Phân lập các chủng Bacillus spp có hoạt tính probiotic từ ao nuôi cá tra

MỞ ĐẦU Nuôi trồng thủy sản là thế mạnh của nước ta, trong 10 năm gần đây ngành thủy sản nói chung và nuôi trồng thủy sản nói riêng đã và đang phát triển mạnh mẽ. Theo thống kê của Bộ Nông Nghiệp và Phát triển nông thôn, đến năm 2010, diện tích nuôi trồng thủy sản được mở rộng lên 1,1 triệu ha, sản lượng đạt 2,8 triệu tấn và giá trị xuất khẩu thủy sản đạt 5,034 tỉ USD [3]. Vấn đề dịch bệnh, năng suất và chất lượng của sản phẩm thủy sản luôn được đặt lên hàng đầu. Để quản lý dịch bệnh thì kháng sinh đã và đang là sự lựa chọn hàng đầu của nhiều hộ nuôi, hệ quả là chất lượng thủy sản giảm do hàm lượng kháng sinh tồn dư trong sản phẩm sau khi thu hoạch. Việc lạm dụng kháng sinh quá mức còn gây ra nguy cơ kháng kháng sinh của các chủng gây bệnh, khiến cho liều lượng kháng sinh sử dụng mùa sau cao hơn mùa trước hoặc phải sử dụng luân vòng kháng sinh gây khó khăn cho việc điều trị và kiểm soát dịch bệnh [122]. Với mục tiêu thay thế dần phương pháp phòng và trị bệnh truyền thống, các phương pháp phòng và trị bệnh bằng liệu pháp sinh học ngày càng được ưa chuộng như vaccine, các chất tăng cường hệ miễn dịch (immuno stimulants), chế phẩm sinh học như probiotic. Nghiên cứu về vaccine ứng dụng trên đối tượng thủy sản vẫn đang được nhiều nhà khoa học quan tâm . Vaccine được cho là phương pháp hiệu quả nhất trong phòng ngừa một số bệnh gây ra bởi vi khuẩn và virus , nhưng chưa được sử dụng phổ biến có thể là do giá thành quá cao, thời gian nghiên cứu lâu và thường gây sốc đối với vật nuôi [117]. Do đó, phương pháp trị liệu sinh họ c bằng vi sinh vật có lợi như probiotic đang được đánh giá cao và trở thành công cụ phòng ngừa , điều trị nhiều bệnh hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản thông qua khả năng cải thiện môi trường nước và ức chế vi sinh gây bệnh. Hiện nay có khoảng hơn 400 thương hiệu chế phẩm sinh học đang lưu hành trên thị trường Việt Nam, tuy nhiên các chế phẩm này chủ yếu có nguồn gốc ngoại nhập hoặc sản xuất trong nước, đa số chưa rõ nguồn gốc, các chủng được sử dụng làm probiotic chủ yếu thuộc nhóm Bacillus sp., Lactobacillus sp., Nitrosomonas sp., Saccharomyces, Nitrobacter sp [11]. Trong số các nhóm vi sinh vật nói trên thì Bacillus là một ứng viên quan trọng cho việc sản xuất probiotic vì nhóm này có các đặc tính như: c ó khả năng sinh bào tử, và có khả năng sản sinh các sản phẩm thứ cấp như chất kháng khuẩn, enzyme, hầu hết không gây hại cho người và động vật. Enzyme của Bacillus phân cắt các hợp chất carbohydrate, lipid, protein… rất hiệu quả [29], [79], [108], [120]. Vì những lý do trên, cùng sự hướng dẫn của Tiến sĩ Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh và sự cho phép của Khoa Sinh học trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, tôi thực hiện đề tài “Phân lập các chủng Bacillus spp có hoạt tính probiotic từ ao nuôi cá tra”.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VĂN THỊ THÚY ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP CÁC CHỦNG Bacillus spp CÓ HOẠT TÍNH PROBIOTIC TỪ AO NUÔI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC Mã số:604240 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN THỊ NGỌC TĨNH TP.HCM – 2011 LỜI CẢM ƠN Luận văn này được thực hiện ở Phòng Sinh học Thực Nghiệm- Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2 dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh.  Kính gửi đến TS. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất về sự quan tâm, giúp đỡ và tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành khóa luận này.  Kính gửi đến Th.s Võ Minh Sơn lời cảm ơn chân thành về sự quan tâm, giúp đỡ cũng như đã hỗ trợ kinh phí lẫn kiến thức để tôi thực hiện khóa luận.  Kính gửi đến quý Th ầy, Cô trường Đại học Khoa học Tự Nhiên- ĐHQG TpHCM lòng biết ơn về những kiến thức quý báu đã truyền đạt cho tôi trong suốt quá trình học.  Cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong cuộc sống này. Văn Thị Thúy ii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa i Mục lục ii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục biểu đồ vii Danh mục hình viii MỞ ĐẦU 1 Chương 1 – TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH TRÊN ĐỘNG VẬT THỦY SẢN VÀ CÁC TÁC ĐỘNG TIÊU CỰC CỦA VIỆC DÙNG THUỐC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 3 1.1.1 Tình trạng ô nhiễm môi trường nước trong nuôi trồng thủy sản 3 1.1.2 Mối quan hệ giữa các nhân tố gây bệnh cho động vật thủy sản 4 1.1.3 Các loại bệnh thường gặp trên động vật thủy sản 6 1.1.4 Tác động tiêu cực của việc dùng thuốc trong nuôi trồng thủy sản 9 1.2 TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 12 1.2.1 Định nghĩa probiotic 13 1.2.2 Đặc điểm chung của probiotic 14 1.2.3 Các cơ chế tác động của probiotic 14 1.2.4 Vai trò của probiotic trong nuôi trồng thủy sản 20 1.2.5 Tình hình nghiên cứu prob iotic ứng dụng trong thủy sản ở Việt Nam và trên thế giới 21 iii 1.3 BẺ GÃY QUÁ TRÌNH QUORUM SENSING – CÁCH TIẾP CẬN MỚI TRONG VIỆC KIỂM SOÁT HỆ VI SINH TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 23 1.3.1 Định nghĩa quá trình quorum sensing 23 1.3.2 Bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh – phương pháp tiếp cận mới trong việc kiểm soát bệnh 24 1.3.3 Sự phân hủy sinh học quá trình quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh 25 1.4 TỔNG QUAN VI KHUẨN Bacilllus 27 1.4.1 Đặc điểm chung của chi Bacillus 27 1.4.2 Dinh dưỡng và sinh trưởng 28 1.4.3 Quá trình tạo bào tử của Bacillus 28 1.4.4 Ứng dụng của Bacillus trong nuôi trồng thủy sản 30 Chương 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 31 2.1.1 Thời gian tiến hành 31 2.1.2 Địa điểm tiến hành thí nghiệm 31 2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 31 2.2.1 Nguồn vật liệu phân lập và chủng vi sinh vật kiểm định 31 2.2.2 Địa điểm thu mẫu 31 2.2.3 Môi trường - hóa chất- thiết bị - dụng cụ sử dụng 34 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 35 2.3.2 Phương pháp thu mẫu 37 2.3.3 Phương pháp phân lập 37 2.3.4 Phương pháp chọn lọc 38 2.3.5 Định danh các chủng tuyển chọn 42 iv 2.3.6 Khảo sát các đặc tính probiotic khác 48 2.3.7 Khảo sát các đặc tính sinh lý của các chủng tuyển chọn 51 2.3.8 Khảo sát khả năng tương thích giữa các chủng tuyển chọn 55 2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 56 Chương 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ 57 3.1.1 Kết quả thu mẫu, phân lập và chọn lọc bước một 57 3.1.2 Kết quả sàng lọc dựa vào khả năng sinh enzyme hemolysin 58 3.1.3 Thử khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng thử nghiệm 61 3.1.4 Kết quả định danh các chủng đã tuyển chọn 65 3.1.5Kết quả khảo sát các đặc tính probiotickhác của các chủng tuyển chọn 67 3.1.6 Kết quả khảo sát một số đặc tính sinh lý của các chủng tuyển chọn 71 3.1.7 Kết quả khảo sát khả năng tương thích giữa các chủng tuyển chọn 81 3.2 THẢO LUẬN 82 Chương 4- KẾT LUẬN- ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN 88 4.2 ĐỀ NGHỊ 89 TÀI LIỆU THAM KHẢO 90 PHỤ LỤC PL1 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AHL N- Acyl Homoserine Lactone bp base pair CFU Colony Forming Unit CMC Cacboxyl Methyl Cellulose cs Cộng sự DSM Difco Sporulation Medium ĐC Đối chứng EM Effective microorganism FAO Food and Agriculture Organization HHL N- Hexanoyl- L- Homoserine Lactone PBS Phosphate Buffer Saline OD Optical Density WHO World Health Organization vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Địa điểm và thời gian thu mẫu 31 Bảng 3.1: Kết quả thử nghiệm khả năng sinh hemolysin 58 Bảng 3.2: Kết quả thử nghiệm khả năng sinh enzyme ngoại bào 61 Bảng 3.3: Kết quả định danh bằng phương pháp sinh hóa 66 Bảng 3.4: Tóm tắt kết quả định danh bằng phương pháp sinh hóa và sinh học phân tử . 67 Bảng 3.5: Kết quả đối kháng của các chủng thử nghiệm với một số chủng gây bệnh 67 Bảng 3.6: Tốc độ phân hủy phân tử HHL bởi các chủng tuyển chọn ở thời điểm 9h và 24h 69 Bảng 3.7: Log (cfu/ml) các chủng vi khuẩn thử nghiệm ở các nồng độ muối khác nhau sau 24 giờ 71 Bảng 3.8: Log( cfu/ml) các chủng vi khuẩn thử nghiệm ở các giá trị pH khác nhau sau 24 giờ 73 Bảng 3.9: Log (cfu/ml) các chủng khảo sát sau 24giờ nuôi ở các nhiệt độ 74 Bảng 3.10: Tỷ lệ sống sót (%) của các chủng khảo sát ở nồng độ muối mật khác nhau vào các thời điểm 1giờ, 2giờ, 3giờ và 6giờ 75 Bảng 3.11: Tỷ lệ sống sót (%) của các chủng khảo sát ở pH2 và pH3 theo thời gian 79 Bảng 3.12: Kết quả tương thích giữa các chủng khảo sát 81 vii DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Tỷ lệ phần trăm số lượng enzyme của các chủng khảo sát 64 Biểu đồ 3.2: Mối tương quan giữa đường kính vòng violacein và Ln[HHL] 69 Biểu đồ 3.3: Tốc độ phân hủy HHL ở thời điểm 9 giờ và 24 giờ 70 Biểu đồ 3.4: Log(cfu/ml) của các chủng thử nghiệm ở các nồng độ muối khác nhau sau 24 giờ 72 Biểu đồ 3.5: Log( cfu/ml) các chủng vi khuẩn thử nghiệm ở các giá trị pH4- pH10 sau 24 giờ khảo sát 73 Biểu đồ 3.6: Tỷ lệ sống sót của các chủng khảo sát theo thời gian ở nồng độ muối mật 0,5%, 1%, 2% 77 Biểu đồ 3.7: Tỷ lệ sống sót của các chủng khảo sát theo thời gian ở pH2 và pH3 80 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Mối quan hệ giữa các nhân tố gây bệnh 6 Hình 1.2: Vi khuẩn Aeromonas và cá tra bị xuất huyết do Aeromonas 6 Hình 1.3: Vi khuẩn Vibrio phát sáng trên môi trường TCBS và mang tôm sú bị đen do nhiễm Vibrio 7 Hình 1.4: Vi khuẩn E.ictaluri và cá tra bị bệnh do nhiễm Edwardsiella 8 Hình 1.5: Sơ đồ các phương pháp bẻ gãy quá trình quorum sensing ở vi khuẩn 25 Hình 1.6: Sự phân hủy phân tử AHL bằng enzyme 26 Hình 1.7: Mặt cắt ngang của bào tử Bacillus 29 Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 36 Hình 2.2. Dụng cụ thu mẫu nước và bùn của ao nuôi cá tra 37 Hình 2.3: Bảng đặc tính sinh hóa của một số chủng Bacillus 43 Hình 2.4: Phương pháp cấy vạch thẳng vuông góc 49 Hình 3.1: Sự đa dạng khuẩn lạc từ mẫu phân lập trên môi trường DSM 57 Hình 3.2:Hình dạng khuẩn lạc trên môi trường DSM 57 Hình 3.3: Tế bào tạo nội bào tử và tế bào sinh dưỡng 58 Hình 3.4: Kết quả kiểm tra enzyme catalase: catalase dương tính, catalase âm tính 58 Hình 3.5: Kết quả thử khả năng sinh hemolysin 61 Hình 3.6: Thử nghiệm khả năng sinh enzyme ngoại bào 65 Hình 3.7: Chủng N3.19.2 đối kháng với V.alginolyticus 68 Hình 3.8: Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen aiiA của chủng N3.19.2 68 Hình 3.9: Đường kính vòng violacein ở nghiệm thức đối chứng ở các thời điểm 0 giờ, 9 giờ và 24 giờ 70 Hình 3.10: Vòng violacein của chủng N3.10.1 ở thời điểm 9h và 24h 71 ix [...]... trò của probiotic trong nuôi trồng thủy sản Khi đưa probiotic vào môi trường nước ao, các vi sinh vật sẻ sinh sôi và phát triển rất nhanh trong môi trường nước Sự hoạt động của các vi sinh vật có lợi sẽ có các tác dụng sau đây trong các ao hồ nuôi thủy sản: Phân hủy các chất hữu cơ trong nước, hấp thu xác tảo chết và làm giảm sự gia tăng của lớp bùn đáy Giảm các độc tố trong môi trường nước (do các chất... rằng các chủng Pseudomonas sp, Vibrios sp, Aeromonas sp và nhóm Coryneform phân lập từ các trại ấp trứng cá hồi có hoạt tính kháng virus IHHNV (infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus) Direkbusarakom và cs (1998) phân ập được hai l chủng Vibrio spp NICA 1030 và 20 NICA 1031 có hoạt tính kháng IHHNV và Oncorhynchus masou virus (OMV) với tỷ lệ giảm mật độ hai loại virus trên lần lượt từ. .. nước Các chủng gram dương có khả năng chuyển đổi các hợp chất hữu cơ thành CO2 tốt hơn các chủng gram âm Có báo cáo cho r ng việc sử ằ dụng các chủng Bacillus sp cải thiện chất lượng nước, tăng khả năng sống và tăng tốc độ phát triển của tôm sú Penaeus monodon và làm giảm tác nhân gây bệnh Vibrio Việc xử lý nước nuôi thủy sản bằng probiotic đã cho thấy tác dụng giảm được chất hữu cơ trong nước ao nuôi. .. trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, tôi thực hiện đề tài Phân lập các chủng Bacillus spp có hoạt tính probiotic từ ao nuôi cá tra 3 TỔNG QUAN VỀ BỆNH TRÊN ĐỘNG VẬT THỦY SẢN VÀ CÁC TÁC 1.1 ĐỘNG TIÊU CỰC CỦA VIỆC DÙNG THUỐC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 1.1.1 Tình trạng ô nhiễm môi trường nước trong nuôi trồng thủy sản Ước tính mỗi năm, ngành nuôi trồng thủy trên toàn thế giớ i đã thải ra môi trường nước xấp... cách sản ủa sinh các enzyme ngo bào như protease, lipase, đồng thời cung cấp các nhân tố dinh ại dưỡng cần thiết Những nghiên cứu tương tự cho thấy hệ vi sinh vật khu trú ở tôm Penaeus chinensis bổ sung nguồn enzyme tiêu hóa và các hợp chất đồng hóa tương tự như ở động vật [52], [89], [103], [112] Cải thiện chất lượng nước 1.2.3.5 Việc bổ sung các chủng probiotic đặc biệt là các chủng Bacillus sp có. .. Nam, tuy nhiên các chế phẩm này chủ yếu có nguồn gốc ngoại nhập hoặc sản xuất trong nước, đa số chưa rõ nguồn gốc, các chủng được sử dụng làm 2 probiotic ch yếu thuộc nhóm Bacillus sp., Lactobacillus sp., Nitrosomonas sp., ủ Saccharomyces, Nitrobacter sp [11] Trong số các nhóm vi sinh vật nói trên thì Bacillus là một ứng viên quan trọng cho việc sản xuất probiotic vì nhóm này có các đặc tính như: c ó... khuẩn ở cá nước ấm, đặc biệt là cá da trơn E ictaluri gây bệnh nhiễm khuẩn trong các cơ quan nội tạng như gan, thận, tụy của cá không vảy , gây b ệnh nhiễm trùng đường ruột trên cá da trơn ở Mỹ , là tác nhân gây bệnh gan thận mũ trên cá tra ở Việt Nam Edwardsiella thường gây bệnh ở động vật máu lạnh: rắn, cá sấu, cá và một số động vật thủy sản khác Bệnh gây thiệt hại trong các ao nuôi cá hương (cỡ từ 4-6cm)... tố quan trọng của probiotic để làm giảm tính gây độc trong suốt quá trình nhiễm bệnh Các ch ủng probiotic phải có đặc tính kháng lại vi khuẩn gây bệnh ở điều kiện in vitro lẫn in vivo thông qua một số cơ chế khác nhau Đa số các nghiên cứu về probiotic đã được công bố trong thập niên qua, trong đó có nhiều nghiên cứu giải thích cơ chế tác động của probiotic Nhìn chung, probiotic có các cơ chế tác động... lạnh  Nhóm 2: Bao g ồm các loài Aeromonas di đ ộng, bao gồm A.hydrophila, A.caviae, A.sorbia, di động nhờ tiên mao C ác loài vi khuẩn Aeromonas di động đều phân lập từ cá nước ngọt nhiễm bệnh, thường gặp nhất là loài A.hydrophila Bệnh 7 nhiễm trùng do nhóm vi khuẩn Aeromonas spp. , di động thường gặp ở nhiều loại động vật thủy sản nước ngọt Ở Việt Nam các loài cá nuôi n g, bè và nuôi ao nưc ngọt l ớ... tập hợp các vi sinh vật hữu ích có trong chế phẩm EM Ngoài ra, còn có thêm một số loài vi khuẩn Bacillus spp được chọn lọc và vi khuẩn quang dưỡng, không chỉ có tác dụng cải thiện môi trường nước nuôi trồng thủy sản mà còn cạnh tranh và đối kháng với các loài vi khuẩn gây bệnh tôm -cá Mật độ tế bào vi khuẩn Bacillus spp và vi khuẩn quang dưỡng thêm vào tương ứng là 1010 và 107 CFU/ml [2] - Các nhà khoa . hiện đề tài Phân lập các chủng Bacillus spp có hoạt tính probiotic t ao nuôi cá tra . 3 1.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH TRÊN ĐỘNG VẬT THỦY SẢN VÀ CÁC TÁC ĐỘNG. TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VĂN THỊ THÚY ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP CÁC CHỦNG Bacillus spp CÓ HOẠT TÍNH PROBIOTIC TỪ AO NUÔI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) CHUYÊN NGÀNH: VI SINH. pháp phân lập 37 2.3.4 Phương pháp chọn lọc 38 2.3.5 Định danh các chủng tuyển chọn 42 iv 2.3.6 Khảo sát các đặc tính probiotic khác 48 2.3.7 Khảo sát các đặc tính sinh lý của các chủng