế bào gốc 2.2 Máu cuống rốn 2.3 Tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn 2.3.1 Tế bào gốc trung mô 2.3.2 Đặc ñiểm tế bào gốc trung mô