CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1.8. Nguồn lấy tế bào gốc dây rốn
Các TBG trung mô màng dây rốn đƣợc khảo sát với một panel các dấu ấn bề mặt khác nhau bằng kỹ thuật flowcytometry với kháng thể đặc hiệu. Kết quả phân tích định tính cho thấy TBG trung mơ màng dây rốn âm tính với các dấu ấn CD14, CD34, CD45 và HLA-DR; dƣơng tính với các dấu ấn CD13, CD44, CD90 và CD166 [4],[119]. Đây là kiểu hình chung cho nhiều TBG trung mô đã đƣợc phân lập từ máu dây rốn, tủy xƣơng [75],[138],[133], [137],[140],[141]. Đặc trƣng của tế bào gốc tủy xƣơng là CD23 và STRO-1 [35],[55],[120] nhƣng Phan TT và cộng sự thấy tế bào gốc dây rốn có CD23 nhƣng khơng có STRO-1 [120],[139].
Tác giả Troyer và Weiss đã đề cập đến nhiều dấu ấn tế bào qua cơng trình đã xuất bản về loại tế bào dạng này thu đƣợc từ dây rốn, nghiên cứu này cũng đã xác định tính đa tiềm năng của tế bào trung mô dây rốn [29],[35]. Tổng hợp lại từ các cơng trình đó thấy rằng đã có rất nhiều chỉ tiêu xét nghiệm dấu ấn tế bào để khẳng định tính gốc của tế bào trung mơ dây rốn trong đó có cả các dấu ấn mang tính đặc thù của tế bào gốc nói chung nhƣ OCT3/4, Nanog. Do đó có thể nói tế bào gốc trung mơ này thực sự là loại tế bào trung mô đa tiềm năng (multipotent mesenchymal stroma cells) [119]. Tế bào gốc trung mơ dây rốn có các biểu hiện đặc thù của các tế bào gốc trung mơ về hàng loạt các đấu ấn thể hiện tính gốc đã đƣợc mơ tả ở tế bào thu đƣợc tại một số loại mô khác của cơ thể. Tế bào gốc dây rốn có nhiều dấu ấn mà các tế bào gốc trung mô ở mơ khác khơng có [121],[123],[139]. OCT4 và Nanog đƣợc mọi ngƣời chấp nhận là những phân tử thể hiện tính gốc rõ rệt của tế bào [119],[138]. Cả hai phân tử này cũng đều biểu hiện ở tế bào gốc trung mô màng dây rốn [16],[70] và đây cũng là cơ sở khẳng định tế bào này có tính gốc mạnh hơn so với các tế bào trung mô khác .
Từ những ƣu điểm của tế bào gốc trung mô dây rốn, cùng với nhu cầu điều trị vết thƣơng vết bỏng, chúng tôi tiến hành đề tài để khảo sát một số đặc
điểm của tế bào gốc trung mơ có liên quan đến liền vết thƣơng. Với những kết quả khảo sát đó, chúng tơi hy vọng sẽ có những định hƣớng tích cực trong việc cấy ghép tế bào gốc trung mô hoặc chế tạo vật liệu thay thế da từ tế bào gốc trung mô nhằm cải thiện và nâng cao chất lƣợng điều trị vết thƣơng vết bỏng hiện nay.
CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Thỏ thí nghiệm bao gồm 02 lơ:
Lơ 1, gồm 15 thỏ dùng để đánh giá tính sinh miễn dịch của tế bào gốc trung mô màng dây rốn ngƣời khi ghép dị loại.
Lô 2, gồm 30 thỏ dùng để đánh giá hiệu quả ghép tấm tế bào gốc trung mơ điều trị vết bỏng nhiệt thực nghiệm.
Thỏ thí nghiệm đều đã trƣởng thành từ 10-12 tháng tuổi, do Ban chăn ni động vật thí nghiệm, Học viện Quân y, Bộ Quốc Phịng cung cấp.
Trƣớc khi thí nghiệm thỏ đƣợc theo dõi từ 2-3 ngày, lựa chọn theo tiêu chuẩn: Khỏe mạnh, nhanh nhẹn, mắt sáng, lơng mƣợt, khơng có bệnh ngồi da, khơng có bệnh đƣờng ruột, cân nặng từ 2 kg - 2,5 kg.
Nuôi đảm bảo tiêu chuẩn thực nghiệm.
Trong thời gian thực nghiệm thỏ đƣợc nhốt riêng mỗi con một chuồng, có đánh số để theo dõi, chế độ ăn uống đƣợc bảo đảm giống nhau gồm cơm và rau tƣơi.
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 2.2.1. Mẫu mô dây rốn 2.2.1. Mẫu mô dây rốn
Mô dây rốn thu từ sản phụ ngay sau khi sinh với các tiêu chuẩn nguồn mô nhƣ sau:
- Tiêu chuẩn y đức về nguồn cung cấp mô: Sản phụ đồng ý cung cấp dây rốn phục vụ nghiên cứu. Sản phụ đƣợc thơng báo bởi nhóm nghiên cứu về mục đích sử dụng mơ dây rốn do sản phụ cung cấp. Mô dây rốn chỉ phục vụ cho mục đích nghiên cứu điều trị vết thƣơng, vết bỏng mà khơng nhằm
mục đích thƣơng mại hóa. Sản phụ đồng ý cung cấp miễn phí dây rốn mà khơng địi hỏi về lợi ích kinh tế.
- Tiêu chuẩn sàng lọc: Ngƣời hiến mô dây rốn đạt tiêu chuẩn ngƣời hiến mơ nói chung theo quy định Luật hiến mơ của Quốc Hội nƣớc cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam, Nghị định của chính phủ hƣớng dẫn thực hiện việc hiến và ghép mô và danh mục của Bộ y tế về tiêu chuẩn bệnh lý của ngƣời hiến mô.
- Ngƣời hiến dây rốn thử máu âm tính với các bệnh truyền nhiễm sau:
STT Bệnh lý Kết quả
1 HIV Âm tính
2 HBV Âm tính
3 HCV Âm tính
4 Giang mai Âm tính
- Tính pháp lý của nguồn mơ nghiên cứu
Mỗi nguồn cung cấp mơ đều có các hồ sơ cung cấp mô gồm, họ tên sản phụ, địa chỉ liên lạc, ý kiến đồng ý cung cấp mô và kết quả xét nghiệm hoặc thăm khám trƣớc sinh, hồ sơ các xét nghiệm sàng lọc. Hai loại hồ sơ này đƣợc lƣu trữ tại khoa Labo nghiên cứu ứng dụng điều trị bỏng- Viện Bỏng Quốc Gia.
2.2.2. Hóa chất chủ yếu dùng trong nghiên cứu
DMEM high glucose (Dulbeco’s Modified Eagle Media); DMEM-F12(Dulbeco’s Modified Eagle Media – F12) PBS (Phosphate – Buffered Salines);
Trypsin – EDTA (0,005% Trypsin, 0,53mM EDTA .Na): dung dịch gồm 0,5g/L trypsin và 0,2g/L EDTA.4Na trong dung dịch Hanks’ khơng có CaCl2;
FBS (Fetal Bovine Serum); DMSO (dimethyl sulfoxide); L-Glutamin
Vitamin C TGF-beta,
Insulin-like growth factor (IGF)-II EGF (Epidermal Growth Factor) Insulin,
Dung dịch Trypsin 0,05% và EDTA 0,53 mM trong dung dịch PBS Các hoá chất và vật tƣ nuôi cấy do hãng Invitrogen và PAAcung cấp, đều đạt tiêu chuẩn quốc tế an tồn về độc tính, vi khuẩn, mycoplasma và vi rút.
Mơi trƣờng nuôi cấy tế bào trung mô do Ngân hàng tế bào gốc Mekostem (Việt Nam) cung cấp theo bản quyền chuyển nhƣợng của công ty CRC (Singapore).
2.2.3. Các vật tƣ tiêu hao chủ yếu
Flash nuôi cấy tế bào loại 75cm2
và 25cm2. Đĩa petri loại D30, D60, D100;
Đĩa nuôi cấy 6 giếng, 12 giếng.
Pipet loại 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL; Ống ly tâm loại 15 mL, 50 mL;
Ống bảo quản tế bào lạnh sâu loại 1,2 mL; Màng Tegaderm,
Các vật tƣ tiêu hao do hãng Corning, 3M, Baxter cung cấp đạt tiêu chuẩn quốc tế về vơ trùng và phục vụ mục đích ni cấy tế bào.
2.2.4. Các thiết bị và dụng cụ chủ yếu
- Kính hiển vi đảo ngƣợc - Máy ly tâm lạnh
- Tủ hood lọc khơng khí vơ trùng - Tủ ấm (incubator)
- Pipet Aid
- Tủ lạnh gia dụng
- Tủ lạnh âm 860C và âm 1520C - Tank Nitơ lỏng
- Thiết bị hạ nhiệt độ theo chƣơng trình hoặc hộp hạ nhiệt độ với cồn PIA. - Nỉa, kéo
2.2.5 Các giá đỡ để tạo tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì.
Màng Tegaderm chất liệu polyurethane do hãng 3M Health Care, USA cung cấp đƣợc dùng để làm giá đỡ tế bào.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Các phƣơng pháp nghiên cứu trong phân lập, ni cấy và biệt hóa tế bào tế bào
2.3.1.1. Phân lập tế bào gốc trung mô
Tại Labo nuôi cấy, dây rốn đƣợc xử lý theo quy trình vơ trùng. Rửa mơ dây rốn bằng Betadin scrup nếu mô thu theo đƣờng đẻ tự nhiên. Cắt lọc dây rốn, loại bỏ lớp thạch và các mạch máu của dây rốn. Sát trùng màng dây rốn bằng cồn 70% thể tích. Rửa sạch mơ bằng PBS để loại bỏ cồn và máu.
Các mẩu mơ sau đó đƣợc đặt vào đĩa hoặc chai ni cấy nhựa với mật độ khoảng 1mẩu mô/5cm2
bề mặt nuôi cấy. Bổ sung môi trƣờng nuôi cấy vào đĩa nuôi, đây là môi trƣờng nuôi cấy tế bào gốc trung mô chuyên biệt do Mekostem cung cấp đƣợc nhƣợng quyền của công ty CRC Singapore.
Đặt đĩa nuôi trong tủ ấm và ẩm với 5% CO2 ở 370C. Thay môi trƣờng sau mỗi 2-3 ngày và theo dõi dƣới kính hiển vi đảo ngƣợc cho đến khi thấy tế bào hình sao, hình thoi mọc ra khỏi mẩu mơ. Khi số lƣợng tế bào đạt khoảng 50% độ che phủ bề mặt ni cấy thì tách tế bào bằng quy trình trypsin. Các tế bào đƣợc theo dõi dƣới kính hiển vi và đƣợc cấy chuyển sang đĩa khác ở mật độ 8000 tế bào/cm2. Sau đó tế bào đƣợc bảo quản lạnh sâu hoặc nhân rộng để làm các thí nghiệm hoặc ứng dụng tiếp theo.
Trong q trình ni cấy mơ, hàng ngày theo dõi dƣới kính hiển vi đảo ngƣợc về: Thời gian tế bào tách khỏi mẫu mơ, hình thái tế bào mới tách.
Sau khi cắt nhỏ thành các mẩu có kích thƣớc 0,2 x 0,2 cm, đặt các mẩu mô trong đĩa nuôi cấy nhựa và bổ sung môi trƣờng chuyên biệt đƣợc cung cấp từ Ngân hàng tế bào gốc Mekostem, đặt các đĩa mô vào tủ ấm 370C với 5% CO2. Thay môi trƣờng nuôi cấy từ 2-3 lần/ tuần và theo dõi đến khi các tế bào hình sao hay hình thoi tách ra khỏi mẫu mô và phát triển đạt 50%-70% bề mặt đĩa thì tiến hành tách tế bào bằng quy trình sử dụng trypsin. Các tế bào đƣợc nhân lên đến thế hệ cấy chuyển thứ 3-4 dùng vào nghiên cứu chế tạo tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì.
Hình 2.1. Cấu trúc mơ dây rốn
Lớp tế bào biểu mô tương tự màng ối (1); lớp tế bào gốc trung mô màng dây rốn (2); lớp tế bào gốc trung mô lớp Wharton’ jelly (3). Các tế bào được sử
dụng trong nghiên cứu này thuộc vị trí số 2.
* Nguồn: theo Katsuhiro Kita và Cs (2009) [90]
2.3.1.2. Cấy chuyển nhân rộng số lƣợng tế bào gốc trung mô dây rốn
Tách và nhân rộng số lƣợng tế bào đƣợc áp dụng theo quy trình cấy chuyển có sử dụng trypsin, các bƣớc nhân rộng đƣợc mô tả chi tiết nhƣ sau:
Kiểm tra cẩn thận tình trạng tế bào ni cấy để phát hiện các dấu hiệu bị ô nhiễm. Đánh giá sơ bộ mật độ tế bào bằng mức độ phủ kín bề mặt (confluence), pH môi trƣờng...trƣớc khi tiến hành cấy chuyển.
Hút bỏ dịch nổi trong chai nuôi cấy. Rửa bề mặt đĩa nuôi cấy tế bào bằng dung dịch đệm PBS với số lƣợng 0,2 ml/cm2
.
Thêm dung dịch Trypsin/EDTA với số lƣợng 0,1mL/cm2. Đặt chai hoặc đĩa nuôi cấy vào tủ ấm theo dõi 5-10 phút, cho thêm 0,1 – 0,2 mL/cm2
môi trƣờng nuôi cấy, thu tế bào vào ống ly tâm, đếm số lƣợng tế bào. 1
2 3
4
Ly tâm ở tốc độ 1200 vòng/phút trong khoảng thời gian 10 phút. Hút bỏ dịch nổi sau ly tâm, cho thêm môi trƣờng nuôi cấy.
Khối tế bào thu đƣợc sẽ đƣợc dùng vào các thí nghiệm tiếp theo hoặc cấy chuyển sang chai khác mật độ 5000 TB/cm2
hoặc đƣợc bảo quản lạnh sâu.
2.3.1.3. Đánh giá khả năng tạo colony của tế bào
Khả năng tạo colony của tế bào mới tách đƣợc đánh giá nhƣ sau:
- Tế bào mới tách ra khỏi mẫu mô, mật độ tế bào đạt khoảng 50% độ che phủ.
- Tách tế bào bằng quy trình sử dụng trypsin
- Hỗn dịch các tế bào đơn lẻ đƣợc chuẩn bị và cấy trong đĩa ni cấy nhựa có đƣờng kính 60mm ở mật độ là 50 tế bào /cm2. Đĩa ni cấy sau đó đƣợc duy trì trong 2-3 tuần để theo dõi sự phát triển của các colony. Đĩa tế bào ni cấy sau đó đƣợc cố định bằng cồn tuyệt đối và nhuộm giemsa, một nhóm tế bào đƣợc xác định là đơn vị colony khi có ít nhất là 50 tế bào. Khả năng tạo colony (CF – E) đƣợc tính tốn theo tỷ lệ % số colony đạt đƣợc so với số tế bào đƣợc cấy. Cụ thể các bƣớc tiến hành nhƣ sau:
B1/ Cấy tế bào cần làm thí nghiệm trong đĩa d=60mm với mật độ tế bào
50TB/cm2, mỗi đĩa cho 4ml môi trƣờng nuôi cấy, thay môi trƣờng sau mỗi 3 ngày.
B2/ Theo dõi tạo colony trong 3 tuần, ghi chép số liệu 5 ngày/ lần về:
- Hình thành colony chƣa?
- Mỗi colony có khoảng mấy tế bào? - Hình thái tế bào?
B3/ Nhuộm giemsa sau 3 tuần
B4/ Tính tỷ lệ % số colony/số tế bào đƣợc cấy, mỗi colony khi đó đƣợc
2.3.1.4. Xác định số lƣợng tế bào trong nuôi cấy
Nhằm xác định số lƣợng tế bào thu đƣợc từ mô và để cấy chuyển theo đúng tỷ lệ và đánh giá đƣợc khả năng nhân lên của TB.
Phƣơng pháp tiến hành trong buồng đếm Neubauer.
Tiến hành trypsin, lấy vào ống nghiệm 1ml hỗn dịch tế bào đã trypsin. Lấy hỗn dịch TB bằng đầu pipet pasteur, bơm nhẹ hỗn dịch TB vào mép buồng đếm và để hỗn dịch tự chảy đầy vào buồng đếm. Đếm số lƣợng tế bào dƣới kính hiển vi trên đơn vị diện tích bằng 1mm2
.
Số lƣợng TB đƣợc tính theo cơng thức: C = n/v (n: số lƣợng TB đã đếm đƣợc trong buồng đếm, v: thể tích đếm (ml), C: mật độ TB (TB/ml). Trong buồng đếm Neubaeur có thể tích 0,1mm3
= 1.10-4 ml do đó cơng thức tính là:
C = n x 104/ml
2.3.1.5. Đánh giá hình thái tế bào
Hàng ngày quan sát các đĩa tế bào ni cấy hay thí nghiệm dƣới kính hiển vi đảo ngƣợc để đanh giá sự tăng trƣởng của tế bào và hình dạng của chúng. Ngoài ra, các phƣơng pháp nghiên cứu hỗ trợ để đánh giá hình thái và siêu cấu trúc nhƣ sau:
Đánh giá hình thái tế bào bằng phương pháp nhuộm giemsa
Các mẫu tế bào ni cấy hay thí nghiệm theo tiến độ khi cần đánh giá hình thái thì tiến hành hút bỏ môi trƣờng nuôi cấy. Rửa tế bào 3 lần bằng dung dịch PBS loại 1X.
Cố định tế bào bằng cồn tuyệt đối trong 10 phút và để khơ trong điều kiện phịng.
Nhuộm tế bào bằng dung dịch Giemsa trong 10 phút, rửa nƣớc và để khơ sau đó đánh giá hình thái tế bào dƣới kính hiển vi quang học.
Đánh giá hình thái mơ bằng phƣơng pháp nhuộm HE
Đánh giá hình thái mơ bằng phƣơng pháp nhuộm HE đƣợc tiến hành tại Bộ môn Mô Phôi – Học Viện Quân Y.
Cố định mẫu vật liệu hoặc mô nghiên cứu bằng dung dịch Bouin, sau đó chuyển vào dung dịch cồn có nồng độ tăng dần 700
, 800, 900, 1000 và xylen 1, xylen 2 trong 3 giờ để đẩy cồn ra khỏi bệnh phẩm.
Đúc bệnh phẩm trong parafin nóng chảy ở 560
C thành từng bloc riêng và đánh số thứ tự.
Các bloc đƣợc cắt trên máy Microtome, mỗi lát cắt dầy 5m. Mỗi bloc cắt 5 tiêu bản, đặt lát cắt lên lam kính sạch và dán bằng nƣớc albumin, để tiêu bản trong tủ ấm 370 trong vịng 12 giờ. Sau đó tẩy parafin bằng xylen 1, xylen 2, tiếp theo dùng cồn 1, và cồn 2 để tẩy xylen.
Quan sát tiêu bản dƣới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 5 - 100 lần, nhận xét sự biến đổi hình thái và cấu trúc mơ.
Đánh giá hình thái siêu cấu trúc
Đánh giá siêu cấu trúc mơ tế bào đƣợc tiến hành tại labo kính hiển vi điện tử của Học Viện Quân Y.
Cố định mô sinh thiết là tấm tế bào gốc biệt hóa theo hƣớng nguyên bào sợi trong dung dịch glutaraldehyt trong 3 giờ, sau đó cố định trong acid osmic, rửa trong dung dịch polat.
Khử nƣớc bằng đặt mẫu mô nghiên cứu trong các dung dịch cồn ở nồng độ khác nhau từ 500
- 1000. Tiếp theo đặt trong propylenoxyt và tẩm đúc bằng hỗn hợp đúc.
Cắt trên máy siêu cắt ultramicrotom, lát cắt mỏng 500 A0
. Sau đó nhuộm bệnh phẩm trong dung dịch uranyl acetat.
Quan sát bệnh phẩm dƣới kính hiển vi điện tử 30, 40, 50, 60, 80 KV, độ phân giải 5 A0, độ phóng đại từ 1000 - 30.000 lần.
Xét nghiệm này cho phép đánh giá khả năng tổng hợp chế tiết nội bào.
2.3.1.6 Phƣơng pháp khảo sát biểu hiện của các kháng nguyên HLA của tế