CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
2.2. Dụng cụ gây bỏng thực nghiệm trên thỏ
Đổ nƣớc sôi (t0
= 1000c) vào bình đến độ cao 10cm. Đặt đáy bình vào vùng da đã chuẩn bị, cùng lúc đặt một túi cát nặng 1kg lên miệng bình. Giữ túi cát và cán bình cho thăng bằng, khơng xê dịch để tạo đƣợc vết bỏng đồng nhất. Thời gian áp đáy bình vào da thỏ là 30 giây để tạo vết bỏng độ IV.
Sau khi gây bỏng, vùng tổn thƣơng có màu trắng đục, da chung quanh vết bỏng xung huyết màu hồng nhạt. Thỏ tỉnh sau vài phút gây bỏng và ăn uống sau vài giờ.
Vị trí gây bỏng: mỗi thỏ gây 2 vết thƣơng bỏng ở vùng lƣng; quy ƣớc là vùng A vết thƣơng bên phải để nghiên cứu ghép tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì, vùng B vết thƣơng bên trái để đối chứng (đắp tấm Tegaderm khơng có tế bào).
2.3.2.3.Thay băng chăm sóc vết thƣơng
Thay băng xử lý vết thƣơng đƣợc tiến hành hàng ngày theo quy trình. - Gây mê thỏ bằng Ketamin tiêm bắp thịt liều 5mg/kg trong lƣợng. - Cắt lọc tổ chức hoại tử, lấy bỏ các dị vật, dịch tiết, dịch mủ,… - Rửa vết thƣơng nhiều lần bằng nƣớc muối 0,9% và becberin 1%. - Rửa vết thƣơng bằng Betadine 3%, sát trùng vùng da lành quanh vết thƣơng bằng Betadine 10%, chờ 5 phút, rửa vết thƣơng lần cuối bằng nƣớc muối 0,9% để loại bỏ hoàn toàn dung dịch Betadine ở vết thƣơng.
- Thấm khô vết thƣơng, chụp ảnh nghiên cứu.
- Từ ngày thứ nhất đến ngày thứ năm đắp thuốc chống nhiễm khuẩn Silvirin cả hai vùng A và B.
Từ ngày thứ 5 (D0) ghép tấm tế bào lên vùng A, đắp tấm Tegaderm khơng có tế bào lên vùng B.
2.3.2.4. Ghép tấm tế bào lên vết thƣơng
Vùng A – vùng nghiên cứu ghép tấm tế bào (quy định vết thƣơng bên phải lƣng thỏ), vùng B – vùng đối chứng (chỉ ghép màng Tegaderm đơn thuần ).
Vùng A:
- Đặt tấm tế bào lên vết thƣơng, tránh để gấp mép, dịch, bọt khí bên dƣới màng, đục một vài lỗ dẫn lƣu dịch. Đặt một lớp gạc vaselin lên trên tấm vật liệu.
- Đặt 5 - 6 lớp gạc vô trùng, băng ép nhẹ.
- Thay băng kỳ đầu sau 24 giờ. Bỏ lớp gạc ngồi, kiểm tra tình trạng bám dính của tấm tế bào, lấy dịch, máu tụ nếu có, đắp gạc vaselin, 5 - 6 lớp gạc thấm.
- Thay băng hàng ngày, nếu tấm vật liệu bám dính, vết thƣơng khơ thì để bán hở cho tới khi khỏi.
Vùng B: Xử lý vết thƣơng tƣơng tự vùng A nhƣng tấm màng
Tegaderm che phủ hồn tồn khơng có tế bào.
2.3.2.5. Xét nghiệm hình thái cấu trúc mơ vết thƣơng
- Sinh thiết mô vết thƣơng bằng dụng cụ sinh thiết (biopsy punch) tại cùng một vị trí của vết thƣơng vào 3 thời điểm:
+ Ngay trƣớc ghép tế bào (D0 - Lần 1) + Ngày nghiên cứu thứ 5 (D5 - Lần 2). +Ngày nghiên cứu thứ 10 (D10 - Lần 3).
- Cố định bệnh phẩm bằng dung dịch Bouin, sau đó chuyển bệnh phẩm vào dung dịnh cồn có nồng độ tăng dần 700, 800, 900, 1000 và xylen 1, xylen 2 trong 3 giờ để đẩy cồn ra khỏi bệnh phẩm. Đúc bệnh phẩm trong parafin nóng chảy ở 560C thành từng bloc riêng và đánh số thứ tự.
- Các bloc đƣợc cắt trên máy Microtome, mỗi lát cắt dầy 5 m. Mỗi bloc cắt 5 tiêu bản, đặt lát cắt lên lam kính sạch và dán bằng nƣớc albumin, để tiêu bản trong tủ ấm 370C trong vòng 12 giờ. Sau đó tẩy parafin bằng xylen 1, xylen 2, tiếp theo dùng cồn 1, và cồn 2 để tẩy xylen.
- Nhuộm hematoxylin – eosin (HE).
- Quan sát tiêu bản dƣới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 40 - 400 lần, nhận xét sự biến đổi tế bào và cấu trúc mô. Đếm số lƣợng tế bào viêm (bạch cầu trung tính, đại thực bào, tế bào lympho), nguyên bào sợi, tế bào sợi, mạch máu tân tạo trên một đơn vị diện tích (ĐVDT) dƣới kính hiển vi quang học có gắn vi mét thị kính (1 ĐVDT = 122400m2
). Mỗi tiêu bản đếm 4 ĐVDT rồi lấy giá trị trung bình cho từng tiêu bản. Xác định chỉ số phân bào (Mitose Index - MI) bằng cách đếm số lƣợng tế bào phân chia trên
200 tế bào sừng lớp mầm. Xét nghiệm mô học đƣợc tiến hành tại Bộ môn Giải Phẫu Bệnh, Học Viện Quân Y.
2.3.2.6. Xét nghiệm vi khuẩn vết bỏng
- Xét nghiệm vi khuẩn vùng vết thƣơng nghiên cứu và đối chứng để xác định loài và số lƣợng vi khuẩn/cm2
vết thƣơng đựơc tiến hành tại 3 thời điểm: + Ngay trƣớc ghép tế bào (D0 - Lần 1)
+ Ngày nghiên cứu thứ 5 (D5 - Lần 2). + Ngày nghiên cứu thứ 10 (D10 - Lần 3).
- Lấy bệnh phẩm theo phƣơng pháp Ivanov N.A (1984). Đặt miếng phim vơ trùng có đục lỗ kích thƣớc 1cm2
lên vết thƣơng bỏng vùng lấy bệnh phẩm. Dùng tăm bông vô trùng nhúng vào nƣớc muối sinh lý 0,9%, sau đó đặt lên vùng đục lỗ 1cm2, lăn nhẹ đầu tăm bông trong 10 giây để lấy bệnh phẩm. Cho tăm bông bệnh phẩm vào ống chứa 5 ml nƣớc muối 0,9%. Lắc nhẹ ống nƣớc muối sinh lý có tăm bơng bệnh phẩm trong 15 giây.
- Dùng que cấy định lƣợng 0,01 ml và 0,001 ml đã khử trùng, lấy bệnh phẩm trong nƣớc muối sinh lý, cấy vào hai đĩa môi trƣờng thạch dinh dƣỡng.
- Kỹ thuật cấy: Đầu tiên cấy một đƣờng thẳng theo hết đƣờng kính đĩa thạch, sau đó dàn đều sang hai bên. Để đĩa cấy khuẩn ở tủ ấm 370
trong 24 giờ, sau đó đếm số lƣợng khuẩn lạc có trong đĩa thạch.
- Xác định số lƣợng vi khuẩn có trong 1 cm2 vết bỏng theo công thức: SLVK/ cm2 = (5 N1 x 10
3
) + (5 N2 x 102) 2
N1: Số lƣợng khuẩn lạc ở đĩa thạch cấy lúp 0,001. N2: Số lƣợng khuẩn lạc ở đĩa thạch cấy lúp 0,01. 5: 5 ml nƣớc muối 0,9%.
Bệnh phẩm
Loop 0,001 Loop 0,01 Loop thƣờng Cấy định lƣợng Cấy phân vùng Thạch dinh dƣỡng Thạch dinh dƣỡng Thạch máu
370/24 giờ 370/24 giờ 370/24 giờ
Đếm SLVK Đếm SLVK Xem khuẩn lạc Xác định vi khuẩn.
2.3.2.7. Các chỉ tiêu theo dõi toàn thân
* Toàn thân: Theo dõi khả năng ăn uống, mức độ hoạt động
* Cân nặng thỏ: Đánh giá bằng phƣơng pháp cân tại các thời điểm
trƣớc khi gây bỏng, bắt đầu nghiên cứu ghép tế bào (D0 – Lần 1), sau đó cứ 5 ngày cân lại một lần cho đến khi vết thƣơng khỏi.
2.3.2.8. Các chỉ tiêu theo dõi tại chỗ vết thƣơng
Theo dõi hàng ngày diễn biến: Tình trạng sƣng nề, xung huyết; Tình trạng dịch tiết. dịch mủ; Tình trạng dị ứng; Diện tích vết bỏng; Thời gian liền vết thƣơng bỏng; Sự bám dính của tấm vật liệu; Số lần thay tấm vật liệu; Quá trình biểu mơ liền vết thƣơng, tính tốc độ biểu mơ hố; Tình trạng của nền tổn thƣơng sau khi khỏi.
Tính diện tích vết thƣơng
Diện tích vết thƣơng đƣợc tính theo cm2. Diện tích vết thƣơng đƣợc đo bằng phƣơng pháp kẻ ơ, đặt tấm giấy bóng kính kẻ ơ vng (mỗi ơ vng 1cm2) lên vết thƣơng dùng bút mực vẽ lên tấm giấy bóng kính tƣơng ứng với diện tích vết thƣơng.
t S S
V 1 2
Trong đó:
V : Tốc độ thu hẹp vết thƣơng cm2/ngày.
S1, S2 : Diện tích vết thƣơng ở các thời điểm nghiên cứu (cm2). t : Số tuần ghép nghiên cứu.
Sau đó tính tốc độ liền vết thƣơng theo cm2
/ tuần hoặc tỷ lệ % vết thƣơng liền tại thời điểm đo so với diện tích vết thƣơng ban đầu.
2.3.2.9. Các xét nghiệm huyết học và sinh hoá máu
Máu thỏ đƣợc lấy 4 lần vào các thời điểm: trƣớc khi gây bỏng, ngay trƣớc ghép tấm vật liệu (D0 - Lần 1), ngày nghiên cứu thứ 5 (D5 - Lần 2), ngày nghiên cứu thứ 10 (D10 - Lần 3) để phân tích các chỉ số huyết học và sinh hoá đánh giá chức năng các cơ quan gan và thận…
- Xét nghiệm huyết học: Chỉ tiêu theo dõi gồm có số lƣợng hồng cầu, huyết sắc tố, bạch cầu, công thức bạch cầu trên máy phân tích huyết học tự động.
- Xét nghiệm sinh hoá: Gồm glucose, ure, creatinin trên máy phân tích sinh hóa tự động.
2.3.2.10. Xác định hoạt độ enzym GOT trong huyết thanh
Nguyên lý: Aspartat Aminotransferase (AST/GOT ) xúc tác chuyển nhóm amin từ L-aspartate sang 2-oxoglutarate để tạo thành oxaloacetate và L- glutamate. Maleat dehydrogennase (MDH) xúc tác khử oxaloactate và oxy hoá NADH thành NAD. Lƣợng NAD tiêu thụ sẽ làm giảm độ hấp thụ và tỷ lệ với hoạt độ của enzym AST/GOT.
Đo hoạt độ GOT theo phƣơng pháp động học ở bƣớc sóng 340nm, nhiệt độ 370C, đơn vị là U/L.
2.3.2.11. Xác định hoạt độ enzym GPT trong huyết thanh
Nguyên lý: Alanin Aminotransferase (AST/GOT ) xúc tác chuyển nhóm amin từ L-alanin sang 2-oxoglutarate để tạo thành pyruvat và glutamate. Lactatdehydrogenase (LDH) xúc tác sự khử của pyruvat và oxy hoá của NADH tạo thành NAD+. Sự giảm NADH làm giảm độ hấp thụ và tỷ lệ với hoạt độ của ALT/GPT.
Đo hoạt độ GOT theo phƣơng pháp động học ở bƣớc sóng 340 nm, nhiệt độ 370
C.
2.4. XỬ LÝ SỐ LIỆU
Các số liệu đựơc tính theo trị giá trung bình (X SD ) hoặc tỷ lệ % . Xử lý số liệu trên phần mềm SPSS 16.0 sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi P<0,05.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. ĐẶC ĐIỂM PHÂN LẬP, NI CẤY BIỆT HĨA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN
3.1.1. Đặc điểm phân lập tế bào gốc trung mô dây rốn
3.1.1.1. Kết quả phân lập và hình thái tế bào gốc trung mơ dây rốn
Bảng 3.1. Tỷ lệ nhiễm khuẩn, nhiễm nấm khi xử lý và cấy mô (n=20)
Ngày cấy mô Nhiễm khuẩn Nhiễm nấm Nhiễm Mycoplasma Không nhiễm Ngày thứ 2 02 00 00 18 Ngày thứ 3 00 00 00 18 Ngày thứ 5 00 00 00 18 Ngày thứ 10 00 01 00 17
Tỷ lệ nhiễm trong cấy mơ thấp, chỉ có 3/20 mẫu bị nhiễm, chiếm 15%. Có 2/20 mẫu nghiễm khuẩn
Có 1/20 mẫu nhiễm nấm xác định đƣợc vào ngày thứ 10 sau cấy mô Cịn 17 mẫu mơ đƣợc theo dõi khả năng mọc tế bào
Bảng 3.2. Thời gian tế bào tách ra khỏi mẫu mô và đạt 50% che phủ (n=17) Chỉ tiêu Chỉ tiêu Trong 7 ngày Trong 14 ngày Trong 21 ngày Trong 28 ngày Số mẫu % Số mẫu % Số mẫu % Số mẫu % Mọc tế bào 02 11,7 10 58,8 15 88,2 17 100,0 Tế bào đạt 50% 00 00 05 29,4 14 82,3 16 94,1
Tế bào mọc ra khỏi mẫu mô sớm nhất là trong 1 tuần.
Đa số tế bào mọc ra khỏi mẫu mô trong tuần thứ 2 và thứ 3. Sau 4 tuần tất cả các mẫu mô đều mọc tế bào.
0 20 40 60 80 100 120
Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4
% Mọc tế bào % Tách tế bào
Biểu đồ 3.1. Thời gian tế bào mọc ra khỏi mẫu mô và thời gian thu tế bào sau khi cấy mô. sau khi cấy mô.
Theo dõi tế bào mọc ra khỏi mẫu mô nuôi cấy, thu tế bào bằng quy trình tripsin và cấy chuyển đến P3-P4.
Ảnh 3.1. Tế bào mọc ra khỏi mẫu mô ở ngày thứ 10 sau cấy mơ.
Hình dạng tế bào chủ yếu hình thoi (1) là hình dạng đặc trưng của tế bào dạng trung mô. Các tế bào dạng biểu mô cũng mọc ra từ mẫu mơ với số lượng ít hơn, các tế bào này có
dạng nhỏ hơn và hình đa diện (2), (đảo ngược 50X).
Ảnh 3.2. Tế bào mọc ra khỏi mẫu mô sau 14 ngày cấy mô
Các tế bào gốc trung mô đạt khoảng 90% độ che phủ bề mặt nuôi cấy và lấn át tế bào biểu mơ, (đảo ngược 50X).
1
2
Hình thái tế bào mọc ra khỏi mẫu mô:
Tế bào gốc trung mô màng dây rốn tách ra khỏi mẫu mơ có đặc điểm là tế bào có hình sao hoặc hình thoi là chủ yếu trong bề mặt ni cấy, các tế bào bám vào bề mặt đĩa nhƣ nuôi cấy tế bào.
Các tế bào trung mơ khơng thấy có kết nối nhánh bào tƣơng khi quan sát ở độ phóng đại lớn. Tế bào có dấu hiệu phát triển lan rộng ra khỏi mẫu ở dạng đơn lớp mà khơng thấy sự biệt hóa nhiều lớp.
Cùng với các tế bào hình sao và hình thoi, có phát hiện một số tế bào có hình oval hoặc hình đa diện nhƣng ít cũng mọc từ mẫu mơ.
Duy trì tế bào ni trong mơi trƣờng ni cấy chun biệt dành cho tế bào trung mơ, các tế bào hình sao hình thoi phát triển và dần lấn át các tế bào biểu mơ hình oval hoặc đa diện.
Ảnh 3.3. Hình ảnh nhân và bào tương bình thường của tế bào trung mô mới tách ra khỏi mơ dây rốn. Tế bào hình thoi, nhân hình trứng. Mẫu mô số 02/2010. (Giemsa, 200X).
3.1.1.2. Khả năng tạo colony của tế bào gốc trung mô dây rốn
Bảng 3.3. Khả năng tạo colony của tế bào gốc trung mô ở P2
Nguồn tế bào
Thời gian (ngày) Tỷ lệ % số colony/tế bào thí nghiệm Bắt đầu quan sát thấy colony Thấy rõ đa số colony Mẫu mô 01 4 7 73 Mẫu mô 02 5 8 72 Mẫu mô 03 5 10 77 Mẫu mô 04 4 9 66 Mẫu mô 05 5 7 71
Tế bào tách từ 5 mẫu mô đƣợc thử khả năng tạo CF-E đều thấy xuất hiện các collony.
Các collony đều có thể thấy xuất hiện sớm trong vịng 05 ngày thí nghiệm, các colony lúc này có khoảng 3-4 tế bào và đã thấy rõ trong vòng 10 ngày.
Tỷ lệ colony trong tập hợp số tế bào tách ra khỏi mẫu mô đạt cao, thấp nhất là 66% và cao nhất là 77% .
Ảnh 3.4. Các colony có từ 3-5 tế bào được quan sát sớm vào ngày thí nghiệm thứ 05. Mẫu mô số 02/2010, (Soi ngược, 50X).
Ảnh 3.5. Các colony do các tế bào gốc trung mô màng dây rốn tạo nên vào ngày thí nghiệm tạo thứ 20. (Tế bào từ mẫu mô 02/2010, P2, Giemsa).
Các mẫu nghiên cứu cho thấy, tế bào gốc phát triển tốt và tạo ra số lƣợng lớn các colony (gần 30 colonies) và đƣờng kính của colony cũng đạt hơn 2mm.
Đặc điểm colony là CFU-F (fibroblast colony forming unit).
3.1.2. Biểu hiện kháng ngun hịa hợp tổ chức và tính sinh miễn dịch của tế bào gốc trung mô dây rốn tế bào gốc trung mô dây rốn
3.1.2.1. Đặc điểm biểu hiện HLA-G, HLA-E và HLA-DR của tế bào
Kết quả phân tích bằng western blot phát hiện sự có mặt của các kháng nguyên HLA-G và HLA-E trong dịch nghiền tế bào gốc trung mô màng dây rốn cho thấy tất cả các mẫu tế bào đều biểu lộ cả kháng nguyên HLA-G và HLA-E.
Ảnh 3.6. Kháng nguyên HLA-G và HLA-E có trong dịch nghiền tế bào gốc trung mô màng dây rốn được phát hiện bằng kỹ thuật western blot. trung mô màng dây rốn được phát hiện bằng kỹ thuật western blot.
Mức độ biểu hiện HLA-DR trên bề mặt TBGTM màng dây rốn đƣợc phân tích qua flowcytometry.
Biểu đồ 3.2. Kết quả phân tích bằng flowcytometry mức độ biểu hiện HLA-DR của tế bào gốc trung mô màng dây rốn. HLA-DR của tế bào gốc trung mô màng dây rốn.
Qua 15 mẫu thí nghiệm;
Mức độ biểu hiện HLA-DR chiếm 1,9 ± 1,53%
Mức độ biểu hiện dấu ấn CD90 đặc thù của tế bào gốc trung mô đạt tới 92,65 ± 6,3%.
Nhƣ vậy, tế bào gốc trung mơ dây rốn có biểu hiện cao về dấu ấn CD90 đặc thù và các kháng nguyên hòa hợp tổ chức HLA -DR, HLA-E, HLA-G.
3.1.2.2. Tính sinh miễn dịch của tế bào gốc trung mô dây rốn
Tế bào gốc trung mô đƣợc bảo quản lạnh sâu, sau đó đƣợc giải đơng lạnh và nuôi lại vào đĩa Petri môi trƣờng nuôi cấy tế bào gốc trung mô. Tế bào đƣợc chia làm 2 phần. Lấy khoảng 1/2 lƣợng tế bào vào một phiến nhựa 96 giếng nuôi cấy mới. Để tủ ấm tiếp tục nuôi cấy đợi tế bào mọc lan ra tồn
bộ. Cịn 1/2 lƣợng tế bào đem phá vỡ tế bào bằng siêu âm, định lƣợng protein bằng phƣơng pháp Bradford.
Biểu đồ 3.3. Phát hiện kháng thể thỏ kháng tế bào gốc với kháng nguyên siêu nghiền bằng xét nghiệm ELISA
Kết quả phát hiện kháng thể thỏ kháng tế bào gốc với kháng nguyên là