CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.2. Kết quả phân tích bằng flowcytometry mức độ biểu hiện
HLA-DR của tế bào gốc trung mô màng dây rốn.
Qua 15 mẫu thí nghiệm;
Mức độ biểu hiện HLA-DR chiếm 1,9 ± 1,53%
Mức độ biểu hiện dấu ấn CD90 đặc thù của tế bào gốc trung mô đạt tới 92,65 ± 6,3%.
Nhƣ vậy, tế bào gốc trung mơ dây rốn có biểu hiện cao về dấu ấn CD90 đặc thù và các kháng nguyên hòa hợp tổ chức HLA -DR, HLA-E, HLA-G.
3.1.2.2. Tính sinh miễn dịch của tế bào gốc trung mô dây rốn
Tế bào gốc trung mô đƣợc bảo quản lạnh sâu, sau đó đƣợc giải đơng lạnh và nuôi lại vào đĩa Petri môi trƣờng nuôi cấy tế bào gốc trung mô. Tế bào đƣợc chia làm 2 phần. Lấy khoảng 1/2 lƣợng tế bào vào một phiến nhựa 96 giếng nuôi cấy mới. Để tủ ấm tiếp tục nuôi cấy đợi tế bào mọc lan ra tồn
bộ. Cịn 1/2 lƣợng tế bào đem phá vỡ tế bào bằng siêu âm, định lƣợng protein bằng phƣơng pháp Bradford.
Biểu đồ 3.3. Phát hiện kháng thể thỏ kháng tế bào gốc với kháng nguyên siêu nghiền bằng xét nghiệm ELISA
Kết quả phát hiện kháng thể thỏ kháng tế bào gốc với kháng nguyên là tế bào siêu nghiền, ở các nồng độ pha loãng kháng thể 1/500, 1/100, 1/50, 1/10 ở các thời điểm lấy mẫu D0; D15; D30; D60.
Ở thời điểm D0 ngay sau khi ghép tế bào chƣa có đáp ứng tạo kháng thể, kháng thể đặc hiệu xuất hiện và cao nhất ở thời điểm D15.
Mật độ quang học phụ thuộc rất rõ rệt vào hiệu giá kháng thể: với hiệu giá kháng thế 1/500 thì mật độ quang học là (0,0538); với hiệu giá kháng thể 1/100 thì mật độ quang học là (0,12478); với hiệu giá kháng thể 1/50 thì mật độ quang học là (0,1963); với hiệu giá kháng thể 1/10 thì mật độ quang học (0,4223).
Kháng thể đặc hiệu tăng cao ở D15 nhƣng giảm mạnh ở thời điểm D30, D60.
Biểu đồ 3.4. Phát hiện kháng thể thỏ kháng tế bào gốc với kháng nguyên là tế bào nguyên vẹn
Kết quả tìm kháng thể thỏ kháng tế bào gốc với kháng nguyên là tế bào nguyên vẹn bằng kỹ thuật ELISA với các nồng độ pha loãng kháng thể 1/500, 1/100, 1/50, 1/10 tại thời điểm lấy mẫu D0; D15; D30; D60 cũng tƣơng tự nhƣ kết quả khi sử dụng kháng nguyên siêu nghiền để phát hiện kháng thể thỏ.
Ở thời điểm D0 ngay sau khi ghép tế bào chƣa có đáp ứng miễn dịch, kháng thể đặc hiệu xuất hiện và cao nhất ở thời điểm D15: 1/500 (0.0509); 1/100 (0.0969); 1/50 (0.128); 1/10 (0.2083). Kháng thể đặc hiệu giảm dần ở thời điểm D30, D60.
Biểu đồ 3.5. So sánh khả năng phát hiện kháng thể thỏ kháng tế bào gốc với kháng nguyên là tế bào siêu nghiền và tế bào nguyên vẹn
Biểu đồ 3.5 cho thấy mật độ quang học khi phát hiện kháng thể với độ pha loãng 1/100 bằng kháng nguyên siêu nghiền và kháng nguyên là tế bào nguyên vẹn.
Khi sử dụng kháng nguyên siêu nghiền thì mật độ quang học thu đƣợc là D0 (0.0424); D15 (0.12478); D30 (0.0568); D60 (0.0575) cao hơn khi sử dụng kháng nguyên là tế bào gốc nguyên vẹn với D0 (0.042); D15 (0.0969); D30 (0.05); D60 (0.052).
Nhƣ vậy, qua 3 biểu đồ, kết quả cho thấy tế bào gốc màng dây rốn kích thích sinh miễn dịch kháng tế bào gốc yếu và không bền.
3.1.3. Khả năng biệt hóa của tế bào gốc trung mơ thành ngun bào sợi 3.1.3.1. Thay đổi về hình thái và dấu ấn tế bào trong q trình biệt hóa 3.1.3.1. Thay đổi về hình thái và dấu ấn tế bào trong q trình biệt hóa
Bảng 3.4. Tỷ lệ % hình dạng tế bào biệt hóa qua các thế hệ tế bào
Thế hệ tế
bào Hình sao Hình thoi Hình sợi
Hình dạng khác
P5 69,0 19,9 5,9 5,2
P10 35,8 47,8 9,8 0,6
P15 23,4 61,5 15,1 00
Tỷ lệ các tế bào hình thoi và sợi tăng dần theo các thế hệ tế bào khi nghiên cứu nuôi cấy trong môi trƣờng định hƣớng biệt hóa.
A B
Ảnh 3.7. Biến đổi hình thái tế bào ngày thứ 7 trong q trình biệt hóa. (A) Tế bào gốc trung mơ đối chứng. (B) Tế bào dạng nguyên bào sợi trong môi trường định hướng (soi ngược 50X)
Bảng 3.5. Phân tích hình thái và nhận xét sự biến đổi hình thái tế bào trong q trình biệt hóa qua các thế hệ tế bào trong q trình biệt hóa qua các thế hệ tế bào
P Hình dạng Bào tƣơng Nhân
P5
Đa số tế bào hình sao và hình thoi, có một số tế bào hình ovan và đa diện, rất ít tế bào hình sợi dài và mảnh.
Bào tƣơng trải rộng, thấy rõ các nhánh bào tƣơng,
Đa số hình trứng và hình tron, kích thƣớc to, khoảng bào tƣơng từ nhân đến màng tế bào còn rộng, khơng có hình nhân qi. Một số nhân tế bào nhỏ hơn thuộc về các tế bào có hình dạng sợi dài, khoảng bào tƣơng từ nhân đến màng tế bào hẹp.
P10
Các tế bào hình sao và hình thoi là chủ yếu nhƣng số các tế bào hình thoi chiếm ƣu thế, các tế bào hình sao ít hơn, nhiều tế bào hình sợi dài, khơng thấy tế bào hình oavn và đa diện
Bào tƣơng trải rộng, thấy rõ, các nhánh bào tƣơng kéo dài về 2 cực của tế bào
Đa số nhân hình trứng, chỉ có một số nhân hình trịn, kích thƣớc nhân to, khơng có nhân qi.
Số lƣợng tế bào có nhân nhỏ nhiều hơn P5
P15
Các tế bào hình sợi dài chiếm ƣu thế, cịn ít tế bào hình thoi và hình sao. Khơng cịn tế bào hình oval và đa diện
Bào tƣơng trải rộng và dài về 2 cực của tế bào, Hầu hết nhân hình trứng thn về hai cực của tế bào, hình dạng nhẵn, khơng có nhân quái.
A
B
Ảnh 3.8. Biến đổi hình thái tế bào. (A) Tế bào gốc trung mô đối chứng ở P1 đa số hình sao và hình thoi. (B) Tế bào biệt hóa từ tế bào gốc chứng ở P1 đa số hình sao và hình thoi. (B) Tế bào biệt hóa từ tế bào gốc trung mơ P5, tế bào thn dài, chủ yếu hình thoi, các tế bào nằm cạnh nhau và phát triển đạng xoáy. (giemsa 100x)
Bảng 3.6. Tỷ lệ % hình dạng nhân tế bào biệt hóa
Thế hệ tế bào
Nhân tế bào biệt hóa Hình trịn Hình trứng Đang phân
chia Nhân quái
P5 70,7 26,2 3,1 00
P10 38,8 58,0 3,4 00
P15 17,4 80,9 1,7 00
Tỷ lệ tế bào có nhân hình trứng là hình dạng đặc trƣng của nhân nguyên bào sợi, hình dạng này tăng dần theo các thế hệ tế bào biệt hóa. Các tế bào vẫn giữ đƣợc khả năng phân chia.
Ảnh 3.9. Hình dạng tế bào và bào tương tế bào biệt hóa dạng nguyên bào sợi, tế bào dạng hình thoi, dài (soi nổi 50X)
Ảnh 3.10. Hình dạng nhân và bào tương tế bào biệt hóa dạng nguyên bào sợi. Tế bào dạng hình thoi, dài nhân hình trứng (giemsa 100X)
A B
Ảnh 3.11. Hình thái siêu cấu trúc ảnh tế bào biệt hóa. Tế bào có những nếp gấp bào tương các bào quan phong phú, có nhiều hạt chế tiết (A những nếp gấp bào tương các bào quan phong phú, có nhiều hạt chế tiết (A -5.000X); Lưới nội bào có hạt phát triển dầy đặc trong bào tương, một số có hạt chế tiết, (B - 30.000X)
3.1.3.2. Khả năng chế tiết collagen và tạo tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì của tế bào gốc trung mơ
Bảng 3.7. Hàm lượng collagen hịa tan (µg/ml)
Mẫu xét nghiệm Nhóm tế bào Nhóm chứng (TBGTM) Nhóm nghiên cứu (NBS biệt hóa) P
Mơi trƣờng ni cấy
(n=5) 0,045 ± 0,002 0,046 ± 0,001 >0,05 Dịch nổi nuôi cấy
(n=5) 0,069 ± 0,003 0,297 ± 0,011 <0,01
P >0,05 <0,001
Ở môi trƣờng tăng trƣởng, hàm lƣợng collagen chính là lƣợng collagen hịa tan ở huyết thanh bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy. Hàm lƣợng collagen ở dịch nổi ni cấy trƣớc khi biệt hóa tế bào là giống nhau giữa mẫu tế bào chuẩn bị biệt hóa và mẫu tế bào khơng tiến hành biệt hóa.
Trong dịch nổi nuôi cấy tế bào gốc trung mô, tuy hàm lƣợng collagen ở dịch nổi ni cấy tế bào có cao hơn so với trong môi trƣờng tăng trƣởng nhƣng không đáng kế.
Hàm lƣợng collagen ở dịch nổi tế bào nguyên bào sợi biệt hóa từ tế bào gốc trung mơ cao hơn so với chính mơi trƣờng tăng trƣởng trƣớc khi nuôi cấy (p<0,001) và cao hơn so với dịch nổi nuôi cấy tế bào gốc trung mô trong cùng khoảng thời gian nuôi cấy (p<0,01).
Nhƣ vậy, tế bào biệt hóa từ tế bào gốc trung mơ dây rốn có khả năng tổng hợp collagen mạnh hơn so với tế bào gốc trung mơ trƣớc biệt hóa.
Hai tuần ni cấy tính từ sau khi tế bào đạt 100% độ che phủ, các tế bào trung mơ đƣợc duy trì trong mơi trƣờng ni cấy biệt hóa, các tế bào hình thoi dài phát triển chồng lấn lên nhau khoảng 2-3 lớp đan chéo nhau theo nhiều hƣớng và có sự liên kết với nhau (ảnh 3.12a). Trong khi đó tế bào ni cấy trong điều kiện truyền thống khơng có yếu tố bổ sung, các tế bào vẫn phát triển đơn lớp, các tế bào nhiều hình dạng nằm cạnh nhau trong đó có các tế bào hình sao, hình thoi ngắn hơn (ảnh 3.12b).
A B
Ảnh 3.12. Tế bào mọc thành hai lớp đan chéo nhau ở ngày thứ 5 trong môi trường biệt hóa (a), trong khi tế bào vẫn duy trì 1 lớp ở môi trong môi trường biệt hóa (a), trong khi tế bào vẫn duy trì 1 lớp ở mơi trường tăng trưởng cho tế bào gốc trung mơ (b), (hình ảnh soi trên kính hiển vi đảo ngượi - 50X)
Khi tế bào gốc trung mô màng dây rốn phát triển trong môi trƣờng nuôi cấy, tế bào cũng có xu hƣớng tạo ra 2 lớp chồng lấn lên nhau chứ khơng phát triển hình cuộn xốy nhƣ Fibroblasts trung bì.
Theo dõi các ngày sau thay mơi trƣờng biệt hóa, thấy tế bào mọc mạnh xếp chồng lấn lên nhau, khoảng ngày thứ 6-8.
Ngày thứ 10, lớp tế bào có xu hƣớng bong bật khỏi bề mặt đĩa, lắc nhẹ đĩa hoặc dùng đầu pipet gạt nhẹ là có thể tạo ra tấm tế bào. Tấm tế bào chỉ co nhỏ hơn diện tích đáy đĩa một chút, cịn khoảng = 2/3 diện tích đĩa ni.
A B
Ảnh 3.13. Duy trì mơi trường ni cấy 2 tuần, tế bào trong mơi trường biệt hóa tạo thành tấm tế bào gốc trung mô, các tế bào mọc thành hai -3 lớp đan chéo nhau, tấm vật liệu bắt đầu bong (a), bờ mép dịch chuyển về phía trung tâm đĩa (b). (Soi nổi - 50X)
Về khía cạnh mơ học, tấm vật liệu có chứa khơng chỉ tế bào đơn thuần mà còn bao gồm cả đệm gian bào.
Tấm vật liệu cho thấy trong thành phần của chúng chứa rất nhiều tế bào dạng nguyên bào sợi.
A B
Ảnh 3.14. Hình ảnh đại thể tấm vật liệu tương đương trung bì. (a) tấm vật liệu tạo ra sau 2 tuần nuôi cấy tế bào gốc trung mô trong môi trường biệt hóa thành nguyên bào sợi trong, tấm vật liệu dai và dễ tách ra khỏi bề mặt đĩa nuôi cấy. (b) Hình thái cấu trúc trên kính hiển vi quang học nhuộm HE của tấm vật liệu tương đương trung bì, tấm vật liệu có chứa khơng chỉ tế bào đơn thuần mà còn bao gồm cả đệm gian bào, Tấm vật liệu cho thấy trong thành phần của chúng chứa rất nhiều tế bào dạng nguyên bào sợi và đệm gian bào tương đối dày. (HE, 50X)
3.2. HIỆU QUẢ GHÉP TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG BỎNG NHIỆT THỰC NGHIỆM TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG BỎNG NHIỆT THỰC NGHIỆM 3.2.1. Thay đổi một số chỉ số toàn thân và xét nghiệm của thỏ trong ghép tế bào gốc trung mô
2.32 1.96 2.06 2.13 1.7 1.8 1.9 2 2.1 2.2 2.3 2.4 kg D0 D5 D10 D15
Biểu đồ 3.6. Thay đổi cân nặng thỏ nghiên cứu
Qua biểu đồ 3.6 cho thấy: Trọng lƣợng thỏ giảm ở những ngày đầu sau khi gây bỏng thực nghiệm.
Ở thời điểm 10 ngày sau khi gây bỏng (5 ngày sau khi ghép tấm trung bì), cân nặng của thỏ bắt đầu hối phục.
Đến thời điểm 15 ngày sau khi gây bỏng (10 ngày sau khi ghép tấm trung bì), cân nặng của thỏ trở về gần với giá trị ban đầu trƣớc khi gây bỏng.
Nhƣ vậy, sự giảm trọng lƣợng trong những ngày đầu sau gây bỏng là do tính chất của chấn thƣơng cấp tính, đau đớn, vết thƣơng bỏng rộng và sâu.
Bảng 3.8. Thay đổi các chỉ số huyết học thỏ nghiên cứu Chỉ số Thời điểm Chỉ số Thời điểm D0 D5 D10 Số lƣợng hồng cầu (x1012/L) 5,56 1,67 5,67 1,69 5,84 0,12 Huyết tắc số (g/L) 120,13 1,44 125,58 2,92 131,1 2,81 Hematocrit (%) 34,41 1,81 37,25 1,56 38,10 2,10 Số lƣợng bạch cầu (x109/L) 5,26 0,36 8,27 0,72 6,26 0,56 Bạch cầu N (%) 23,05 2,41 19,90 1,67 20,69 2,42 Bạch cầu L (%) 58,24 4,30 62,20 2,26 61,58 2,19
Số lƣợng hồng cầu, nồng độ huyết sắc tố và chỉ số hematocrit giảm nhẹ ở thời điểm 5 ngày sau bỏng và bắt đầu phục hồi ở thời điểm bắt đầu nghiên cứu cấy ghép tế bào điều trị vết thƣơng. Các chỉ số này phục hồi hoàn toàn vào thời điểm ngày thứ 10 nghiên cứu (ngày thứ 15 sau bỏng).
Số lƣợng bạch cầu tăng nhẹ ở thời điểm sau gây bỏng sau đó dần trở về bình thƣờng, khơng thấy dấu hiệu tăng bạch cầu ở các thời điểm sau ghép tế bào.
Bạch cầu đa nhân trung tính (N) khơng có dấu hiệu tăng trong khi bạch cầu lympho (L) có xu hƣớng tăng ít tại các thời điểm nghiên cứu vào ngày thứ 5 và thứ 10.
Bảng 3.9. Thay đổi các chỉ số sinh hoá máu liên quan chức năng thận Chỉ số Chỉ số Thời điểm D0 D5 D10 Glucose (mmol/L) 4,79 0,31 4,96 0,35 5,27 0,33 Ure (mmol/L) 5,34 0,47 5,2 0,41 5,10 0,27 Creatinin (mol/L) 93,8 4,86 94,6 5,48 96,04 5,63
Các chỉ số sinh hoá máu thể hiện chức năng thận và chuyển hố khơng có sự thay đổi nhiều trong suốt quá trình nghiên cứu.
Giá trị các xét nghiệm này ln trong giới hạn bình thƣờng.
Bảng 3.10. Hoạt độ enzym GOT, GPT huyết thanh
Chỉ số
Thời điểm
D0 D5 D10
SGOT (U/L) 50,16 2,81 67,54 5,37 52,98 3,14 SGPT (U/L) 54,14 5,38 69,56 5,35 68,13 4,63
Hoạt độ enzyme GOT, tăng nhẹ ở ngày thứ 5 sau đó giảm nhanh xuống mức độ bình thƣờng vào ngày thứ 10.
3.2.2. Ảnh hƣởng của ghép tế bào gốc trung mô tới liền vết thƣơng
3.2.2.1. Ảnh hƣởng của ghép tế bào gốc trung mô tới diễn biến lâm sàng tại chỗ vết thƣơng
Bảng 3.11. Diễn biến lâm sàng vết thương bỏng thực nghiệm
Thời điểm Vết thƣơng Vùng A Vùng B D0 - Nền vết thƣơng ẩm, giả mạc bám dễ bóc, ít viêm nề, tiết dịch vừa. - Bờ mép vết thƣơng viêm nề nhẹ.
- Nền vết thƣơng ẩm, giả mạc bám dễ bóc, ít viêm nề, tiết dịch vừa. - Bờ mép vết thƣơng viêm nề nhẹ.
D5
- Vết thƣơng sạch, tiết dịch ít. Vẩy tiết màu vàng sậm, phía dƣới nền có tổ chức hạt và dễ rƣớm máu. Vết thƣơng khơng có mùi hơi.
- Bờ mép vết thƣơng khơng viêm nề, khơng có ban dát sẩn.
- Vết thƣơng sạch, tiết dịch ít. Vẩy tiết dễ bóc, màu vàng nhạt, cạo sạch lớp vẩy tiết bên dƣới dễ chảy máu. Vết thƣơng khơng có mùi hôi.
- Bờ mép vết thƣơng còn viêm nề và xung huyết nhẹ.
D10
- Diện tích vết thƣơng thu nhỏ, nền có tổ chức hạt đẹp màu đỏ tƣơi. - Bờ mép vết thƣơng khơng có ban dát sẩn, xuất hiện rõ biểu mơ hóa vào trung tâm vết thƣơng.
- Diện tích vết thƣơng co nhỏ lại nhƣng lớn hơn so với vùng A. Nền vết thƣơng ẩm, sạch, màu hồng nhạt, dịch tiết vừa. - Bờ mép VT không viêm nề. D15 - Nền vết thƣơng phẳng, không co dúm.
- Quầng biểu mơ hóa từ bờ mép quan sát rõ.
- Nền vết thƣơng phẳng, rƣớm máu, có dấu hiệu co rút vết thƣơng
- Có biểu mơ hóa từ bờ mép vết thƣơng lan vào trung tâm.
Bảng 3.12. Thay đổi diện tích vết thương bỏng
Thời điểm
Tỷ lệ % diện tích vết thƣơng đã liền