Nghiên cứu các Týp của Helicobacter pylori và sự biểu lộ Protein P53 ở bệnh nhân ung thư dạ dày

Nghiên cứu các Týp của Helicobacter pylori và sự biểu lộ Protein P53 ở bệnh nhân ung thư dạ dày

MéT Sè CH÷ VIÕT T¾T

ADN Acid Desoxyribo Nucleic

BC§NTT B¹ch cÇu ®a nh©n trung tÝnh

CagA Cytotoxin associated gene A

Cagpai Cytotoxin associated gene Pathogenicity island

UTDD Ung th− d¹ dµy

VacA Vacuolating associatede cytotoxin gene A

WTp53 Wild type p53

ĐặT VấN Đề

Trong số các bệnh ung thư xuất hiện khắp thế giới, UTDD đứng hàng thứ tư trong các loại ung thư và khoảng 2/3 các trường hợp UTDD mới xẩy ra ở các nước đang phát triển Tại Việt nam, bệnh đứng hàng đầu trong các loại ung thư đường tiêu hoá

Các yếu tố nguyên nhân và bệnh sinh UTDD còn chưa được làm sáng

tỏ hoàn toàn: yếu tố ngoại sinh (chế độ ăn; HP), yếu tố nội sinh (nhóm máu và sự thay đổi gen) Đặc biệt trong những thập kỷ gần đây người

ta nhắc đến vai trò của Helicobacter pylori trong bệnh sinh UTDD Tổ

chức y tế thế giới năm 1994 đã xếp HP vào trong nhóm I- các tác nhân gây ung thư ở người Các nghiên cứu dịch tễ cho thấy HP được coi là nguyên nhân của 30% trường hợp UTDD tại các nước phát triển và 50% trường hợp UTDD tại các nước đang phát triển Mối liên quan

giữa HP và UTDD đã được thiết lập và bàn cãi hơn 10 năm nay, nhưng

người ta vẫn nhận thấy rằng, trong số những người nhiễm HP thì 15%

sẽ phát triển thành các bệnh lý dạ dày hành tá tràng và chỉ có 1% phát triển trở thành UTDD Để giải thích được điều này, các tác giả trên thế giới đang tập trung nghiên cứu vào yếu tố gây bệnh của vi khuẩn HP:

CagA, VacA, … trong đó protein VacA, protein CagA là những tác

nhân gây bệnh rất quan trọng Phần lớn các nghiên cứu đều cho thấy, nhiễm một số týp HP có độc lực cao, kết hợp cùng với yếu tố cơ thể chủ, các thay đổi về di truyền thì có nguy cơ UTDD rất cao Trong số các thay đổi về di truyền, p53 là biến đổi sinh học phân tử thường gặp nhất trong bệnh lý ung thư Hơn 95% các đột biến gen p53 là đột biến sai nghĩa gây ra những phá huỷ protein p53 là nguyên nhân của gần 50% ung thư ở người trong đó có UTDD Các nghiên cứu phát hiện

thấy protein p53 trong 26,3-64% UTDD Như vậy, HP, p53 và sự phối

hợp cả 2 yếu tố trên có vai trò như thế nào trong bệnh lý UTDD- đó là một vấn đề lớn đang làm cho các tác giả trên thế giới băn khoăn Vì

vậy chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu các týp của Helicobacter pylori và sự biểu lộ protein p53 ở bệnh UTDD nhằm mục đích:

1.Tìm hiểu tỷ lệ týp HP mang gen CagA, VacA và sự phân bố các týp này trong bệnh lý UTDD tại bệnh viện Bạch mai

2.Tìm hiểu sự biểu lộ protein p53 ở các BN UTDD có và không nhiễm

HP

Những điểm mới về mặt khoa học và giá trị thực tiễn của đề tài

1.Đưa ra nhận xét về nhiễm các týp HP trong UTDD như: tỷ lệ HP

CagA (80,9%) với OR=4,68; tỷ lệ VacA (97,6%) với OR= 37,27 lần;

HP trong UTDD chủ yếu là týp I (78,6%) và thường gặp ở týp ruột; không gặp týp II Đây là một trong những cơ sở để đánh giá vai trò các týp HP trong bệnh lý UTDD và xem xét chỉ định điều trị diệt trừ HP

CagA(+) ở những BN khó tiêu không loét

2.Đưa ra nhận xét về biểu lộ protein p53 trong bệnh UTDD: p53(+) là 51,2% Không có liên quan giữa protein p53 với bệnh UTDD Không

có liên quan giữa nhiễm HP kết hợp với protein p53 ở bệnh UTDD

3 UTDD còn phổ biến ở Việt nam, nhiễm HP cũng thường gặp, đề tài

đã đóng góp những hiểu biết mới về bệnh sinh UTDD để có những biện pháp kiểm soát căn bệnh này trong tương lai

Cấu trúc luận án

Luận án gồm 122 trang, với 26 bảng, 13 biểu đồ, 11 hình và 14 ảnh minh hoạ Có 178 tài liệu tham khảo gồm: 12 tài liệu tiếng Việt, 16 tài liệu tiếng Pháp, 150 tài liệu tiếng Anh

Ngoài phần đặt vấn đề và kết luận, luận án gồm 4 chương

Chương 2-Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 17 trang

Chương 1

Tổng quan 1.1.Nhắc lại một số điểm về UTDD

1.1.1.Dịch tễ học UTDD: trong 4 thập kỷ gần đây, có sự sụt giảm tỷ lệ

UTDD mới mắc tại các nước phương Tây và châu Mỹ nhưng bệnh vẫn

là một trong những loại bệnh ung thư phổ biến nhất ở châu á và Việt nam Bệnh thường gặp ở lứa tuổi trung niên, người già, và chiếm ưu thế ở nam

1.1.2.Các điều kiện tiền ung thư dạ dày: loét dạ dày, viêm dạ dày,

polyp dạ dày, bệnh Menetrier, dạ dày phẫu thuật

1.2.Vi khuẩn Helicobacter pylori: thuộc họ Helicobacteraceae, dạng

xoắn, bắt màu gram âm

1.2.1.Dịch tễ và cơ chế truyền bệnh: tỷ lệ nhiễm HP thay đổi tùy theo

từng nước: 20-90%, vùng dịch tễ cao: châu á, Nam Mỹ, ấn độ, Trung quốc Người là nguồn chứa HP chính và cách truyền bệnh chủ yếu là giữa người với nguời

1.2.2.Cơ chế gây bệnh: Các lông ở đầu cực và dạng xoắn khuẩn giúp

cho HP xâm nhập vào niêm mạc dạ dày Các yếu tố gây bệnh của HP

được chú ý nhiều nhất gồm: CagPAI, VacA, các protein tiền viêm

1.2.3.Các phương pháp phát hiện HP: phương pháp xâm phạm (sử

dụng mảnh sinh thiết dạ dày): test Urease, mô bệnh học, PCR và phương pháp không xâm phạm: ELISA, test hô hấp

1.3.Vai trò của HP và các týp HP trong bệnh lý UTDD

1.3.1.Mối liên quan giữa HP và bệnh UTDD: tỷ lệ nhiễm HP trong

UTDD thay đổi từ 60-95% Nơi có tỷ lệ UTDD lớn, người ta phát hiện

tỷ lệ cao HP dương tính Các nghiên cứu ca bệnh chứng đều cho thấy người nhiễm HP có nguy cơ UTDD gấp 6 lần Có 2 loại UTDD kết hợp vơí HP: ung thư biểu mô và u lympho ác tính

1.3.2.Liên quan giữa týp HP có gen CagA(+) với UTDD:

Cấu trúc của CagA: Gen CagA nằm ở đầu 3’ của gen CagPAI và sản

phẩm là protein CagA-yếu tố gây bệnh được nhắc đến nhiều nhất của

HP Protein CagA có tác dụng kích thích bài tiết IL8, tác động đến hiện tượng chết TB, giảm khả năng sống của TB dạ dày

Vai trò của týp HP CagA: người nhiễm HP CagA(+) có nguy cơ

UTDD gấp 5-8 lần Týp HP này gây hiện tượng viêm teo dạ dày đặc biệt là vùng thân vị (do sản xuất IL8), DSR, LS Đồng thời HP

CagA(+) tồn tại trong dạ dày với nồng độ lớn hơn và thời gian lâu hơn

1.3.3.Liên quan giữa týp HP VacA(+) với UTDD

Cấu trúc và chức năng của VacA: Gen VacA (vùng s, m) mã hoá

protein VacA có cấu trúc giống bông hoa 6 cánh có tác dụng: tích luỹ VacA trong màng nhân TB tạo các hốc, tăng tính thấm màng TB với

Fe, Ni, hình thành cực anion trên lớp dính kép

Vai trò của týp HP VacA: Nhiễm HP VacAs1, CagA có nguy cơ cao

UTDD Tại Thái lan, ấn độ: UTDD liên quan đến phân týp m2, tại châu Phi là phân týp s1 của VacA

1.3.4.Các týp của HP

Các týp của HP: Xiang là người đầu tiên phân loại HP và hiện nay HP

được chia thành 4 týp: Týp I: CagA(+), VacA(+); Týp II: CagA(-), VacA(-), Týp III: CagA(-), VacA(+); Týp IV: CagA (+), VacA(-)

Liên quan giữa các týp HP với UTDD: týp I gây tổn thương TB biểu

mô và VDD nặng(týp I có tác dụng thu hút BCĐNTT, tổng hợp và giải phóng IL8; týp I gây rối loạn hiện tượng thực bào, kích hoạt ĐTB); týp

II chỉ đính vào TB Týp I gây giảm bài tiết axít đến 60% và kích hoạt các yếu tố và các gen đóng vai trò quan trọng trong sự chuyển biến ác tính niêm mạc dạ dày

1.4.Protein p53 Gen p53(17p13.1) mã hoá protein p53-393axit amin

Khi bị đột biến p53 có thể mất toàn bộ 2 alen hoặc chỉ một alen bị mất

đi trong khi alen kia bị đột biến ở một hoặc một vài vị trí dẫn đến đến

sự tạo ra protein p53 đột biến hay MTp53

Khi ADN của TB bị tổn thương, làm kích hoạt protein p53 (WTp53)

WT p53 có tác dụng ngừng chu trình phân bào cho đến khi ADN được

sửa chữa hoặc gây hiện tượng chết tế bào theo chương trình nếu ADN tổn thương không thể sửa chữa được vì vậy protein p53 có thể coi như

là trạm gác của bộ gen tế bào (guardian genome.) Ngoài ra protein

p53 còn có khả năng kích hoạt hay ức chế một số gen khác

1.5.Vai trò của protein p53 trong bệnh UTDD: Tỷ lệ biểu lộ p53

(+) thay đổi từ 26,3% đến 64% các trường hợp UTDD (theo các nghiên cứu của Wang, Victorzon, Munig, Maeda )

1.5.1.Trong UTDD, sự biểu lộ protein p53 liên quan đến sự lan tràn của khối u dạ dày: p53 liên quan đến sự xâm lấn khối u theo các lớp

của thành dạ dày và di căn xa Khi có p53 dương tính thời gian sống thêm của BN thường ngắn

1.5.2Sự xuất hiện MT p53 trong UTDD: MTp53 thường xuất hiện ở

UTDD giai đoạn muộn và thường gặp ở týp ruột

1.6.Nhiễm HP, sự biểu lộ protein p53 trong bệnh UTDD

1.6.1.Nhiễm HP làm mất sự ổn định bộ gen của TB chủ dẫn đến

UTDD và điều trị diệt trừ HP làm cải thiện mức độ VDD, viêm teo, DSR, LS và sự không ổn định của bộ gen Các BN có tổn thương tiền

ung thư thường liên quan đến nhiễm HP CagA(+) cùng với sự không

ổn định của bộ gen, p53 làm tăng nguy cơ UTDD

1.6.2.HP tác động vào quá trình phân bào và hiện tượng chết TB

thông qua trung gian p53 Hiện tượng chết TB tại cổ tuyến gây viêm teo dạ dày và lâu dài dẫn đến UTDD

1.6.3.HP bằng các con đường khác nhau hoặc gây ra sự biểu lộ quá

mức WTp53 hoặc gây sự xuất hiện MT p53 và kết quả là tăng nguy cơ UTDD

Chương 2

Đối tượng vμ phương pháp nghiên cứu

2.1.Đối tượng nghiên cứu:

Gồm 126 BN: 84 BN được chẩn đoán xác định UTDD qua mô bệnh học và 42 BN VDD nhiễm HP Tất cả BN đều được điều trị nội hoặc ngoại trú tại khoa Tiêu hoá và/hoặc khoa thăm dò chức năng bệnh viện Bạch mai từ tháng 4/2000 đến tháng 9/2004

Tiêu chuẩn loại trừ: Bệnh phẩm không đạt yêu cầu đặt ra

vị: mô bệnh học và xác định gen CagA, VacA theo phương pháp PCR

-Chẩn đoán UTDD và VDD: qua mô bệnh học áp dụng phân loại của Lauren 1965 để xem xét mối liên quan giữa HP với 2 týp: týp ruột, týp lan toả Đánh giá tổn thương niêm mạc dạ dày qua xét nghiệm mô

bệnh học dựa theo phân loại Whitehead 1985: viêm cấp, viêm mạn nông, viêm mạn teo (nhẹ, vừa, nặng), DSR, LS

-Xác định nhiễm HP qua test Urease và mô bệnh học BN được coi là

có nhiễm HP khi test Urease và mô bệnh học đều cho kết quả dương tính

2.2.2.Xét nghiệm phát hiện gen CagA, VacA ở mảnh sinh thiết dạ

dày theo kỹ thuật khuyếch đại gen tại labo trung tâm trường Đại học Y

Hà nội

-Chỉ có BN HP(+) thì mảnh sinh thiết mới được tiến hành làm PCR

xác định gen CagA, VacA

-Mẫu sinh thiết được giữ trong tủ đông (-700C) Tách chiết ADN từ

mảnh sinh thiết dạ dày, mồi (primer) dùng cho gen CagA, VacA và

chu trình nhiệt được làm theo quy trình của Yamaoka Thành phần trình tự mồi như sau

nucleotide

Gene

CagA-F GAT AAC AGG CAA GCT TTT GAG G 22

CagA-R CTG CAA AAG ATT GTT TGG CAG A 22

CagA 349bp

VacA-F ATG GAA ATA CAA CAA ACA CAC 21

HP

VacA-R CTG CTT GAA TCG GCC AAA C 19

VacA 259bp

Mảnh sinh thiết được nghiền nhỏ rồi cho dung dịch tách ADN vào ADN trong dịch được tủa bằng cồn tuyệt đối, ly tâm lấy cặn, rửa cặn, làm khô và hoà tan bằng TE-dung dịch ADN để làm PCR Dung dịch tham gia phản ứng PCR được pha chế từ Ready-To-Go PCR Beads Phản ứng được chạy với 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 950C/phút,

520C/phút, 720C/phút Sản phẩm PCR được điện di ngang với agarose

1,5% trong TAE 1* trên máy điện di ngang Mupid II(Nhật bản) Sau khi điện di xong, bản thạch agarose được nhuộm trong ethidium bromide rồi soi dưới tia UV và chụp ảnh

Chứng dương: HP ATCC 43504(CagA dương tính, VacA dương tính)

Xác định các týp HP: Týp I: CagA(+), VacA(+); Týp II: CagA(-),

VacA(-), Týp III: CagA(-), VacA(+); Týp IV: CagA(+),VacA(-)

2.2.3.Xác định sự biểu lộ protein p53 trên mảnh sinh thiết dạ dày theo

kỹ thuật hoá mô miễn dịch tại bộ môn Giải phẫu bệnh trường Đại học

-Kết quả: phản ứng dương tính thể hiện bằng mầu nâu đỏ ở nhân tế bào Chứng âm là biểu mô lành tuyến dạ dày Chứng dương được xác

định bằng các trường hợp dương tính thật trong cùng một lô nhuộm Những trường hợp dương tính giả và âm tính giả được loại khỏi nghiên cứu trong quá trình đánh giá

2.3.Xử lý số liệu: tất cả số liệu thu được sẽ xử lý theo các thuật toán

thống kê y học trên máy vi tính với chương trình EPI-INFO 6.04 của

tổ chức y tế thế giới năm 1988, và SPSS 11.0 của hiệp hội thống kê Hoa kỳ

Chương 3

Kết quả nghiên cứu

126 BN nghiên cứu gồm: 84 BN UTDD và 42 BN VDD có nhiễm HP; Nhóm I: UTDD nhiễm HP (n=42): nam-31(73,8%), nữ:11(26,2%) Nhóm II: VDD nhiễm HP (n=42): nam-32 (76,2%), nữ -10 (23,8%) Nhóm III:UTDD HP(-) (n=42): nam-26(61,9%), nữ-16 (38,1%)

3.1.Nhận xét về đặc điểm nhóm BN nghiên cứu:

-Không có sự khác biệt về tuổi và giới ở 3 nhóm nghiên cứu

-Nhóm UTDD: Khối u hay gặp ở hang vị và dạng Borrman III Theo phân loại Lauren, týp ruột chiếm tỷ lệ cao nhất ở cả 2 nhóm UTDD -Nhận xét về tổn thương niêm mạc dạ dày: viêm mạn teo, DSR, LS ở nhóm UTDD cao hơn so với nhóm VDD (P<0,05)

3.2.Nhận xét về các týp HP ở BN nhiễm HP

3.2.1.Tình trạng nhiễm HP mang gen CagA,VacA ở BN nhiễm HP

Bảng 3.1.Tỷ lệ nhiễm HP mang gen CagA, VacA ở nhóm BN HP(+)

Bảng 3.2 Tỷ lệ nhiễm HP mang gen CagA, theo vị trí và hình ảnh đại

-HP CagA(+),VacA(+) hay gặp ở vùng hang vị (29/42=69,1%,

33/42=78,5%) và khối u dạng Borrman III (19/42=45,2%, 22/42=52,4%)(p<0,05)

Bảng 3.3.Tỷ lệ HP mang gen CagA, VacA theo phân loại Lauren 1965

Theo phân loại của Lauren 1965, HP mang gen CagA, VacA chiếm tỷ

lệ cao nhất ở týp ruột (57,1; 61,9%)

Bảng 3.4.Tỷ lệ HP mang gen CagA, VacA ở các thể viêm niêm mạc dạ dày theo phân loại của Whitehead 1985 ở nhóm BN nhiễm HP

-BN UTDD nhiễm HP CagA(+) có tổn thương niêm mạc dạ dày nặng

hơn (VMT-76,3%, đặc biệt VMT vừa-38,1%) so với BN VDD nhiễm

HP CagA(+)(VMT-47,8%, VMT vừa-11,9%) và BN UTDD HP CagA(-) (VMT-9,6%,VMT vừa-4,8%) (P<0,05) Tổn thương niêm mạc dạ dày ở nhóm BN nhiễm HP VacA(+) nặng hơn so với nhóm BN VacA(-)

Bảng 3.5.Liên quan giữa týp HP mang gen CagA,VacA với DSR,LS

),VacA(-)(6/42=14,3%; 5/42=11,9%) Trong nhóm VDD, tổn thương

DSR, LS chỉ gặp ở BN nhiễm HP CagA(+),VacA(+)

-Nguy cơ tương đối của HP mang gen CagA,VacA được xác định theo

bảng 3.6.và bảng 3.7: OR của CagA=ad/bc=748/160=4,68 với khoảng

tin cậy 95% là [1,80; 12,06]; OR của VacA=ad/bc=820/22=37,27 với

khoảng tin cậy 95% là [4,71-295,89]

Bảng 3.6.Tỷ suất OR với CagA Bảng 3.7.Tỷ suất OR với VacA

Có phơi nhiễm a=34 b=20 Có phơi nhiễm a=41 b=22

Không phơi nhiễm c=9 d=22 Không phơi nhiễm c=1 d=20

-Trong nhóm UTDD, týp I chiếm tỷ lệ cao nhất (78,6%.) Không gặp

týp II Ngược lại trong nhóm VDD týp I và týp II chiếm tỷ lệ 33,3%

-Không có sự khác biệt về sự phân bố các týp HP theo vị trí khối u và

Týp I gÆp nhiÒu nhÊt ë UTDD týp ruét (59,5%) ChØ cã mét tr−êng hîp u lympho vµ tr−êng hîp nµy nhiÔm HP týp I

B¶ng 3.10.Sù ph©n bè c¸c týp HP theo tæn th−¬ng niªm m¹c d¹ dµy

Tỷ lệ DSR, LS gặp nhiều nhất ở BN nhiễm HP týp I (10/42=23,8%, 8/42=9,1%), sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê

3.3.Nhận xét về sự biểu lộ protein p53, nhiễm HP trong bệnh UTDD

3.3.1.Nhận xét về sự biểu lộ protein p53 ở nhóm UTDD

-Tỷ lệ biểu lộ protein p53(+) ở 84 BN UTDD qua xét nghiệm hoá mô miễn dịch là 43/84=51,2%

-Tỷ lệ p53(+) ở lứa tuổi dưới 65 (32/58=55,2%) cao hơn so với lứa tuổi trên 65 (11/26=42,35)

-Tỷ lệ p53(+) ở nam giới (36/57=63,2%) cao hơn so với nữ giới (7/27)(p<0,05)

Bảng 3.10 Tỷ lệ p53(+) theo vị trí và hình ảnh đại thể khối u

n=43

P53(-) n=41

u tâm vị: 66,7%

B¶ng3.11.Sù biÓu lé protein p53 theo cÊu tróc vi thÓ khèi u

N=43

P53(-) N=41

-Sù biÓu lé protein p53(+) th−êng gÆp ë nhãm viªm m¹n teo nh−ng sù kh¸c biÖt nµy kh«ng cã ý nghÜa thèng kª

B¶ng 3.14.Tû lÖ nhiÔm HP, p53 víi tæn th−¬ng vi thÓ khèi u vµ DSR,LS

Chương 4

Bμn luận 4.1.Nhận xét về các týp HP trong nhóm BN nhiễm HP

4.1.1.Tình trạng nhiễm HP mang gen CagA, VacA trong UTDD

4.1.1.1.Tỷ lệ nhiễm HP mang gen CagA, VacA trong UTDD

-Trong nghiên cứu chúng tôi, CagA(+): 80,9%, VacA: 97,6% Kết quả

này cao hơn so với T.Long, NVThịnh, nhưng tương đương với các tác giả khác trên thế giới (Konturek, Mitsumo, Evan, ZhiJunPan):

CagA(+) trong UTDD: tỷ lệ 60-100% Điều này được giải thích bởi tỷ

lệ UTDD, HP thay đổi tuỳ theo địa dư

-Hầu hết các nghiên cứu ca bệnh chứng (Konturek, Polli) đều nhận xét

CagA(+) trong UTDD cao hơn so với nhóm chứng.Trong nghiên cứu của chúng tôi, OR của CagA là 4,68, kết quả này phù hợp với Chow, Konturek (OR CagA=8,51), Worth: OR với CagA=6, Kikuchi: OR với CagA=14,6 Tuy nhiên vai trò gây bệnh của CagA còn phụ thuộc vào

miễn dịch cơ thể chủ, thay đổi về gen

-BN nhiễm HP VacA(+) trong nghiên cứu này có nguy cơ UTDD là 37,27 Figueroa: 97%UTDD VacA(+), VanDoorn còn phân tích được các phân týp của VacA trong UTDD (m1 gặp chủ yếu trong UTDD), Israel gặp chủ yếu s2 trong UTDD Đây là một hạn chế trong nghiên cứu mà chúng tôi chưa có điều kiện phân tích các phân týp VacA 4.1.1.2.Tỷ lệ nhiễm HP mang gen CagA, VacA với khối u dạ dày: -Chúng tôi nhận thấy HP CagA, VacA chủ yếu gặp ở vùng hang vị

(69,1%; 78,6%), điều này phù hợp với nhận xét của Grimley, Chow,

Kikuchi Các tác giả cho rằng nhiễm HP CagA(+) gây viêm teo niêm

mạc dạ dày và tăng nguy cơ UTDD đoạn xa

-Xếp loại cấu trúc khối u theo Lauren, CagA(+) trong nghiên cứu của

chúng tôi gặp chủ yếu ở týp ruột (24/26=70,5%) Nhận xét này phù