CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.10.Hoạt độ enzym GOT, GPT huyết thanh
Chỉ số
Thời điểm
D0 D5 D10
SGOT (U/L) 50,16 2,81 67,54 5,37 52,98 3,14 SGPT (U/L) 54,14 5,38 69,56 5,35 68,13 4,63
Hoạt độ enzyme GOT, tăng nhẹ ở ngày thứ 5 sau đó giảm nhanh xuống mức độ bình thƣờng vào ngày thứ 10.
3.2.2. Ảnh hƣởng của ghép tế bào gốc trung mô tới liền vết thƣơng
3.2.2.1. Ảnh hƣởng của ghép tế bào gốc trung mô tới diễn biến lâm sàng tại chỗ vết thƣơng
Bảng 3.11. Diễn biến lâm sàng vết thương bỏng thực nghiệm
Thời điểm Vết thƣơng Vùng A Vùng B D0 - Nền vết thƣơng ẩm, giả mạc bám dễ bóc, ít viêm nề, tiết dịch vừa. - Bờ mép vết thƣơng viêm nề nhẹ.
- Nền vết thƣơng ẩm, giả mạc bám dễ bóc, ít viêm nề, tiết dịch vừa. - Bờ mép vết thƣơng viêm nề nhẹ.
D5
- Vết thƣơng sạch, tiết dịch ít. Vẩy tiết màu vàng sậm, phía dƣới nền có tổ chức hạt và dễ rƣớm máu. Vết thƣơng khơng có mùi hơi.
- Bờ mép vết thƣơng khơng viêm nề, khơng có ban dát sẩn.
- Vết thƣơng sạch, tiết dịch ít. Vẩy tiết dễ bóc, màu vàng nhạt, cạo sạch lớp vẩy tiết bên dƣới dễ chảy máu. Vết thƣơng khơng có mùi hôi.
- Bờ mép vết thƣơng còn viêm nề và xung huyết nhẹ.
D10
- Diện tích vết thƣơng thu nhỏ, nền có tổ chức hạt đẹp màu đỏ tƣơi. - Bờ mép vết thƣơng khơng có ban dát sẩn, xuất hiện rõ biểu mơ hóa vào trung tâm vết thƣơng.
- Diện tích vết thƣơng co nhỏ lại nhƣng lớn hơn so với vùng A. Nền vết thƣơng ẩm, sạch, màu hồng nhạt, dịch tiết vừa. - Bờ mép VT không viêm nề. D15 - Nền vết thƣơng phẳng, không co dúm.
- Quầng biểu mơ hóa từ bờ mép quan sát rõ.
- Nền vết thƣơng phẳng, rƣớm máu, có dấu hiệu co rút vết thƣơng
- Có biểu mơ hóa từ bờ mép vết thƣơng lan vào trung tâm.
Bảng 3.12. Thay đổi diện tích vết thương bỏng
Thời điểm
Tỷ lệ % diện tích vết thƣơng đã liền
P
Vùng A (n = 30) Vùng B (n = 30)
D5 26,53 ± 12,04 25,84 ± 11,40 0,601 D10 77,44 ± 12,24 68,76 ± 11,14 < 0,01 D15 93,23 ± 3,74 87,36 ± 4,78 < 0,001 Ngày thứ 5, diện tích vết bỏng của vùng A khỏi nhanh hơn so với vùng B. Tuy nhiên, diện tích vết bỏng khỏi của vùng A và vùng B trong những ngày đầu sau ghép khác nhau khơng có ý nghĩa thống kế (p=0,601).
Ngày thứ 10 và 15, diện tích vết bỏng của vùng A liền nhanh vùng B rệt hơn (p<0,001).
Bảng 3.13. Tốc độ liền vết thương
Thời điểm Diện tích vết thƣơng thu hẹp (cm
2 /ngày) P Vùng A (n = 30) Vùng B (n = 30) Ngày thứ 1 - 5 0,93 ± 0,32 0,90 ± 0,29 0,488 Ngày thứ 5 – 10 1,77 ± 0,74 1,25 ± 0,28 <0,01 Ngày thứ 1 – 10 1,41 ± 0,33 1,28 ± 0,19 <0,01 Ngày thứ 1 - 15 1,12 ± 0,16 1,04 ± 0,13 < 0,01 Tốc độ thu hẹp vết thƣơng giữa vùng A và vùng B trong 5 ngày đầu khác nhau nhƣng chƣa có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Nhƣng nếu so sánh sự thay đổi tốc độ thu hẹp vết thƣơng giữa vùng A và vùng B trong khoảng thời gian từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 10 thì sự khác nhau có ý nghĩa thống với p<0,01.
Bảng 3.14. Liên quan thời gian và số vết thương liền hoàn toàn
Thời gian
Số vết thƣơng liền hoàn toàn
P Vùng A (n = 30) Vùng B (n = 30) Số thỏ Tỷ lệ % Số thỏ Tỷ lệ % Trƣớc 15 ngày 0 0 0 0 > 0,05 Ngày 16-20 14 46,67 12 40 > 0,05 Sau 20 ngày 16 53,33 18 60 > 0,05 Tổng 30 100 30 100
Trong giai đoạn 16 – 20 ngày, tỷ lệ vết bỏng vùng A khỏi hoàn toàn (46,67%) cao hơn so với vùng B ( 40%), tuy nhiên chƣa có ý nghĩa thống kê.
Bảng 3.15. Diện tích vùng biểu mơ hóa sau khi liền
Thời điểm Diện tích (cm
2 ) P Vùng A (n=30) Vùng B (n=30) D5 4,68 ± 1,64 4,50 ± 1,48 0,488 D10 14,18 ± 3,33 12,52 ± 2,83 <0,05 D15 16,95 ± 2,31 15,74 ± 1,93 <0,05
Diện tích vùng biểu mơ hóa ở vùng A lớn hơn vùng ở vùng B và có ý nghĩa thống kê với p<0,05 vào ngày nghiên cứu thứ thứ 10 và 15.
Ảnh 3.15. Vết bỏng sâu ngày thứ 5 sau bỏng đã được cắt lọc sạch hoại tử, chuẩn bị ghép tế bào gốc trung mô. Vùng nghiên cứu và vùng đối chứng tương đương nhau về độ sâu và diện tích.
Ảnh 3.16. Vết bỏng ở ngày nghiên cứu thứ 5, vùng A có dấu hiệu biểu mơ hóa, vùng B có dấu hiệu viêm và xung huyết bờ mép vết thương.. biểu mơ hóa, vùng B có dấu hiệu viêm và xung huyết bờ mép vết thương..
D0
Ảnh 3.17. Vết bỏng ngày nghiên cứu thứ 15, cả 2 vùng đều có tổ chức hạt đẹp và biểu mơ hóa từ bờ mép vào trung tâm vết thương .Diện tích vết hạt đẹp và biểu mơ hóa từ bờ mép vào trung tâm vết thương .Diện tích vết thương vùng A, thu hẹp hơn so với vùng B.
Ảnh 3.18. Vết bỏng ngày nghiên cứu thứ 20, vùng A khỏi hoàn toàn, sẹo mềm mại, màu trắng hồng, tương đồng với da lành. Trong khi đó vùng sẹo mềm mại, màu trắng hồng, tương đồng với da lành. Trong khi đó vùng
B vẫn cịn khoảng 2cm2
vết thương chưa liền, vùng sẹo phẳng nhưng hơi cứng cộm.
D15
3.2.2.2. Ảnh hƣởng của ghép tế bào gốc trung mơ đến thay đổi hình thái cấu trúc mơ vết thƣơng
Bảng 3.16. Đặc điểm hình thái cấu trúc mô vết thương tại các thời điểm
Thời điểm
Đặc điểm hình thái mơ
Vùng A (n=30) Vùng B (n=30)
Trƣớc ghép
Bề mặt tổn thƣơng khơng có hoại tử, đƣợc phủ lớp tơ huyết mỏng.
Mơ phía dƣới có ít dịch phù xen kẽ ít tế bào viêm chủ yếu là bạch cầu đa nhân trung tính, rải rác các đại thực bào và nguyên bào sợi.
Bề mặt tổn thƣơng khơng có hoại tử, đƣợc phủ lớp tơ huyết mỏng.
Mơ phía dƣới có ít dịch phù xen kẽ ít tế bào viêm chủ yếu là bạch cầu đa nhân trung tính, rải rác các đại thực bào và nguyên bào sợi.
Ngày thứ 5
Mơ liên kết mỏng, có ít tế bào viêm, nhiều nguyên bào sợi và tân mạch, khơng có ít dịch phù viêm
Mơ liên kết dày, nhiều tế bào viêm, nguyên bào sợi và tân mạch, còn phù viêm nhẹ
Ngày thứ 10
Mơ liên kết rất ít tế bào viêm, ít nguyên bào sợi và tân mạch Có 20/30 vết thƣơng đã đƣợc che phủ bởi lớp biểu bì mỏng nhƣng chƣa đủ 4 lớp.
Lớp tế bào biểu bì liên kết chặt chẽ với chân bì, lớp tế bào mầm tăng phân chia
Mô liên kết còn nhiều tế bào viêm nhƣng ít hơn trƣớc, khơng cịn phù viêm, nhiều nguyên bào sợi và tân mạch. Có 16/30 vết thƣơng đã có biểu bì che phủ, có sự phân chia của tế bào lớp mầm.
Bảng 3.17. Thay đổi số lượng tế bào viêm tại mô vết thương
Thời điểm Số lƣợng tế bào viêm/ĐVDT
Vùng A (n=30) Vùng B (n=30) P
D0 30,16 7,41 31,46 5,98 0,375
D5 18,86 4,46 18,01 5,08 0,475
D10 08,96 1,80 12,50 3,01 0,001
Số lƣợng tế bào viêm cả 2 vùng đều giảm theo tiến trình nghiên cứu. Tại thời điểm 10 ngày nghiên cứu (15 ngày sau gây bỏng), vùng A có số lƣợng tế bào viêm thấp hơn so với vùng B và sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,001).
Bảng 3.18. Thay đổi số lượng nguyên bào sợi tại mô vết thương
Thời điểm Số lƣợng nguyên bào sợi/ĐVDT
Vùng A (n=30) Vùng B (n=30) P
D0 13,86 5,40 13,53 03,13 0,714
D5 37,20 8,26 36,56 9,35 0,76
D10 67,10 9,09 52,73 10,38 <0,001
Số lƣợng nguyên bào sợi ở cả vùng nghiên cứu ghép tế tấm trung bì và vùng đối chứng tăng lên dần trong 10 ngày nghiên cứu và tăng cao vào ngày thứ 10. So sánh tại các thời điểm trƣớc nghiên cứu ghép tế bào, ngày thứ 5 thấy số lƣợng nguyên bào sợi tại mô vết thƣơng vùng nghiên cứu và vùng đối chứng là tƣơng đƣơng nhau. Ngày thứ 10 thấy số lƣợng nguyên bào sợi vùng A tăng hơn vùng B với p< 0,001.
Bảng 3.19. Thay đổi số lượng tân mạch tại mô vết thương
Thời điểm Số lƣợng tân mạch/ĐVDT
Vùng A (n=30) Vùng B (n=30) P
D5 3,50 1,04 3,67 1,02 0,484
D10 7,23 1,13 4,90 0,95 0,001
Tại thời điểm ngày nghiên cứu thứ 10, số lƣợng tân mạch tăng lên so với thời điểm ngày nghiên cứu thứ 5 tại cả vùng A lẫn vùng B.
Số lƣợng tân mạch ở vùng A tại thời điểm ngày nghiên cứu thứ 10 (ngày thứ 15 sau khi gây bỏng) cao hơn có ý nghĩa thống kê so với vùng B với p <0,001.
Bảng 3.20. Thay đổi chỉ số phân bào lớp mầm tại mô vết thương
Thời điểm Chỉ số phân bào (có hiệu chỉnh MI x 100) Vùng A (n=30) Vùng B (n=30) P
D5 1,53 0,50 1,47 0,51 0,189
D10 2,47 0,56 1,86 0,51 0,010
Ở ngày nghiên cứu thứ 5, chỉ số phân bào lớp mầm mô vết thƣơng vùng A cao hơn vùng B nhƣng khơng có ý nghĩa thống kê (p=0,189).
Tại thời điểm ngày nghiên cứu thứ 10, chỉ số phân bào tăng hơn so với ngày thứ 5, đặc biệt vùng A tăng cao hơn so với vùng B có ý nghĩa thơng kê (p<0,01).
Ảnh 3.19. Hình thái cấu trúc mơ vết thương vùng A trước ghép tế bào, chủ yếu tế bào viêm (1) và dịch phù (2), có màng tơ huyết trên bề mặt vết thương (3), rất ít nguyên bào sợi và chưa thấy tân mạch. Thỏ số AS 23, HE, 10X.
Ảnh 3.20. Vết thương vùng A ngày nghiên cứu thứ 5, đã có nhiều nguyên bào sợi (1) bắt đầu xuất hiện các tân mạch (2), ít phù viêm và tế bào viêm. Thỏ AS23, HE, 10X.
2
1
1 2
Ảnh 3.21. Mô vết thương vùng A ở ngày nghiên cứu thứ 10, nhiều nguyên bào sợi sắp xếp có định hướng (1), nhiều tân mạch (2), lớp biểu mô liên kết chặt chẽ với chân bì (3), ít tế bào viêm. Thỏ số AS 23, HE, 10X.
3.2.3. Vi khuẩn học vết thƣơng bỏng thực nghiệm
Bảng 3.21. Tần xuất xuất hiện vi khuẩn qua các thời điểm nghiên cứu
Thời điểm
Tỷ lệ vết thƣơng có mẫu cấy khuẩn dƣơng tính Vùng A (n = 30) Vùng B (n = 30) Số mẫu (+) Tỷ lệ % Số mẫu (+) Tỷ lệ % D0 1 3,33 3 10,00 D5 5 16,67 7 23,33 D10 4 13,33 3 10,00 Tổng 10 33,33 13 43,33
Tần xuất cấy khuẩn dƣơng tính ở vùng nghiên cứu không cao hơn so với vùng đối chứng.
2 1
30% 40% 10% 10% 10% E.cloaceae E.coli S.aureus P.mirabilis K.pneumoniae
Biểu đồ 3.7. Chủng loại vi khuẩn vết thƣơng vùng nghiên cứu (Vùng A)
15.38% 7.69% 7.69% 7.69% 15.38% 38.48% 7.69% E.cloaceae E.coli S.aureus P.mirabilis K.pneumoniae Aci. Baumannii Shi.boydi
Qua biểu đồ 3.7 và 3.8 cho thấy:
- Chủng loại vi khuẩn vùng A bao gồm: E. cloaceae, E. coli, S. aureus, P. mirabilis, K, pneumonia. Trong khi đó, ở vùng B gặp các lồi vi khuẩn là: Aci. Baumanni, E.coli, E.cloaceae, Shi.boydi, P.mirabilis, S. aureus, K.pneumoniae
- Tỷ lệ vết thƣơng nhiễm khuẩn E.coli và E.cloaceae chiếm cao hơn các chủng vi khuẩn khác.
Bảng 3.22. Thay đổi số lượng vi khuẩn vết thương
Thời điểm Số lƣợng vi khuẩn (5103 /cm2) Vùng A (n = 30) Vùng B (n = 30) P D0 05,67 ± 31,07 9,02 ± 28,40 0,575 D5 16,06 ± 37,15 22,87 ± 42,98 0,108 D10 10,57 ± 27,96 7,22 ± 22,21 0,343
Xét tại vùng A và vùng B thì số lƣợng vi khuẩn tăng cao ở lần 2 (thời điểm 5 ngày sau khi bắt đầu ghép tế bào) nhƣng sau đó giảm ở lần 3 (ngày thứ 10 sau khi ghép tế bào).
0 5 10 15 20 25 D0 D5 D10 Vùng A Vùng B
Biểu đồ 3.9. Thay đổi số lƣợng vi khuẩn tại vết bỏng
Số lƣợng vi khuẩn trên 1cm2 vết thƣơng ở hai vùng nghiên cứu khơng có sự khác biệt tại các thời điểm lấy mẫu xét nghiệm.
Cả 2 vùng vết thƣơng đều có mật độ vi khuẩn thấp nên ít có khả năng ảnh hƣởng đến quá trình liền vết thƣơng.
Vết thƣơng đƣợc ghép tấm tế bào cũng không làm tăng sự phát triển vi khuẩn tại vết thƣơng mặc dù không sử dụng thuốc kháng khuẩn tại chỗ vết thƣơng.
CHƢƠNG 4 BÀN LUẬN
4.1. ĐẶC ĐIỂM PHÂN LẬP NUÔI CẤY, BIỆT HĨA TẾ BÀO GỐC TRUNG MƠ MÀNG DÂY RỐN
4.1.1. Phân lập tế bào gốc trung mô màng dây rốn
Tế bào gốc trung mơ, lớp tế bào gốc thuộc trung bì có khả năng biệt hóa thành nhiều dịng tế bào [54]. Tế bào gốc trung mơ dây rốn có thể dễ dàng thu đƣợc. Do việc sử dụng chúng không bị các vƣớng mắc về vấn đề đạo đức, dây rốn là sự lựa chọn tối ƣu cho việc phân lập tế bào gốc trung mô [6],[14],[119]. Nhiều nghiên cứu khẳng định rằng đặc tính sinh học và hình thái tế bào của tế bào gốc trung mô dây rốn rất giống tế bào gốc trung mô tủy xƣơng và tế bào gốc trung mơ dây rốn có thể biệt hóa thành tế bào cơ tim, mỡ, và thần kinh [46], [54],[55]. Tuy nhiên, khả năng tăng sinh và biệt hóa của tế bào gốc trung mơ dây rốn tốt hơn nhiều so với tế bào gốc trung mô tủy xƣơng [56]. Hochedlinger và cộng sự [57] đã xác định OCT-4 cũng có biểu hiện ở các tế bào gốc trung mô dây rốn. OCT-4 là một gene đặc biệt của tế bào gốc phơi, có vai trị quan trọng trong việc duy trì tình trạng khơng biệt hóa của tế bào gốc. Kết quả này chỉ ra rằng tế bào gốc trung mơ sơ hữu ít nhất là một số đặc tính của tế bào gốc. Hơn nữa, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng tế bào gốc trung mơ có thể hữu ích trong tái tạo vết thƣơng và trong y học tái tạo [58], [59].
Trong nghiên cứu này, tế bào gốc trung mô giống nguyên bào sợi đƣợc tinh lọc thu đƣợc thơng qua phƣơng pháp có thay đổi chút ít so với phƣơng pháp đã mô tả và xuất bản trƣớc đây [60]. Đối với nguồn tế bào gốc trung mô ngƣời, lớp thạch đƣợc phân tách thay cho việc dùng tồn bộ mơ dây rốn để tránh nhiễm tế bào biểu mô. Khi tách tế bào gốc trung mô dây rốn bằng
phƣơng pháp này, nhiều cách thức khác cũng đƣợc khảo sát nhƣ dùng collagenase, trypsin, hyaluronidase.[61], [89], [92].
Nghiên cứu của chúng tôi không sử dụng enzyme để phân lập tế bào mà sử dụng phƣơng pháp kết dính mơ vào bề mặt ni cấy để các tế bào tự mọc ra khỏi mẫu mô. Một số nghiên cứu trƣớc đây cũng đã áp dụng mơ hình phân lập tế bào gốc tƣơng tự mà không cần dùng enzyme [136],[137]. Với phƣơng pháp này, Lê Văn Đông và cộng sự, sau khi ni cấy mơ, 100% số mẫu có tế bào mọc lan ra khỏi mẩu mơ, mẫu xuất hiện tế bào sớm nhất vào ngày 3 và muộn nhất vào ngày 17. Sau khi nuôi cấy vài ngày, các mảnh mô co lại, bám chặt hơn vào bề mặt đĩa nuôi và bắt đầu xuất hiện các tế bào lan ra xung quanh rìa mép của mảnh mơ [14].
Kết quả của chúng tôi tƣơng đối phù hợp với tác giả trên, có 15/17 mẫu mơ nghiên cứu mọc tế bào ra khỏi mẩu mô trong 3 tuần sau nuôi cấy mô, đạt tỷ lệ 88,2% và cũng chỉ cần ni cấy trong hai tuần là đã có thể thu hoạch tế bào. Khoảng 10-14 ngày sau khi bắt đầu cấy mơ, có dấu hiệu một số tế bào di cƣ từ mẩu mô nuôi cấy ra bề mặt đĩa nhựa. Các tế bào dây rốn mọc ra khỏi mẫu mơ trong điều kiện ni cấy có đặc điểm về hình thái là tế bào có hình sao hoặc hình thoi chiếm chủ yếu, có phát hiện một số tế bào có hình ovan hoặc hình đa diện nhƣng ít. Khơng thấy có kết nối nhánh bào tƣơng khi quan sát ở độ phóng đại lớn. Tế bào có dấu hiệu phát triển lan rộng ra khỏi mẫu mô ở dạng đơn lớp mà khơng thấy sự biệt hóa nhiều lớp.
Kết quả nghiên cứu các dấu ấn bề mặt tế bào cho thấy tế bào gốc trung mơ có biểu hiện mạnh các dấu ấn CD44, CD29, CD105, và HLA-ABC, nhƣng khơng có CD34, HLA-DR, CD31 hoặc CD45 [62],[63],[65],[66]. Nhƣ vậy, tế bào gốc trung mô dây rốn biểu hiện các kháng nguyên đặc biệt của tế