Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người thành tế bào dạng tạo xương

T À I L IỆ U TH A M K H ẢO Lindan c, Lieu T, Giang L, et al Rising HIV infection rates in Ho Chi Minh City herald emerging AIDS epidemic in Vietnam AIDS 1997, 11 (Sup pi 1), S5­13 Nguyên T, Hoang T, Pham K, van Ameijiden E, Deville w, and Wolffers I HTV monitoring in Vietnam: System, methodology, and results of sentinel surveillance J Acqui Immune Defic Syndr 1999, 21 (4), 338­346 The Socialist Republic of Viet Nam Declaration of Commitment on HIV and AIDS adopted at 26th United Nations General Asembly Special Sesion in June 2001 (ƯNGASS), 2010 Ishizaki A, Cuong N, Thuc p et al Profile of HIV type infection and genotypic resistance mutations to antiretroviral drugs in Hai Phong Vietnam AIDS Res Hum Retroviruses 2009, 25 (2), pp.175­182 Phan TTC, Ishizaki A, Phung DC, Bi X, Oka s and Ichimura H Characterization of HIV type genotypes and drug resistance mutations among đrag­naỉve HIV type­1 infected patients in Northern Vietnam AIDS Res Hum Retroviruses 2010,2 (2), pp.233­235, World Health Organization/ Western Pacific Regional Office and partner Good practice in Asia: Targeted HIV prevention for injecting drag users and sex workers Vietnam’s first large­scale national harm reduction initiative, 2010 http://www.who.mt/hiv/pub/idu/wpro vietnam/en/index.html Johnson VA, Calvez V, Gunthard HF, et al 2011 update of the drug resistance mutations in HIV­1 Top Antivir Med 2011,19 (4), PP.ỈS6­Ỉ64 NGHIÊN CỨU BIỆT HĨA TẾ BÀO GĨC TRUNG MƠ MÀNG DÂY RÓN NGƯỜI THÀNH TỂ BÀO DẠNG TẠO XƯƠNG TÓM TẲT TS Đ M inh Trung* Tế bào gốc (TBG) tế bào chưa có chức'năng chuyên biệt, có khả biệt hoá thành nhiều loại tể bào khác để thay cho tế bào bị già chết tự nhiên hay chấn thương v nhiều nguyên nhân khác Ghép TBG từ tuỷ xương tự thân dùng lâm sàng để điều trị gãy xương lâu liền khớp giả Tuy nhiên, ngn TBG tùy xương cịn khó khăn số lượng tế bào quy tr nh Èhu thập tế bào tương đối phức tạp Nhằm tăng hiệu điều trị tái tạo xuơng, TBG cần tẫng sinh số lượng biệt hóa ỉn viíro thành lượng lớn tế bào tạo xương trưởc cấy ghép vào xương gãy V vậy, tiến hành ni cấy tăng sính biệt hóa in vitro TBG trung mô màng dây rốn người thành tế bào dạng tạo xương làm tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng loại TBG đặc biệt vào điều trị tương lai Đổi tượng phương pháp nghiên cứu: Dây rốn 10 trẻ sơ sinh mẹ đẻ ià áản phụ > ỉ tuổi, có tiền sử khỏe mạnh, có kết âm tính với xét nghiệm sàng lọc bệnh nhiễm trùng (bao gồm virus HIV, virus viêm gan B, virus viêm gan c, virus CMV vi khuẳn giang raai), trẻ sinh độ tuổi thai > 37 tuần, sinh raột khơng có tai biến tr nh sỉnh đẻ Nuôi cấy tăng sinh TBG trung mô từ màng dây rốn người: Biệt hóa in vitro TBG trung mơ thành TBDTX: Kiểm tra tích tụ canxi quanh té bào sau biệt hóa nhuộm alizarin red, khả Eích tụ canxi TBDTX biệt hóa từ TBG trung mơ màng dây rốn, xác định hoạt tính alkaline phosphates (ALP) Tách chiết ARN tiến hành phàn ứng RT­PCR để xác định dâu ấn sinh học tế bào dạng tạo xương biệt hóa từ TBG trung mơ màng rốn * Học viện Quân y 502 Phuơng pháp xác định số lượng tế bào nuôi cấy, thu hoạch bảo quản tế bào Tạo mô h nh chuột nhắt suy giảm miễn dịch hóa chất, cấy ghép TBDTX biệt hóa từ TBG trung mô màng dây rốn chuột suy giảm miễn dịch hóa chất Nhuộm hematoxylin eosin Phương pháp xử lý số liệu: dựa phần mềm thổng kê y học SPSS 16.0 Kết kết luận: Đã nuôi cấy tăng sinh TBG trung mô từ màng dây rốn: ­ Nuôi cấy tăng sinh mơi ỉrường có bổ sung 10% FBS, Ị % kháng sinh, nuồi cấy 37°c, 5% C ­ Nuôi cấy tăng sinh đạt mật độ 60­80% diện tích bề mặt đĩa ni cấy sau ngày Đã cảm ứng biệt h a TBG trung mô màng dây rốn thầnh tể bào dạng tạo xư ng in vitro: ­ Mơi trường cảm ứng biệt hóa gồm có DMEM high glucose/F12 glutamax có bổ sung 10% FBS, 1% kháng sinh, 100 nM dexamethasone, 10 mM p­glycerolphosphate, 0,25 mM acid ascorbic ­ Trong tr nh cảm ứng biệt hóa, hầu hết tế bào ngừng phân chia, có thay đổi h nh dạng, kích thirớc, tế bào bắt đầu chuyển từ dạng thoi, nhỏ sang dạng tròn, ỉớn cuối h nh hạt đậu giống tể bào tạo xương sau 21 ngày; có lắng đọng canxi, có hoạt tính phosphatase kiềm; dương tính với dấu ấn osteocalcin, osteopontin, collagen týp I, phosphatase kiềm; bước đầu thử nghiệm cho thấy có khà nãng tạo nốt tích tụ can­xi cấy ghép dưởi đa chuột nhắt suy giảm miễn địch *Từ khóa: Tê bào gốc trung mô; Màng dây rốn người; Tế bào dạng tạo xương In vitro osteogenic differentiation o f m esenchym al stem cell fr o m hum an um bilical cord lining Sum m ary Stem cells are cells that not have specialized functions, but have the ability to differentiate into multiple cell types to replace cells that have been lost for numerous reasons, including natural aging, death or injury Autologous bone marrow stem cells have been used clinically for transplantation in the treatment of long bone fractures that not heal However, bone marrow contains few mesenchymal stem cells (MSCs), and they are difficult to isolate To increase the efficacy of MSCs as a treatment for bone regeneration, stem cells need to be proliferated and differentiated in vitro to generate large amounts of bone­celis before transplantation into broken bones Therefore, the objectives of the current study were to MSCs culture and proliferation from human umbilical cord lining membranes and to differentiate them into osteogenic cells in vitro to establish a basis for future research and therapeutic applications of these cells Subjects and methods Subj cts: The umbilical cords (n=10) newborns whose mothers voluntarily participated in the research Selection criteria included mothers > Ỉ8 years of age who did not experience complications during hospitalization delivery and delivered healthy infants with a fetal gestational age of over 37 weeks All of the infants had negative results on screening tests for infectious diseases including hepatitis B virus, hepatitis c virus, HIV virus, CMV and syphilis bacteria M thods: ­ MSCs culture and proliferation ­ Alizarin Red s stain analysis ­ In vitro induction of MSCs differentiation into osteogenic ceils ­ RNA isolation and reverse transcriptase ­ polymerase chain reaction ­ Acount the number of the cell, harvest and storage cells ­ Modeling immunosuppression mice by chemical and Initial implantation of osteogenic cell in immunosuppression mice by chemical showed capacity of calcium accumulation nodules ­ Hematoxylin and Eosin Stain 503 Results and conclusions: MSCsfrom human umbilical cord w r cultur dfor prolif ration: - Culture for proliferation in the Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F­12 (DMEM/F12) media suplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% antibiotic ­ Culture for proliferation, where the cell reached approximately 60% jto 80% confluence on the surface culture plastic dish after days In vitro diff r ntiation o fm s nchymal st m c llsfrom human umbilical cord lining m mbran into ost og nic c ll: ­ The osteogenesis differentiation was induced by (DMEM/F12) media suplemented with 10% fetal bovine cerntp (FBS) and 1% antibiotic medium adding 100 nM dexamethasone, 10 mM p­glycerolphosphate, 0,5 mM ascorbic acide ­ The morphology of the cell was monitored during the differentiation process After 21 days of differentiation, the cells have changed its morphology toward the bone cell with calcium accumulation in cytoplasm and positive expression of molecular markers of bone cell such as osteocalcin, osteopontin collagenase type I and alkaline phosphatase Initial implantation of osteogenic cell in immunosuppression mice by chemical showed capacity of accumulating calcium to form nodules and without transplant rejection * Key words: Human umbilical cord lining membranes; Bone marrow stem cells; I Đ Ặ T V N ĐÈ Tế bào gốc (TBG) tế bào có khả biệt hóa thành tế bào chức khác để thay cho tế bào già chết tự nhiên hay tổn thương nguyên nhân khác nhau, mở triển vọng dùng TBG để tái tạo ỉại mô Ghép T B G từ tuỷ xương tự thân dùng lâm sàng để điều trị thành công trường hợp gãy xương lâu liền khớp giả Khi tiêm vào ổ gãy xương, TBG tủy xương biệt hoá thành tế bào dạng tạo xương (TBDTX), tái tạo lại ổ khuyểt xuơng Tuy nhiên, nguồn TBG tủy xương có khó khăn số lượng tế bào qui tr nh thu thập íế bào, Màng dây rốn trẻ sơ sinh có TBG trung mô (Mesenchymal Stem C ell) tương tự TBG trang mơ tủy xương Bên cạnh đó, việc phân ỉập TBG từ màng dây rốn có nhiều ưu điểm phương diện kỹ thuật đạo đức so với phân ỉập TBG từ số nguồn khác, đó, sử dụng chúng nguồn TB G thay cho TBG tủy xương Để ứng dụng điều trị vết thương xương sớm có kết quả, cần biệt hóa TBG thành TBDTX trước cấy ghép vào gãy xương Các TBG trung mô phân lập từ nguồn khác nhau, sau đó, tăng sinh biệt hóa in vitro thành TBDTX cách bổ sung yểu tố kích thích biệt hóa tạo xương vào môi trường nuôi cấy, bao gồm cytokine, vitamin canx Tế bào dạng tạo xương đánh giá h nh thái tể bào, phương pháp nhuộm đặc hiệu với canxi, m arker đặc trưng TBDTX Xuất phát từ sở lý Ịuận thực tiễn nêu trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứa biệt h a t ể bào gốc trung m ô m àng dây rắn ngườ i thành tể bào đọng tạo x n g ” với mục tiêu sau: ­ N uôi cấy tă ng sin h TB G tru n g m ô t m àn g dây rến ngườ i làm vật liệu đ ể biệt h a tế bào ­ B iệt hoá in vitro TB G tru n g m ô m àn g rến người th o hư&ng th àn h tế bào dọng tạo xtr ng nhằm ứng dụ ng điều tr ị tổn thư ng xư ng II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1.Đổi tượng nghiên cứu Dây rốn 10 trẻ sơ sinh mẹ đẻ sản phụ 18 tuổi, có tiền sử khỏe mạnh, có kết âm tính với xét nghiệm sàng lọc bệnh nhiêm trùng (bao gồm virus IIĨV, virus viêm gan B, virus viêm gan c virus CMV vi khuẩn giang mai), trẻ sinh độ tuổi thai > 37 tuần, sinh khơng có tai biển q tr nh sinh đẻ Chuột nhắt trắng dòng Albino SWISS Ban Chăn ni động vật, Phịng Trang bị Vật tư kỹ thuật, Học viện Quân y cung cấp 504 2.2 P h ưo ug p h p ng hiên cứu ­ Nuôi cấy tăng sinh TB G trung mô màng dây rốn: tế bào thu nhận nuôi cấy tăng sinh mơi trường DMEM/F12 có bổ sung 10% FBS 1% chất kháng sinh, để nhiệt độ °c , 5% CƠ ­ Biệt hóa in,vitro TBG trung mô thành tế bào dạng tạo xương: sử dụng tế bào lần cấy chuyển thứ Khảo sát thay đổi thành phần môi truờng DMEM, F12 Ham glutamax, FBS, % kháng sinh bổ sung chất cảm ứng biệt hóa tế bào dexamethasone, acid L­ascorbic p­glycerolphosphate Để đánh giá kiểm tra tế bàó tr nh biệt hóa tế bào biệt hóa thơng qua tích tụ canxi quanh tế bào sau biệt hóa nhuộm alizarin red, đánh giá khả tích tụ canxi TBDTX biệt hóa từ TBG trung mô màng rốn, xác định hoạt tính alkaline phosphates (ALP) Tách chiết ARN tiến hành phản ứng RT­PCR để xác định dấu ấn sinh học tế bào dạng tạo xương biệt hóa từ TBG trung mô màng dây rốn ­ Phương pháp xác định số lượng té bào nuôi cấy, thu hoạch bảo quản tế bào ­ Cấy ghép tế bào tạo xương biệt hóa từ TBG trang mơ màng dây rốn lên chuột nhắt gây suy giảm miễn địch hóa chất: tạo mơ h nh chuột nhắt suy giảm miễn dịch hóa chất, cấy ghép TBDTX biệt hóa từ TBG trang mô màng dây rốn chuột suy giảm miễn dịch hóa chất để bước đầu đánh giá khả tạo nốt canxi mô h nh động vật thực nghiệm ­ Nhuộm hematoxylin eosin ­ Phương pháp xử lý số liệu: dựa phần mềm thống kê y học SPSS 16.0 in KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Nuôi c y tăng sinh TBG trung mô màng dâỹ rốn Các mẫu TBG trung mô màng dây rốn mói thu nhận ni cấy mô dây rốn sau 14 ngày tế bào đạt mật độ 60 ­ 80% bề m ặt nuôi cấy tế bào bảo quản đông lạnh giải đông cấy chuyển lại » I n B ' • H n m :