Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người thành tế bào dạng tạo xương

Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người thành tế bào dạng tạo xương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Đỗ Minh Trung NGHIÊN CỨU BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN NGƯỜI THÀNH TẾ BÀO DẠNG TẠO XƯƠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Đỗ Minh Trung NGHIÊN CỨU BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN NGƯỜI THÀNH TẾ BÀO DẠNG TẠO XƯƠNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS.TS. Lê Văn Đông 2. GS.TS. Đặng Thị Thu HÀ NỘI – 2013 LỜI CAM ĐOAN Luận án này là sản phẩm khoa học thuộc đề tài “Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc màng dây rốn thành tế bào xương” mã số: 106.99.174.09 do Học viện Quân y chủ trì. Luận án cũng sử dụng một phần kết quả của đề tài “Nghiên cứu xây dựng ngân hàng tế bào gốc dây rốn khu vực Miền Nam và ứng dụng vào điều trị bệnh ở người” mã số ĐTĐL 2007-03 do Công ty cổ phần hóa dược phẩm Mekophar chủ trì và Học viện Quân y là đơn vị phối hợp thực hiện. Là người tham gia trực tiếp thực hiện các nội dung thuộc đề tài được trình bày trong luận án này, tôi xin cam đoan những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực và chưa từng được các tác giả khác công bố trong các luận văn, luận án nào và đã được chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng vào luận án này. Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Nghiên cứu sinh Đỗ Minh Trung LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới Thượng tá PGS.TS Lê Văn Đông - Chủ nhiệm Bộ môn Độc học và Phóng xạ Quân sự, Trưởng phòng Protein- Độc chất-Tế bào, Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y và GS.TS Đặng Thị Thu, Nguyên Phó viện trưởng Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn tới PGS.TS Tô Kim Anh Viện trưởng, PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm, Trưởng bộ môn Hóa sinh – Vi sinh - Sinh học phân tử, PGS.TS Khuất Hữu Thanh, TS. Lê Quang Hòa cùng các thầy cô giáo, các cán bộ phòng Hóa sinh – Vi sinh - Sinh học phân tử, Trung tâm nghiên cứu & phát triển công nghệ sinh học - Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm và Viện Đào tạo Sau đại học – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình giúp đỡ, dạy bảo và động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Đại tá GS.TS Hoàng Văn Lương – Phó Giám đốc Học viện Quân y cùng các cán bộ, nhân viên Phòng Protein-Độc chất -Tế bào, Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y và Ngân hàng Tế bào gốc MekoStem đã động viên, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình công tác và thực hiện nghiên cứu. Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Nghiên cứu sinh Đỗ Minh Trung MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH iv ĐẶT VẤN ĐỀ 1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI 4 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 5 1.1. Tế bào gốc và công nghệ tế bào gốc 5 1.1.1. Tình hình nghiên cứu tế bào gốc nước ngoài 5 1.1.2. Tình hình nghiên cứu tế bào gốc trong nước 6 1.1.3. Tế bào gốc 7 1.1.4. Phân loại tế bào gốc 10 1.1.5. Tế bào gốc trung mô 14 1.1.5.1. Khái niệm 14 1.1.5.2. Đặc điểm 14 1.1.5.3. Tiềm năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô 15 1.1.5.4. Các nguồn tế bào gốc trung mô 19 1.2. Ứng dụng của tế bào gốc 21 1.3. Các bệnh về xương khớp và tế bào gốc trong điều trị các bệnh về xương khớp 22 1.4. Dây rốn, tế bào gốc từ dây rốn 27 1.4.1. Mô học, giải phẫu và chức năng 27 1.4.2. Tế bào gốc trung mô từ màng bao dây rốn 27 1.4.3. Tế bào gốc từ màng dây rốn và tiềm năng ứng dụng 28 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1. Vật liệu nghiên cứu 32 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu: 32 2.1.2. Hóa chất và Máy móc thiết bị 32 2.2. Phương pháp nghiên cứu 34 2.2.1. Phân lập tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn người 34 2.2.1.1. Thu thập và bảo quản dây rốn 34 2.2.1.2. Phân lập tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn người 34 2.2.1.3. Nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô màng dây rốn 35 2.2.2. Kiểm định sản phẩm tế bào gốc 35 2.2.2.1. Định danh tế bào gốc bằng dấu ấn bề mặt 35 2.2.2.2. Kiểm tra tính gốc của tế bào gốc trung mô màng dây rốn 36 2.2.3. Biệt hóa in vitro tế bào gốc trung mô theo hướng thành tế bào tạo xương 36 2.2.3.1. Khảo sát môi trường cơ bản và nồng độ chất cảm ứng biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tế bào tạo xương 36 2.2.3.2. Kiểm tra sự tích lũy canxi của tế bào sau biệt hóa bằng nhuộm alizarin red 38 2.2.3.3. Khả năng tích tụ canxi của tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô 38 2.2.3.4. Xác định hoạt tính của Alkaline phosphates (ALP) 38 2.2.4. Tách chiết RNA và tiến hành phản ứng RT-PCR (Reverse Trancriptase - Polymerase Chain Reaction) 39 2.2.5. Phương pháp xác định số lượng tế bào nuôi cấy 43 2.2.6. Thu hoạch và bảo quản tế bào 44 2.2.7. Phục hồi tế bào sau bảo quản lạnh sâu 44 2.2.8. Cấy ghép tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn lên chuột nhắt đã gây suy giảm miễn dịch bằng hóa chất 45 2.2.8.1. Tạo mô hình chuột nhắt suy giảm miễn dịch 45 2.2.8.2. Cấy ghép tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn trên chuột 45 2.3.9. Nhuộm hematoxylin và eosin 46 2.2.10. Phương pháp xử lý số liệu 46 2.2.11. Đạo đức trong nghiên cứu 46 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1. Phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn người 47 3.1.1. Thu thập mẫu dây rốn 47 3.1.2. Khảo sát thời gian nuôi cấy mô tách màng dây rốn và khả năng bám dính 47 3.1.2.1. Thời gian nuôi cấy mô 47 3.1.2.2. Kết quả nuôi cấy màng dây rốn phân lập tế bào 49 3.1.3. Khảo sát môi trường cơ bản phân lập và nuôi cấy tế bào gốc 52 3.1.4. Thời gian nuôi cấy mô phân lập tế bào gốc trung mô 54 3.1.5. Khảo sát số lần cấy chuyển mô 60 3.1.6. Khảo sát thời gian c ấy chuyển, nuôi cấy tăng sinh tế bào 62 3.2. Kiểm định sản phẩm tế bào gốc 64 3.2.1. Định danh tế bào bằng dấu ấn bề mặt 64 3.2.2. Kiểm tra tính gốc của tế bào gốc trung mô màng dây rốn 67 3.3. Biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn thành tế bào dạng tạo xương 69 3.3.1. Khảo sát môi trường cơ bản để biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn thành tế bào dạng tạo xương 69 3.3.2. Khảo sát n ồng độ chất cảm ứng biệt hóa TBG trung mô màng dây rốn thành tế bào dạng tạo xương 71 3.3.3. Thời gian biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn thành tế bào dạng tạo xương 75 3.3.4. Xác định hoạt tính Alkaline phosphatase (ALP) 78 3.3.4. Biệt hóa tế bào 80 3.4. Một số biến đổi phân tử của tế bào gốc trung mô màng dây rốn trong quá trình biệt hóa thành tế bào dạng tạo xương 84 3.5. Kết quả bước đầu thử nghiệm cấy ghép tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô trên động vật 89 KẾT LUẬN 93 KIẾN NGHỊ 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO 95 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 109 PHỤ LỤC 110 i DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ALP Alkaline phosphatase: phosphatase kiềm AsA Ascorbic acid AsAP L-ascorbic acid 2 phosphat AT Adipose Tissue: Mô mỡ BM Bone Marrow: Tủy xương bp Base pair: cặp base BSA Bovine Serum Albumin BU Busulfan CD Cluster of Differentiation cDNA Complementary deoxyribonucleic acid COL I Colagene type I CY Cyclophosphamide DMEM Dulbecco ’ s Modified Eagle Medium DMEM-LG Dulbecco ’ s Modified Eagle Medium Low Glucose DMSO Dimethyl Sulfoxide D-PBS Dulbecco's Phosphate buffer saline EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid F12 Nutrient Mixture F12 FBS Fetal brovine serum: Huyết thanh bào thai bê FITC Fluorescein isothiocyanate HBV Hepatitis B Virus HCV Hepatitis C Virus HIV Human Immunodeficiency Virus HLA Human leukocyte antigen: Kháng nguyên bạch cầu người IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthin ICM Inner Cell Mass: Khối tế bào bên trong IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium MSC Mesenchymal Stem Cell: Tế bào gốc trung mô OC Osteocalcin ON Osteopontin PBS Phosphate buffer saline pNPP P-Nitrophenyl phosphate ii RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse trancriptase Polymerase chain reaction ß-GP ß-glycerolphosphate TBG Tế bào gốc TBTX Tế bào tạo xương TGF-β Transforming growth factor beta UC Umbilical Cord: Dây rốn UCB Umbilical Cord Blood: Máu dây rốn iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Ứng dụng lâm sàng của tế bào gốc trung mô trong tái tạo xương 21 Bảng 2.1: Thành phần môi trường biệt hóa được khảo sát 37 Bảng 2.2: Nồng độ chất cảm ứng biệt hóa được khảo sát 37 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 39 Bảng 2.4. Trình tự các cặp mồi sử dụng để nhận biết tế bào tạo xương bằng kỹ thuật RT-PCR 40 Bảng 3.1: Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy mô tách màng dây rốn 48 Bảng 3.2: Nuôi cấy mô phân lập tế bào 51 Bảng 3.3: Kết quả khảo sát môi trường cơ bản để nuôi cấy phân lập tế bào 52 Bảng 3.4: Lượng canxi tích lũy trong tế bào cảm ứng biệt hóa bằng các chất cảm ứng khác nhau ở những nồng độ khác nhau 72 Bảng 3.5: Kết quả OD khả năng tích tụ canxi của tế bào biệt hóa 77 Bảng 3.6: Hoạt tính Alkaline phosphatase 79 Bảng 3.7: Xác định khả năng tích tụ canxi trong 10 mẫu tế bào biệt hóa 82 Bảng 3.8: Hoạt tính Alkaline phosphatase của tế bào xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn 83 Bảng 3.8: Kết quả gây suy giảm miễn dịch chuột bằng Busulfan 20mg/kg và Cyclophosphamide 50mg/kg 90 [...]... điều kiện thích hợp biệt hóa của tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn người thành tế bào dạng tạo xương in vitro (môi trường cơ bản, chất cảm ứng, thời gian ) 4 Nghiên cứu một số biến đổi của tế bào gốc trung mô màng dây rốn trong quá trình biệt hóa thành tế bào dạng tế bào tạo xương 5 Thử nghiệm cấy ghép tế bào dạng tạo xương thu được sau biệt hóa từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn người lên chuột nhắt... hệ gen của tế bào gốc phôi, khởi động sự biệt hóa tế bào gốc theo con đường tạo thành tế bào chuyên hóa mong muốn Biệt hóa thành tế bào tạo xương: Tế bào gốc trung mô có thể biệt hóa thành tế bào thuộc trung bì, ví dụ như tế bào tạo xương, tế bào mỡ và sụn Để biệt hóa in vitro thành tế bào tạo xương, TBG trung mô được cảm ứng biệt hóa trong môi trường nuôi cấy có bổ sung một hỗn hợp các hóa chất như... in vitro tế bào gốc trung mô màng dây rốn người theo hướng thành tế bào dạng tạo xương nhằm ứng dụng điều trị tổn thương xương 2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: 1 Nghiên cứu áp dụng qui trình phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn trẻ sơ sinh 2 Nghiên cứu minh chứng kiểm định tế bào phân lập được từ màng dây rốn người theo qui trình áp dụng là tế bào gốc trung mô 3 Nghiên cứu các điều... hình thành cấu trúc xương mới hàn gắn khuyết hổng xương [12,13,14] Xuất phát từ những cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người thành tế bào dạng tạo xương với các mục tiêu sau: 1 Thu nhận và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô từ màng bao dây rốn người làm vật liệu để biệt hóa tế bào 2 Biệt hoá in vitro tế. .. dây rốn là một nguồn cung cấp TBG trung mô rất lý tưởng 19 Hình 1.6: Tiềm năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô từ các nguồn khác nhau [139] (MSC có thể thu thập được từ cơ xương, tủy xương, dây chằng, mô mỡ, nhau thai, dây rốn và máu dây rốn TBG trung mô có tiềm năng biệt hóa thành tế bào có nguồn gốc trung mô như các tế bào mỡ, nguyên bào xương, sụn, các tế bào thần kinh từ lớp ngoại bì, các tế bào. .. bằng hóa chất 3 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI Từ nguồn tế bào gốc trung mô phân lập được từ dây rốn trẻ sơ sinh đã tiến hành biệt hóa các tế bào gốc trung mô này thành tế bào dạng tạo xương rồi cấy ghép thử nghiệm tế bào được biệt hóa trên mô hình chuột suy giảm miễn dịch bằng hóa chất Đây là công trình lần đầu được nghiên cứu một cách hệ thống về quy trình thu nhận, nuôi cấy tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc trung. .. 10 mẫu tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào 88 Hình 3.22: Hình ảnh sau 1 tháng cấy ghép tế bào tạo xương trên chuột suy giảm miễn dịch 90 Hình 3.23: Nốt can xi sau khi làm tiêu bản nhuộm hematoxylin và eosin 91 Hình 3.24: Quy trình biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn thành tế bào tạo xương 92 v ĐẶT VẤN ĐỀ Tế bào gốc (TBG) là các tế bào chưa có chức năng chuyên biệt, có khả năng biệt hoá thành. .. tích tụ canxi trong 10 mẫu tế bào biệt hóa 81 Hình 3.18: Xác định hoạt tính Alkaline phosphatase trong 10 mẫu tế bào biệt hóa từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn 83 Hình 3.19: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RNA của tế bào gốc trung mô 85 Hình 3.20: Xác định dấu ấn ß-Actin, OC, ON của 10 mẫu tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn 87 Hình 3.21:... tủy xương [49,50,64] Để ứng dụng điều trị vết thương xương sớm có kết quả, các TBG cần được biệt hóa thành tế bào tạo xương trước khi được cấy ghép vào ổ gãy xương Theo cách này, các TBG trung mô được phân lập, sau đó được tăng sinh và biệt hóa in vitro thành các tế bào khi quan sát dưới kính hiển vi có hình dạng giống tế bào tạo xương (gọi tắt là tế bào dạng tế bào tạo xương hay tế bào dạng tạo xương) ... Việt Đức và Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 tiến hành ghép tế bào gốc từ tủy xương điều trị tổn thương xương khó lành hoặc khớp giả [13,14] Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh tiến hành các nghiên cứu cơ bản về tế bào gốc, biệt hóa tế bào gốc trung mô dây rốn [22, 23] Năm 2009, Ngân hàng tế bào gốc dây rốn đầu tiên của Việt Nam được thành lập để lưu trữ các tế bào gốc từ mẫu mô dây rốn Hiện tại ở Việt . phẩm tế bào gốc 64 3.2.1. Định danh tế bào bằng dấu ấn bề mặt 64 3.2.2. Kiểm tra tính gốc của tế bào gốc trung mô màng dây rốn 67 3.3. Biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn thành tế bào dạng. màng dây rốn người theo qui trình áp dụng là tế bào gốc trung mô. 3. Nghiên cứu các điều kiện thích hợp biệt hóa của tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn người thành tế bào dạng tạo xương in. nguồn tế bào gốc trung mô phân lập được từ dây rốn trẻ sơ sinh đã tiến hành biệt hóa các tế bào gốc trung mô này thành tế bào dạng tạo xương rồi cấy ghép thử nghiệm tế bào được biệt hóa trên mô