ĐẶT VẤN ĐỀ Da là cơ quan lớn nhất của cơ thể có chức năng bảo vệ. Mặc dù chỉ gồm 2 lớp mô chuyên biệt với hai loại tế bào chủ yếu là nguyên bào sợi và tế bào sừng nhƣng việc tái tạo khi da bị tổn thƣơng vẫn còn là một thách thức 2,8. Các tấm tế bào da nuôi cấy hoặc vật liệu tƣơng đƣơng da chế tạo từ tế bào da nuôi cấy đã đƣợc ứng dụng trong điều trị bỏng, vết thƣơng mạn tính 6,17,18… Mặc dù hạn chế đƣợc nguy cơ lây nhiễm nhƣng do khả năng tăng sinh có hạn và tính kích thích đào thải miễn dịch của tế bào cao nên chi phí giá thành vật liệu lớn làm hạn chế khả năng phổ biến ứng dụng trong điều trị. Hơn nữa, thành phần các loại vật liệu chỉ là nguyên bào sợi hoặc tế bào sừng nên còn thiếu rất nhiều các thành phần phụ của da nhƣ tế bào sắc tố, tế bào nang lông, tế bào tuyến bã... Việc khắc phục các hạn chế trên đang đƣợc kỳ vọng vào vai trò tác dụng của các tế bào gốc bởi chúng là những tế bào chƣa có chức năng chuyên biệt, chúng có tiềm năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau và có khả năng tự thay mới. Tế bào gốc trung mô tồn tại trong tủy xƣơng, máu cuống rốn, dây rốn, mô liên kết của cơ thể và ở các khoảng kẽ của nhiều cơ quan 14,42. Các tế bào này có thể đƣợc nuôi cấy và nhân lên in vitro và dƣới các điều kiện thích hợp chúng có thể cảm ứng biệt hóa thành các tế bào xƣơng, sụn, cơ và mỡ. Hiện nay, tế bào gốc trung mô đƣợc coi là dạng tế bào quan trọng cho công nghệ mô 26,43. Trong liền vết thƣơng, tế bào gốc trung mô đƣợc xác định là chúng biệt hóa thành các dạng tế bào da khác nhau. Tủy xƣơng là nguồn chính của tế bào gốc trung mô nhƣng vấn đề thu tủy xƣơng gặp khó khăn và số lƣợng ngƣới cho tủy xƣơng cũng hạn chế 14,52. Do sự tăng lên về tuổi tác, khả năng tăng sinh và biệt hóa thành nhiều dòng tế bào khác nhau của tế bào gốc trung mô tủy xƣơng bị giảm đi và các tế bào cũng đặt ra câu hỏi về nguy cơ nhiễm virus 44. Những vấn đề cần cân nhắc này đã hạn chế các ứng dụng lâm sàng của tế bào gốc trung mô tủy xƣong. Hơn nữa, cùng với sự tăng lên về tuổi tác của ngƣời cho, số lƣợng tế bào gốc trung mô trƣởng thành trong đó các tế bào gốc trung mô tủy xƣơng cũng bị giảm đi đáng kể. Các dữ liệu trƣớc đây đã chỉ ra rằng số lƣợng tế bào gốc trung mô tủy xƣơng ở ngƣời 80 tuổi giảm đi 200 lần so với trẻ mới sinh 45,63. Việc tìm kiếm các tế bào gốc trung mô từ nguồn mô khác đã đƣợc quan tâm nghiên cứu trong những năm gần đây. Dây rốn là mô mềm có chiều dài lớn và là cầu nối giữa thai và bánh nhau để trao đổi oxy, dinh dƣỡng…cho thai. Tế bào gốc đa năng đã đƣợc phát hiện và tách từ những phần khác nhau của dây rốn. Các nghiên cứu phôi thai học và kháng nguyên bạch cầu ngƣời (Human Leukocyte Antigen – HLA) của các tế bào từ dây rốn cho thấy chúng có nguồn gốc từ thai nhi chứ không phải từ ngƣời mẹ 1,57. Mô dây rốn là sản phẩm thải sau khi sinh và là một nguồn tƣơng đối dƣ thừa. Sự thu hồi mô cũng dễ dàng và không bị ảnh hƣởng cúa các vấn đề về đạo đức và luật pháp 14,109. Năm 2004, tế bào gốc trung mô phân lập đƣợc từ màng dây rốn. Các tế bào này sau khi phân lập và nuôi cấy duy trì, cấy chuyền 3 đến 5 lần trong môi trƣờng nuôi cấy đặc trƣng chƣa hề bị biệt hoá, vẫn giữ đƣợc đầy đủ đặc tính của TBG ban đầu mới phân lập 58,59, 60,61. Từ những cơ sở lý luận trên, cùng với nhu cầu thực tiễn điều trị bỏng vết thƣơng, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm các mục tiêu: 1. Đánh giá một số đặc điểm phân lập nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn. 2. Đánh giá hiệu quả ghép tế bào gốc trung mô màng dây rốn trong điều trị vết thương bỏng nhiệt thực nghiệm
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Da là cơ quan lớn nhất của cơ thể có chức năng bảo vệ. Mặc dù chỉ gồm 2 lớp mô chuyên biệt với hai loại tế bào chủ yếu là nguyên bào sợi và tế bào sừng nhƣng việc tái tạo khi da bị tổn thƣơng vẫn còn là một thách thức [2],[8]. Các tấm tế bào da nuôi cấy hoặc vật liệu tƣơng đƣơng da chế tạo từ tế bào da nuôi cấy đã đƣợc ứng dụng trong điều trị bỏng, vết thƣơng mạn tính [6],[17],[18]… Mặc dù hạn chế đƣợc nguy cơ lây nhiễm nhƣng do khả năng tăng sinh có hạn và tính kích thích đào thải miễn dịch của tế bào cao nên chi phí giá thành vật liệu lớn làm hạn chế khả năng phổ biến ứng dụng trong điều trị. Hơn nữa, thành phần các loại vật liệu chỉ là nguyên bào sợi hoặc tế bào sừng nên còn thiếu rất nhiều các thành phần phụ của da nhƣ tế bào sắc tố, tế bào nang lông, tế bào tuyến bã Việc khắc phục các hạn chế trên đang đƣợc kỳ vọng vào vai trò tác dụng của các tế bào gốc bởi chúng là những tế bào chƣa có chức năng chuyên biệt, chúng có tiềm năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau và có khả năng tự thay mới. Tế bào gốc trung mô tồn tại trong tủy xƣơng, máu cuống rốn, dây rốn, mô liên kết của cơ thể và ở các khoảng kẽ của nhiều cơ quan [14],[42]. Các tế bào này có thể đƣợc nuôi cấy và nhân lên in vitro và dƣới các điều kiện thích hợp chúng có thể cảm ứng biệt hóa thành các tế bào xƣơng, sụn, cơ và mỡ. Hiện nay, tế bào gốc trung mô đƣợc coi là dạng tế bào quan trọng cho công nghệ mô [26],[43]. Trong liền vết thƣơng, tế bào gốc trung mô đƣợc xác định là chúng biệt hóa thành các dạng tế bào da khác nhau. Tủy xƣơng là nguồn chính của tế bào gốc trung mô nhƣng vấn đề thu tủy xƣơng gặp khó khăn và số lƣợng ngƣới cho tủy xƣơng cũng hạn chế [14],[52]. Do sự tăng lên về tuổi tác, khả năng tăng sinh và biệt hóa thành nhiều dòng tế bào khác nhau của tế bào gốc trung mô tủy xƣơng bị giảm đi và các tế bào cũng đặt ra câu hỏi về 2 nguy cơ nhiễm virus [44]. Những vấn đề cần cân nhắc này đã hạn chế các ứng dụng lâm sàng của tế bào gốc trung mô tủy xƣong. Hơn nữa, cùng với sự tăng lên về tuổi tác của ngƣời cho, số lƣợng tế bào gốc trung mô trƣởng thành trong đó các tế bào gốc trung mô tủy xƣơng cũng bị giảm đi đáng kể. Các dữ liệu trƣớc đây đã chỉ ra rằng số lƣợng tế bào gốc trung mô tủy xƣơng ở ngƣời 80 tuổi giảm đi 200 lần so với trẻ mới sinh [45],[63]. Việc tìm kiếm các tế bào gốc trung mô từ nguồn mô khác đã đƣợc quan tâm nghiên cứu trong những năm gần đây. Dây rốn là mô mềm có chiều dài lớn và là cầu nối giữa thai và bánh nhau để trao đổi oxy, dinh dƣỡng…cho thai. Tế bào gốc đa năng đã đƣợc phát hiện và tách từ những phần khác nhau của dây rốn. Các nghiên cứu phôi thai học và kháng nguyên bạch cầu ngƣời (Human Leukocyte Antigen – HLA) của các tế bào từ dây rốn cho thấy chúng có nguồn gốc từ thai nhi chứ không phải từ ngƣời mẹ [1],[57]. Mô dây rốn là sản phẩm thải sau khi sinh và là một nguồn tƣơng đối dƣ thừa. Sự thu hồi mô cũng dễ dàng và không bị ảnh hƣởng cúa các vấn đề về đạo đức và luật pháp [14],[109]. Năm 2004, tế bào gốc trung mô phân lập đƣợc từ màng dây rốn. Các tế bào này sau khi phân lập và nuôi cấy duy trì, cấy chuyền 3 đến 5 lần trong môi trƣờng nuôi cấy đặc trƣng chƣa hề bị biệt hoá, vẫn giữ đƣợc đầy đủ đặc tính của TBG ban đầu mới phân lập [58],[59], [60],[61]. Từ những cơ sở lý luận trên, cùng với nhu cầu thực tiễn điều trị bỏng - vết thƣơng, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm các mục tiêu: 1. Đánh giá một số đặc điểm phân lập nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn. 2. Đánh giá hiệu quả ghép tế bào gốc trung mô màng dây rốn trong điều trị vết thương bỏng nhiệt thực nghiệm 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. QUÁ TRÌNH LIỀN VẾT THƢƠNG, VẾT BỎNG 1.1.1. Diễn biến lâm sàng vết thƣơng, vết bỏng sâu Diễn biến vết thƣơng nói chung đều trải qua các giai đoạn viêm, tăng sinh, tái lập mô và liền sẹo. Thông thƣờng, các vết thƣơng liền trong vòng 4 – 6 tuần [2],[8],[53]. Các vết thƣơng khuyết da hoặc bỏng sâu toàn bộ lớp da thì quá trình liền vết thƣơng đều phải trải qua quá trình hình thành mô hạt. Khi vết thƣơng có mô hạt tốt thì các tế bào biểu mô từ bờ mép vết thƣơng mới tăng sinh và di cƣ vào phía trung tâm vết thƣơng để làm lành hoàn toàn vết thƣơng hoặc phải ghép da nếu đƣờng kính tổn thƣơng trên 5 cm. Thông thƣờng vết bỏng sâu hoặc vết thƣơng mất da sẽ có tổ chức hạt tốt sau 10-15 ngày nếu vết thƣơng không bị nhiễm khuẩn và sạch hoại tử. Hình thành mô hạt sớm sẽ tạo điều kiện để ghép da tự thân sớm, che phủ đóng kín vết thƣơng, hạn chế các biến chứng nhƣ suy mòn, nhiễm khuẩn [3],[7],[53]. Tùy thuộc vào diện tích, độ sâu của vết bỏng, sức đề kháng của cơ thể, vết bỏng cơ bản tiến triển theo ba giai đoạn đan xen và kế tiếp nhau là: Giai đoạn cấp tính, giai đoạn tái tạo và giai đoạn hình thành sẹo [53],[85]. Giai đoạn cấp tính với biểu hiện viêm cấp, xuất tiết, viêm nhiễm mủ, rụng hoại tử và làm sạch vết bỏng. Giai đoạn này khởi đầu ngay sau bỏng và bắt đầu bằng đáp ứng tuần hoàn, thể hiện ở phản ứng vi mạch: sung huyết, giãn mạch, tăng tính thấm dẫn tới thoát dịch rỉ viêm và tạo phù nề. Tại vùng bỏng có sự đáp ứng của tế bào viêm: bạch cầu đa nhân trung tính, tiếp theo là đại thực bào, muộn hơn là lympho bào. Tế bào viêm có nhiệm vụ loại bỏ hoại tử, diệt vi khuẩn, khởi động và điều hòa sự liền vết thƣơng. 4 Giai đoạn viêm, tùy theo diện tích và độ sâu của tổn thƣơng bỏng mà có thể kéo dài 3 – 7 ngày hoặc chồng lấn giai đoạn tái tạo. Giai đoạn tái tạo: Đặc trƣng giai đoạn tái tạo là sự tăng sinh của các tế bào liền vết thƣơng nhƣ nguyên bào sợi và tế bào sừng. Biểu hiện lâm sàng của giai đoạn này là hình thành mô hạt, biểu mô hóa từ bờ mép hoặc từ đáy vết thƣơng. - Bỏng biểu bì tự liền bằng quá trình tái sinh biểu bì, bắt nguồn từ tế bào mầm. Sự tái tạo bỏng trung bì bắt nguồn từ các tế bào biểu mô còn sót lại ở các phần phụ của da, kết hợp biểu mô hóa từ bờ mép để phủ kín vết bỏng. - Với bỏng sâu toàn bộ da, sự tái tạo sau khi hoại tử rụng, các quá trình cơ bản là hình thành mô hạt và theo sau là biểu mô hóa từ bờ mép vết thƣơng hoặc phủ kín mô hạt bằng các mảnh da ghép. Tạo mô hạt thƣờng bắt đầu từ ngày thứ 3 – 4, hoàn thành vào ngày 21 sau bỏng [13]. Mô hạt gồm có các tân mạch, các tế bào mới và chất nền. Trong quá trình liền vết thƣơng, nguyên bào sợi (fibroblasts) đƣợc hoạt hóa, tăng sinh và tái tổng hợp fibronectin, tiếp đó là các protein ngoại bào gồm có collagen, elastin và các glycosaminoglycan. Mô hạt là tổ chức liên kết tân tạo, là cơ sở cho quá trình biểu mô hóa. Biểu mô hóa phủ kín lớp mô hạt sẽ kết thúc quá trình tái tạo. Tuy nhiên, chỉ có các vết thƣơng nhỏ thì cơ thể mới tự làm liền hoàn toàn vết thƣơng. Đối với vết bỏng sâu có đƣờng kính tổn thƣơng > 5cm thì việc liền vết thƣơng cần phải ghép da tự thân để che phủ kín tổn thƣơng. Các trƣờng hợp tổn khuyết quá rộng, không đủ da ghép vẫn đang là những thách thức lớn trong việc cứu sống tính mạng bệnh nhân đòi hỏi có những phƣơng pháp khác thay thế nhƣ ghép vật liệu thay thế da hay ghép tế bào. Giai đoạn hình thành sẹo: Đây là giai đoạn kéo dài nhất của quá trình liền vết bỏng: bắt đầu từ khi liền sẹo, kéo dài 12 – 24 tháng hoặc hơn. Bỏng biểu bì chủ yếu để lại rối loạn sắc tố, bỏng trung bì thƣờng để lại sẹo nhƣng 5 mềm mại, bỏng toàn bộ da hoặc sâu hơn để lại các hình thái sẹo khác nhau [12], [13]. 1.1.2. Các tế bào chủ yếu tham gia liền vết thƣơng Quá trình liền vết thƣơng có nhiều cơ chế phức tạp nhƣng kết quả cuối cùng là tái lập lại các mô tế bào đã bị tổn thƣơng. Do đó quan niệm mới trong điều trị các tổn thƣơng ở bất cứ cơ quan nào trong cơ thể là các tế bào tổn thƣơng phải đƣợc thay thế bằng các tế bào khoẻ mạnh. Để duy trì chức năng bảo vệ cơ thể, con ngƣời cần có da. Thành phần tế bào da ngƣời chủ yếu gồm 2 loại là nguyên bào sợi và tế bào sừng. Nguyên bào sợi là tế bào tạo lớp trung bì còn tế bào sừng tạo ra lớp biểu bì. Hai loại tế bào này có những chức năng khác nhau nhƣng lại tƣơng tác, kết hợp với nhau để tạo ra cấu trúc da hoàn chỉnh. Hai loại tế bào này cũng là những tế bào chủ yếu làm lành các tổn thƣơng da. Khi da bị tổn thƣơng, nguyên bào sợi là tế bào tổng hợp nên đệm gian bào, tiết các yếu tố tăng trƣởng tạo điều kiện để tế bào sừng từ bờ mép vết thƣơng tăng sinh che phủ bề mặt làm lành vết thƣơng [6],[7],[8],[85]. 1.1.2.1. Nguyên bào sợi, vai trò của nguyên bào sợi trong liền vết thƣơng Nguyên bào sợi là tế bào có các nét đặc trƣng tƣơng tự nhau về hình thái, về các dấu ấn sợi trung gian trung mô, về vimentin [112],[113]. Tuy nhiên, khi phân tích ADN thì các nghiên cứu đều cho thấy các nguyên bào sợi khác nhau đều có các biểu hiện gen của nó, các đặc tính phenotyp, các protein đệm gian bào và các cytokin mang tính đặc thù khu vực [112],[114]. Nguyên bào sợi đƣợc tạo ra từ các tế bào trung mô nguyên thủy type 1 có thể biệt hóa thành dạng tế bào nội mạch và quanh mạch [115],[116]. Trong những tuần đầu tiên của sự phát triển da thai kỳ, trung bì bao gồm mạng lƣới dày đặc các tế bào trung mô cho thấy nhiều sự tƣơng tác giữa các tế bào tiếp xúc gần nhau để tạo ra các tín hiệu giữa các tế bào và ảnh hƣởng tới sự biệt 6 hóa tế bào [117]. Từ tuần thứ 14-21 của thai, sự tiếp xúc giữa các tế bào gần nhau làm cho nguyên bào sợi mất dần các tua nhánh bào tƣơng và nguyên bào sợi khi đó giống nhƣ nguyên bào sợi da trẻ sơ sinh, đó là các tế bào có dạng hình thoi và lƣới nội bào lồi lõm cùng với nhân hình elip. Ở giữa trung bì da trẻ sơ sinh, mật độ nguyên bào sợi từ 2.100 đến 4.100 cho mỗi mm 3 mô, khả năng sao chép đạt 50 - 100 lần phân chia tế bào [118],[124]. Nguyên bào sợi trong lớp nhú hay lớp lƣới của trung bì hoặc gần vùng nang lông đều không phân biệt đƣợc trên in vivo nhƣng khi nuôi cấy chúng biểu hiện sự khác nhau đáng kể về khả năng tăng trƣởng, hình thái tế bào, sự tổng hợp protein đệm gian bào và sự giải phóng cytokine [107]. Đáng chú ý là nguyên bào sợi từ lớp nhú trung bì xuất hiện nhỏ hơn, phát triển nhanh hơn, có số lần phân chia nhiều hơn và ít có dấu hiệu bị ức chế tiếp xúc do mật độ tế bào tăng lên [8],[96]. Khi đồng nuôi cấy với tế bào sừng, nguyên bào sợi lớp nhú trung bì tạo ra trung bì có cấu trúc tổ chức và chuyên biệt hơn cùng với việc tạo ra sự kết nối hoàn chỉnh giữa trung bì và biểu bì. Nguyên bào sợi lớp nhú cũng tạo ra nhiều yếu tố kích thích dòng đại thực bào mô hạt (GM-CSF) hơn và ít liên quan tới yếu tố tăng trƣởng tế bào sừng (KGF) hơn các nguyên bào sợi ở lớp lƣới trung bì [131],[132]. Hơn nữa, chúng cũng có sự khác nhau trong việc tổng hợp các thành phần đệm gian bào nhƣ decorin [109] [111],[112]. Nguyên bào sợi từ lớp nhú và mô trung bì gần nang lông cũng có một số nét phân biệt với nhau nhƣng khi trong quá trình liền vết thƣơng chúng có thể giống nhƣ nguyên bào sợi cơ [111]. Nguyên bào sợi cơ (myofibroblasts) là một dạng đặc biệt của nguyên bào sợi đƣợc tìm thấy tại mô hạt và có vai trò rất quan trọng trong quá trình co rút vết thƣơng. Chúng có sự khác biệt về chức năng so với các nguyên bào sợi khác là do chúng có các đặc tính sinh lý, hóa học và siêu cấu trúc giống nhƣ tế bào cơ trơn [113],[115]. Hơn nữa, nguyên bào sợi cơ cũng 7 đƣợc đặc trƣng bởi sự có mặt trong bào tƣơng lƣợng lớn alpha smooth muscle actin là các sợi đồng dạng với sợi actin trong tế bào cơ trơn [18],[22]. Trong quá trình liền vết thương, nguyên bào sợi là tế bào chủ chốt của phase tăng sinh tái tạo mô. Khi da bị thƣơng, nguyên bào sợi đƣợc kích hoạt để tăng sinh, di cƣ và biệt hóa. Sau khi bị thƣơng, các tế bào đầu dòng của tế bào sợi từ tủy xƣơng có thể di cƣ tới vùng thƣơng tổn mặc dù nguồn chính của nguyên bào sợi vết thƣơng là đƣợc di cƣ từ các nguyên bào sợi ở vùng da lành quanh vết thƣơng [8],[20],[25]. Các yếu tố hấp dẫn sự dịch chuyển của tế bào đƣợc dẫn dắt bởi thành phần đệm riêng biệt. Ví dụ nhƣ đệm vết thƣơng tạm thời là thành phần giàu fibrin, fibronectin, acid hyaluronic và sự tồn tại của một số ít collgen. Với sự có mặt của PDGF và môi trƣờng đệm tạm thời, thụ thể alpha5 beta1 intergrin đƣợc điều chỉnh trên bề mặt nguyên bào sợi để cho phép chúng kết dính với fibronectin và sau đó di cƣ đến vết thƣơng [13],[15]. Khi nguyên bào sợi lấp đầy tổn thƣơng, chúng thay thế đệm tạm thời bằng tổ chức hạt và cùng với sự có mặt của môi trƣờng giàu collgen, có sự biểu hiện tăng lên thụ thể alpha2 beta1 và giảm thụ thể alpha5 beta1 [13]. Theo tuần tự nhƣ thế, nguyên bào sợi gắn với collagen và không di chuyển nữa diễn ra thông qua sự ảnh hƣởng của yếu tố hấp dẫn fibronectin. Hơn nữa, để quá trình di cƣ tế bào diễn ra, sự giáng hóa đệm gian bào đƣợc yêu cầu thông qua sự giải phóng các enzym giáng hóa protein, nhƣ các metalloproteinases đệm và cystein proteinases từ tế bào sừng, nguyên bào sợi và đại thực bào, các yếu tố này bị ảnh hƣởng bởi các cytokin nhƣ interleukin-1 (IL-1), PDGF, TGF-beta và sự tiếp xúc của tế bào sau đó với các thành phần đệm gian bào bao gồm fibronectin hoặc các mảnh vỡ fibronectin [50],[51],[52]. Nguyên bào sợi tạo ra các thành phần đệm gian bào làm nền cho quá trình biểu mô hóa và cung cấp các sợi laminin, decorin, elastin, fibronectin để 8 tế bào biểu mô bám và trƣợt trên đó, giúp tăng nhanh quá trình biểu mô hóa che phủ vết thƣơng. Chúng tạo ra protein đệm mà trong đó collagen tạo nên sự bền vững và toàn vẹn của mô. Đồng thời nguyên bào sợi là nguồn cung cấp quan trọng một số yếu tố tăng trƣởng (growth factors - GF) kích thích liền vết thƣơng nhƣ TGF, PDGF, KGF [53],[54],[61]. Hơn nữa, nguyên bào sợi chuyển dạng thành myofibroblasts tạo nên sự co rút và liền vết thƣơng nhanh hơn. Nguyên bào sợi còn tham gia vào giai đoạn sửa chữa sẹo diễn ra trong nhiều năm sau khi vết thƣơng đó liền [8],[17]. Nguyên bào sợi giải phóng ra các cytokin và các yếu tố tăng trƣởng mà có tác dụng nhƣ yếu tố tác động nội lai (autocrine) hay ngoại lai của tế bào (paracrine). Tác động nội lai ảnh hƣởng đến sự tổng hợp TGF-beta và tiết yếu tố tăng trƣởng mô liên kết vốn có tác dụng thúc đẩy tổng hợp collagen và cả sự tăng sinh nguyên bào sợi [62],[67]. Tác động ngoại lai ảnh hƣởng đến sự tăng trƣởng và biệt hóa tế bào sừng đặc biệt thông qua một số chất tiết của nguyên bào sợi nhƣ KGF, IL-6 và FGF-10 [69]. Đáp lại ảnh hƣởng này, tế bào sừng tổng hợp IL-1 và hormone kích thích ngƣợc trở lại nguyên bào sợi sản xuất KGF và nhƣ vậy tồn tại 2 vòng tác động ngoại lai [69],[85],[86]. Nguyên bào sợi cũng chịu trách nhiệm tạo ra màng nền bởi sự tổng hợp collagen type IV và VII, laminin 5 và nidogen, cũng thông qua sự tiết cytokin (ví dụ TGF-beta) để kích thích tế bào sừng sản xuất các thành phần của màng nền [19],[31]. Hơn nữa, nguyên bào sợi còn chịu trách nhiệm đối với việc hình thành các mạch tân tạo và các bạch mạch mới bởi sự tổng hợp các yếu tố thuộc họ tăng trƣởng tế bào nội mạch (VEGF) -A, -B, -C và –D [52],[124], [126]. Cũng có chứng cớ cho rằng TGF-β1 có thể kích thích tổng hợp mới các VEGF-B, C và-D trên in vivo và nhƣ vậy nguyên bào sợi có vai trò tác động ngoại lai quan trọng với các tế bào lympho và nội mạch để duy trì tính hằng định nội mô của da [118],[119]. 9 Một tuần sau khi cắt tạo vết thƣơng da, nguyên bào sợi cơ chiếm ƣu thế trong vết thƣơng và có hình dạng khác so với nguyên bào sợi bình thƣờng. Ngoài sợi alpha smooth muscle actin, nguyên bào sợi cơ còn phát triển những nếp gấp sâu trong màng nhân và có nhiều kết nối tế bào, các đặc tính này hỗ trợ cho việc các tế bào thực hiện co rút vêt thƣơng [8],[39],[40]. Sự biệt hóa thành nguyên bào sợi cơ đƣợc cho là kết quả của sự kết hợp các lực cơ học đƣợc sinh ra do sự di cƣ nguyên bào sợi và sự có mặt của TGF-β cũng nhƣ fibronectin [8],[126]. Tiếp sau quá trình tái biểu mô hóa, nguyên bào sợi cơ có thể trải qua quá trình tự chết hoặc quay trở lại dạng tế bào không co rút [8],[31]. Trong quá trình liền vết thƣơng, đệm ban đầu chứa fibronectin và acid hyaluronic dần đƣợc thay thế bởi các collagen khoảng kẽ gồm type I và type III, quá trình này đƣợc kiểm soát thông qua sự ảnh hƣởng của các cytokin nhƣ TGF-beta, IL-1, và các sản phẩm giáng hóa trong sự tƣơng tác với nguyên bào sợi [47],[62],[64]. Các collagen khoảng kẽ đƣợc tổng hợp bởi nguyên bào sợi tạo ra các đa peptid procollagen đƣợc trùng hợp sau khi đƣợc tiết ra khỏi tế bào. Các nguyên bào sợi còn sản xuất ra các sợi chun và các glycosaminiglycan. Trong giai đoạn sớm của quá trình sửa chữa vết thƣơng, acid hyaluronic chiếm ƣu thế ban đầu nhƣng sau dần đƣợc thay thế bởi các glycosaminoglycan sulphat, decorin và versican. Sự thay đổi này tƣơng phản với sự phát hiện rằng da bào thai khi bị thƣơng thì không tạo sẹo vấn đề đƣợc cho là có liên quan chặt chẽ đến tỷ lệ collagen type I:III thấp hơn dẫn đến đệm có tính đàn hồi linh hoạt hơn và mức acid hyaluronic đƣợc nâng lên làm hạn chế tối đa sự ức chế tiếp xúc giữa các nguyên bào sợi đang tăng sinh [62],[69],[71]. Để chuyển tổ chức mô hạt thành sẹo ổn định, nguyên bào sợi tổng hợp protein đệm cũng nhƣ các enzym metalloproteinase. Cả hai đều quan trọng với quá trình tái lập mô và cung cấp sự cân bằng giữa tạo mô và hủy mô. Sự 10 điều tiết các hoạt động của chúng bị ảnh hƣởng bởi vi môi trƣờng vết thƣơng, các nghiên cứu đều chỉ ra các nét biểu hiện tƣơng đồng trong các giai đoạn liền vết thƣơng [69],[85]. Nhờ có đặc tính tăng sinh, tạo cấu trúc trung bì và liền vết thƣơng, nguyên bào sợi là một trong dạng tế bào đƣợc ứng dụng phổ biến trong chế tạo vật liệu thay thế trung bì, hỗ trợ trong nuôi cấy tế bào sừng để chế tạo tấm biểu bì cũng nhƣ trong chế tạo da hai lớp. 1.1.2.2. Tế bào sừng Tế bào sừng tạo nên lớp biểu bì bảo vệ cơ thể, gồm nhiều lớp tế bào sắp xếp chặt chẽ với nhau. Lớp mầm hay cũng gọi là lớp đáy chứa các tế bào gốc biểu bì có khả năng tự tồn tại, tự tái sinh nhiều lần và nhanh trong suốt cuộc sống của con ngƣời. Giữa các tế bào sừng có các cầu nối gian bào (desmosome) làm kết nối chặt chẽ giữa chúng với nhau. Các tế bào lớp đáy có cấu trúc cầu nối khác với các lớp ở trên, chúng có thể dễ dàng bị xoá bỏ và cũng tự tái tạo lại để các tế bào sừng mới sinh ra di chuyển lên trên tạo ra các lớp tế bào biệt hoá ở phía trên. Trong các tế bào của lớp mầm biểu bì thì chỉ có 10% là tế bào mầm biểu bì, còn lại là các tế bào đang ở các giai đoạn gián phân. Bình thƣờng, sự phân chia tế bào sừng lớp mầm cân bằng với sự sừng hoá bong vảy của biểu bì nhƣng khi da bị tổn thƣơng thì chúng tăng cƣờng phân chia để tạo ra nhiều tế bào biểu mô. Các tế bào biểu mô sẽ di cƣ vào trung tâm của vết thƣơng ở dạng đơn lớp cho đến khi các tế bào tiếp xúc trực tiếp với nhau thì tốc độ phân chia chậm lại và biệt hoá thành các lớp gai, lớp hạt, lớp sừng ở phía trên để thực hiện chức năng bảo vệ của biểu bì. Trong quá trình di cƣ, chúng cần đệm gian bào đủ chất lƣợng nhƣ trung bì, chúng cần có các sợi decorin, laminin…để bám vào và trƣợt dọc theo các sợi đó để di chuyển vào trung tâm vết thƣơng. Trong trƣờng hợp các vết thƣơng mạn tính, cấu trúc đệm gian bào bị tổn thƣơng không hồi phục, vết thƣơng trở nên [...]... học TP Hồ Chí Minh Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc thần kinh, máu, mắt, răng…- Phòng thí nghiệm tế bào gốc – Đại học khoa học tự nhiên, TPHCM [20] Biệt hóa tế bào gốc màng dây rốn thành tế bào gan – BV Nhi Trung Ƣơng [20] 21 Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc máu cuống rốn ngƣời thành nguyên bào xƣơng, tế bào sừng, tạo tấm tế bào sừng, tạo tấm tế bào rìa giác mạc ứng dụng điều trị - Bộ Môn di truyền – Đại... hiệu quả ghép tế bào gốc trung mô màng dây rốn trong điều trị vết thƣơng bỏng nhiệt thực nghiệm – Viện Bỏng Quốc Gia [20] “Đánh giá hiệu quả điều trị tế bào gốc trung mô, biểu mô màng dây rốn trong điều trị vết thƣơng mất da trên chuột tăng đƣờng máu” – Bệnh Viện Y học cổ truyền Trung ƣơng năm 2008 [20] 1.3.3 Các tiềm năng ứng dụng tế bào gốc Hình 1.3: Khả năng nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc 22 Hình... jelley - Tế bào gốc từ màng ối Tế bào gốc trƣởng thành: tủy xƣơng, máu ngoại vi, da, cơ , mỡ - Tế bào gốc từ tủy xƣơng 23 Hình 1.5: Khả năng biệt hóa của tế bào gốc tủy xương - Tế bào gốc từ mỡ Hình 1.6: Khả năng ứng dụng trị liệu của tế bào gốc mỡ 24 1.3.4 Biệt hóa tế bào gốc thành các tế bào da dùng trong điều trị vết thương Tuỷ xƣơng, máu ngoại vi, máu cuống rốn đều đã đƣợc sử dụng điều trị vết thƣơng... dụng trị liệu tế bào gốc Tế bào gốc phôi: - Tạo động vật chuyển gen mong muốn - Tạo các sản phẩm protein mong muốn - Sửa chữa 1 số bệnh nan y: sử dụng trực tiếp hoặc phối hợp trong trị liệu gen [8] Tế bào gốc từ mô thai nhi: - Sử dụng để tạo ra các chế phẩm có nguồn gốc tế bào gốc Tế bào gốc nhũ nhi: - Tế bào gốc trong máu dây rốn: TBG tạo máu, TBG trung mô - Tế bào gốc từ màng dây rốn - Tế bào gốc. .. công nghệ mô đều cần có các tế bào sừng biệt hóa hoặc là các tế bào đầu dòng của tế bào sừng hơn là các tế bào gốc chƣa biệt hóa để có thể cấy và tế bào bám dính đƣợc vào các loại đệm tổng hợp nhân tạo [101],[102] 1.3.4.1 Biệt hóa tế bào gốc trung mô thành nguyên bào sợi Tế bào gốc trung mô sở hữu khả năng tự đổi mới và biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau và có mặt trong nhiều nguồn mô cung cấp... phân tử này cũng đều biểu hiện ở tế bào gốc trung mô màng dây rốn [16],[70] và đây cũng là cơ sở khẳng định tế bào này có tính gốc mạnh hơn so với các tế bào trung mô khác Từ những ƣu điểm của tế bào gốc trung mô dây rốn, cùng với nhu cầu điều trị vết thƣơng vết bỏng, chúng tôi tiến hành đề tài để khảo sát một số đặc 32 điểm của tế bào gốc trung mô có liên quan đến liền vết thƣơng Với những kết quả khảo... Nhƣng các nghiên cứu về cảm ứng biệt hóa tế bào gốc trung mô dây rốn thành nguyên bào sợi da còn ít 26 1.3.4.2 Biệt hóa tế bào gốc thành tế bào sừng Một tiến bộ đạt đƣợc trong việc chuyển tế bào gốc phôi và tế bào gốc trƣởng thành không có nguồn gốc biểu bì thành dòng tế bào sừng in vitro là để các tế bào tiếp xúc với hỗn hợp các cytokin, yếu tố tăng trƣởng, hóa chất ngoại lai và đệm gian bào qua một... ngành vết thƣơng và vật liệu thay thế da là ở chỗ các tế bào gốc từ màng dây rốn bao gồm tế bào gốc trung mô và tế bào gốc biểu mô tƣơng đƣơng với thành phần của da là tế bào lớp trung bì và tế bào lớp biểu bì [119] Cả hai loại tế bào gốc biểu mô và trung mô màng dây rốn đều có 2 loại marker là: Oct 4 (Octamer 4) và Nanog (Pluripotency Sustaining ES Cell Factor) Đây là các yếu tố cần thiết duy trì tế bào. .. tế bào trung mô dây rốn [29],[35] Tổng hợp lại từ các công trình đó thấy rằng đã có rất nhiều chỉ tiêu xét nghiệm dấu ấn tế bào để khẳng định tính gốc của tế bào trung mô dây rốn trong đó có cả các dấu ấn mang tính đặc thù của tế bào gốc nói chung nhƣ OCT3/4, Nanog Do đó có thể nói tế bào gốc trung mô này thực sự là loại tế bào trung mô đa tiềm năng (multipotent mesenchymal stroma cells) [119] Tế bào. .. ghép tế bào gốc trung mô hoặc chế tạo vật liệu thay thế da từ tế bào gốc trung mô nhằm cải thiện và nâng cao chất lƣợng điều trị vết thƣơng vết bỏng hiện nay 33 CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Thỏ thí nghiệm bao gồm 02 lô: Lô 1, gồm 15 thỏ dùng để đánh giá tính sinh miễn dịch của tế bào gốc trung mô màng dây rốn ngƣời khi ghép dị loại Lô 2, gồm 30 thỏ dùng để đánh . giá hiệu quả ghép tế bào gốc trung mô màng dây rốn trong điều trị vết thương bỏng nhiệt thực nghiệm 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. QUÁ TRÌNH LIỀN VẾT THƢƠNG, VẾT BỎNG 1.1.1. Diễn. dụng tế bào gốc trong điều trị bệnh Tế bào gốc máu dây rốn đƣợc phát hiện, phân lập năm 1998, loại tế bào này biệt hoá đƣợc thành tế bào sụn trong điều kiện nuôi cấy. Năm 2003-2004 biệt hoá tế. dụng tế bào gốc trong điều trị bệnh, cần phải tiến hành các bƣớc nhƣ sau: - Phân lập, bảo quản tế bào gốc, tăng sinh nhân rộng số lƣợng tế bào gốc. - Biệt hoá hoặc định hƣớng biệt hóa tế bào gốc