Phương pháp chọn lọc

2.3.4.1 Chọn lọc bước 1: Chọn lọc các chủng có khả năng là Bacillus

Do sự đa dạng của các chủng Bacillus và theo mục tiêu của đề tài là chọn lọc chủng Bacillus làm probiotic, nên trong chọn lọc bước một chúng tôi tiến hành chọn các chủng trực khuẩn, gram dương, có bào tử và catalase dương tính.

 Tiến hành nhuộm Gram các chủng đã phân lập được và quan sát bào tử dưới kính hiển vi [119].

Các bước tiến hành

- Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiế n kính, làm khô trong không khí

- Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần - Nhuộm bằng dung dịch crystal violet trong 1 phút, rửa nước, thấm

khô

- Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô - Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất

màu), rửa nước, thấm khô

- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí

Kết quả:

Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ, bào tử không bắt màu. Ở bước sàng lọc này tiến hành giữ lại những chủng gram dương và sinh bào tử.

 Thử nghiệm khả năng sinh catalase các chủng sinh bào tử [8].

Cách tiến hành:

- Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc thuần đặt lên lame kính sạch - Nhỏ một giọt H2O2 3% lên khuẩn lạc trên lam

- Đọc kết quả:

 Dương tính: có bọt khí xuất hiện tức thì (trong vòng 10 giây)

 Âm tính: không có bọt khí xuất hiện Giữ lại các khuẩn lạc có catalase dương tính.

2.3.4.2 Chọn lọc bước 2: Loại bỏ những chủng có tiềm năng gây bệnh

Đa số những chủng vi sinh có khả năng dung huyết là những chủng có tiềm năng gây bệnh trên người và động vật. T ính an toàn đối với vật chủ là tiêu chí quan trọng nhất trong các tiêu chí chọn lọc chủng vi sinh vật làm probiotic. Để loại bỏ các chủng có tiềm năng gây bệnh chúng tôi tiến hành thử nghiệm khả năng sinh hemolysin trên môi trường thạch máu có bổ sung 5% máu cừu [26], [68], [78].

Ở bước sàng lọc này sẽ loại bỏ những chủng có khả năng gây dung huyết α và

β, chỉ giữ lại chủng dung huyết γ (không dung huyết).

 Dung huyết α: Dung huyết không hoàn toàn , môi trường có màu hơi xanh xung quanh khuẩn lạc.

 Dung huyết β: Dung huyết hoàn toàn, môi trường trong xung quanh khuẩn lạc.

 Dung huyết γ: Không dung huyết. Cách tiến hành:

- Hoạt hóa các chủng tuyển chọn trên môi trường BHIA

- Ủ 30o

C, trong 24 giờ - Đọc kết quả.

2.3.4.3 Chọn lọc bước 3: Thử khả năng sinh các enzyme ngoại

Đối với các chủng vi sinh vật dùng làm probiotic trong thủy sản, khả năng sinh các enzyme ngoại bào là một tiêu chí chọn lọc quan trọng giúp hỗ trợ tiêu hóa cho vật chủ hoặc cải thiện môi trường sống của động vật thủy sản bằng cách phân hủy nhanh chóng thức ăn dư thừa. Các enzyme thử nghiệm là: amylase, protease, cellulase, lipase. Phương pháp tiến hành theo Trần Linh Thước (2010), Trần Thị Ánh Tuyết và cs (2010), Atlan (2004).

 Thử nghiệm amylase

Một số vi sinh vật có khả năng tiết ra enzyme ngoại bào có tác dụng phân hủy tinh bột thành các đường đơn. Phản ứng này nhận biết được khi ta nhỏ dung dịch lugol vào trong môi trường thạch nuôi cấy, nếu trong môi trường có tinh bột thì môi trường chuyển sang màu xanh đậm, ngược lại thì lugol sẽ không làm chuyển màu môi trường.

Cách tiến hành:

- Hoạt hóa chủng tuyển chọn trên môi trường NA ở 30O

C trong 24 giờ

- Dùng que cấy vô trùng cấy chủng tuyển chọn trên môi trường thạch dinh dưỡng (NA) bổ sung 0,5% tinh bột tan

- Ủ ở 30o

C trong 24 giờ - Nhỏ lugol, đọc kết quả.

 Dương tính: vòng trong xung quanh khóm khuẩn lạc

 Âm tính: màu xanh đậm xung quanh khuẩn lạc

 Thử nghiệm lipase

Một số sinh vật có khả năng tiết ra các enzyme lipase phân giải dầu thực vật và một số hợp béo khác. Trong thử nghiệm lipase môi trường có CaCl2 và Tween 80. Nếu vi khuẩn có khả năng tiết ra enzyme lipase sẽ phân giải Tween 80 tạo các acid béo tự

do, các acid béo này sẽ tủa khi có mặ t Ca2+

, tạo nên vùng mờ đục dưới và xung quanh khuẩn lạc.

Cách tiến hành:

- Hoạt hóa chủng tuyển chọn trên môi trường NA ở 30o

C, 24 giờ

- Dùng que cấy vô cấy chủng tuyể n chọn vào môi trường NA bổ sung CaCl2 (100ppm)và Tween 80 (10ml/l)

- Ủ 30o

C, trong 24 giờ - Đọc kết quả.

 Dương tính: tủa mờ đục xung quanh khóm khuẩn lạc

 Âm tính: không có tủa mờ đục xung quanh khuẩn lạc

 Thử nghiệm Protease: thử nghiệm khả năng thủy phân casein và gelatin

Thử nghiệm 2 enzyme trong nhóm protease là gelatinase và caseinase.

 Đối với những sinh vật có nhóm enzyme gelatinase thì nó sẽ phân hủy được gelatine tạo vòng trong xung quanh khóm khuẩn lạc khi có mặt dung dịch TCA.

Cách tiến hành:

- Môi trường NA bổ sung 1% gelatine

- Hoạt hóa chủng tuyển chọn trên môi trường NA ở 30o

C trong 24 giờ

- Dùng que cấy vô cấy chủng tuyể n chọn vào môi trường NA bổ sung 1% gelatine

- Ủ 30o

C, trong 24 giờ

- Nhỏ TCA 25% ( Trichloric Acetic Acid 25%) , xem kết quả

 Dương tính: xuất hiện vòng trong xung quanh khóm khuẩn lạc

 Âm tính: không xuất hiện vòng trong xung quanh khuẩn lạc.

 Môi trường có casein sẽ có màu trắng đục, vi khuẩn tiết enzyme caseinase sẽ tạo vùng phân giải xung quanh khuẩn lạc.

- Hoạt hóa chủng tuyển chọn trên môi trường NA ở 30o

C, 24 giờ

- Dùng que cấy vô trùng cấy chủng tuyển chọn vào môi trường Skim milk Agar (1% skim milk)

- Ủ 30o

C, 24 giờ, đọc kết quả.

 Dương tính: Xuất hiện vòng trong xung quanh khuẩn lạc

 Âm tính: Xung quanh khuản lạc có màu trắng đục

 Thử nghiệm cellulase

Chủng kiểm tra được nuôi trên môi trường có bổ sung CMC 1% (Carbonyl methyl cellulose), những vi khuẩn có enzyme cellulase sẽ phân giải CMC và sau khi nhuộm với lugol sẽ tạo được các vòng trong xung quanh khuẩn lạc.

Cách tiến hành:

- Hoạt hóa chủng tuyển chọn trên môi trường NA ở 30o

C, 24 giờ

- Dùng que cấy vô trùng cấy chủng tuyển chọn vào môi trường NA bổ sung CMC 1%

- Ủ 30o

C, trong 24 giờ - Nhỏ lugol, đọc kết quả.

 Dương tính: vòng trong xung quanh khóm khuẩn lạc

 Âm tính: màu xanh đậm xung quanh khuẩn lạc

2.3.5 Định danh chủng tuyển chọn

2.3.5.1 Định danh các chủng tuyển chọn bằng phương pháp sinh hóa cơ bản

Thực hiện một số phản ứng sinh hóa cơ bản và tra theo khóa phân loại của Cowan và Steel (1993). Nguyên tắc và cách thực hiện được tiến hành theo Lê Đình Hùng (1997) và Trần Linh Thước (2010).

Ghi chú: T: bào tử cuối V: Bào tử đầu X: bào tử oval Y: Bào tử tròn

Hình 2.3: Bảng đặc tính sinh hóa của một số chủng Bacillus [33].  Phản ứng lên men một số loại đường

Nguyên tắc: Thử nghiệm này nhằm xác định khả năng sử dụng một nguồn cacbon nhất định để tăng trưởng. Khi sử dụng các nguồn cacbon để lên men, tùy theo phương thức lên men các sản phẩm tạo ra sẽ khác nhau bao gồm: rượu, các acid hữu cơ, CO2,.... Trong tất cả các trường hợp khả năng lên men đều làm giảm pH của môi trường. Do vậy, khả năng lên men được đánh giá khả năng thay đổi màu chỉ thị do pH giảm, khí CO2 tạo thành được giữ lại trong các ống Durham.

Tiến hành:

 Hoạt hóa các chủng tuyển chọn trong môi trường BHIA

 Dùng que cấy vô trùng chấm khuẩn lạc cấy vào môi trường thử nghiệm bổ sung 1% đường và 1,5% chỉ thị phenol red

 Đọc kết quả sau khi ủ ở 30o

C trong 24 giờ.

 Dương tính: môi trường chuyển sang màu vàng.

 Âm tính: môi trường giữ nguyên màu đỏ.

 Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate

Nguyên tắc: Một số sinh vật có khả năng sử dụng citrate như nguồn cacbon duy nhất để lấy năng lượng và vật chất. Sự biến dưỡng citrate thường thông qua sự kết hợp với acetyl CoA thành oxaloacetate để lấy vào chu trình Krebs. Sự biến dưỡng citrate bởi sinh vật thường làm kiềm hóa môi trường, mặt khác mọi sinh vật có khả năng sử dụng citrate thường dùng ammonium làm nguồn đạm duy nhất. Sự phân giải muối ammonium sinh NH3 làm kiềm hóa môi trường, làm chuyển màu chỉ thị.

Tiến hành:

 Chuẩn bị môi trường Simmons Citrate Agar chỉ thị là bromophenol blue

 Hoạt hóa chủng tuyển chọn trên môi trường BHIA

 Dùng que cấy vô trùng chấm khuẩn lạc vào môi trường thử nghiệm

 Đọc kết quả sau 24 giờ

 Dương tính: môi trường chuyển sang màu xanh dương

 Âm tính: môi trường giữ nguyên màu xanh lục.

 Thử nghiệm khả năng sinh indole

Nguyên tắc: Xác địnhh khả năng sinh indole từ tryptophan.

Một số vi sinh vật có enzyme tryptophanase có thể oxy hóa tryptophan tạo nên sản phẩm biến dưỡng có chứa gốc indole. Để nhận biết enzyme này người ta sử dụng thuốc thử p- dimethylaminobenzaldehyde (p-DMABA), nhân pyrrol của indole có chứa nhóm CH2 kết hợp với nhân benzen tạo nên một phức chất có màu đỏ tía.

Cách thực hiện:

 Chuẩn bị môi trường nước pepton, 5ml/ ống nghiệm, hấp khử trùng 1210

C, 15 phút.

 Lấy khuẩn lạc từ môi trường BHIA đã ủ từ 18- 24 giờ cho vào môi trường thử nghiệm.

 Nhỏ 5 giọt thuốc thử vào ống nghiệm đã cấy và ủ 24 giờ. Kết quả:

 Dương tính: Màu đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trường

 Âm tính: Bề mặt môi trường giữ nguyên màu vàng của thuốc thử.

 Thử nghiệm VP (Voges Proskauer)

Nguyên tắc: Nhằm xác định khả năng của một số sinh vật tạo sản phẩm cuối trung tính là acetoin do lên men glucose. Glucose được chuyển hóa thành acid pyruvic, vi sinh vật có thể biến đổi acid này theo nhiều con đường khác nhau, và sự tạo thành acetoin là một trong những con đường biến đổi xảy ra ở vi sinh vật. Phản ứng này được nhận biết nhờ thuốc thử α-naphtol và KOH 40%. Thuốc thử này biến đổi acetoin thành diacetyl, diacetyl lại kết hợp với nhân Guanidine của argine có trong pepton kết tụ thành phức diacety-pepton có màu đỏ.

Cách thực hiện:

 Chuẩn bị môi trường Clark- Lubs, pH 6,9

 Rót vào ống nghiệm 5ml/ ống, hấp khử trùng 121o

C, 15 phút

 Lấy khuẩn lạc từ môi trường BHIA đã ủ từ 18- 24 giờ cho vào môi trường thử nghiệm.

 Ủ 30o

C, trong 24 giờ.

Nhỏ thuốc thử trực tiếp vào môi trường trước khi đọc kết quả. Nhỏ dung dịch theo đúng trình tự: 6 giọt dung dịch VP1, tiếp theo nhỏ giọt VP2. Để yên đọc kết quả sau 15 phút.

 Dương tính: Màu đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trường.

 Âm tính: Bề mặt môi trường giữ nguyên màu của thuốc thử.

Nguyên tắc: Thử nghiệm này nhằm xác định sự hiện diện của hệ enzyme oxidase ở hệ sinh vật. Hoạt tính oxydase được phát hiện nhờ thuốc thử p- phenylenediamine. Khi có sự hiện diện của cytochrom C, thuốc thử này bị oxy hóa thành indolphenol có màu xanh dương.

Cách thực hiện:

 Hoạt hóa Vi khuẩn thử nghiệm trên môi trường BHIA

 Sử dụng test kit oxidase được cung cấp bởi công ty Nam Khoa

 Dùng que cấy nhựa vô trùng lấy sinh khối từ đĩa thạch chuyển vào đĩa giấy oxidase

 Đọc kết quả sau 1- 3 phút.

 Dương tính: Đĩa giấy chuyển sang màu tím

 Âm tính: Không chuyển màu đĩa giấy

 Thử nghiệm khả năng thủy phân tinh bột và casein

Nguyên tắc và cách thực hiện như đã trình bày ở phần 2.3.4.1 và 2.3.4.3

 Thử nghiệm khả năng di động

Nguyên tắc: Xác định xem vi sinh vật có khả năng di động hay không.

Vi sinh vật di động nhờ các lông (tiên mao, chu mao...). Lôn g thường có ở vi khuẩn hình que. Vi khuẩn di động thường có một hoặc nhiều lông, vị trí lông cũng thay đổi tùy theo loài và điều kiện nuôi cấy.

Cách thực hiện:

 Chuẩn bị môi trường thạch mềm với hàm lượng agar khoảng từ 4-5 g/l

 Rót môi trường vào ống nghiệm (5ml/ ống), hấp khử trùng 121o

C, 15 phút

 Dùng kim cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường BHI đã ủ từ 18 -24 giờ cấy đâm xuyên vào tâm môi trường trong ống nghiệm tới độ sâu khoảng 2cm

 Ủ 30o

C, 24 giờ. Đọc kết quả:

 Di động: Vi sinh vật rời khỏi đường cấy, phân tán vào môi trường và làm đục môi trường.

 Không di động: Vi sinh vật chỉ phát triển dọc theo đường cấy.

 Thử nghiệ khả năng phân giải Nitrate

Nguyên tắc: Một số vi khuẩn có khả năng sử dụng nitrate làm nguồn nitơ do có hệ enzyme nitate reductase. Nitrate bị khử thành nitrite, nitrite phản ứng với với sulphailamide và N- aphtylethlenediamine hydrocloride ở pH acid cho hợp chất màu hồng.

Cách thực hiện:

- Hoạt hóa chủng thử nghiệm trong môi trường BHIA ủ 30O

C/ 24 giờ - Cấy vi khuẩn vào môi trường nitrate

- Ủ 30O

C/ 24 giờ. Nhỏ thuốc thử Gress A và Gress B. Đọc kết quả

 Dương tính: Màu hồng xuất hiện trong ống dịch nuôi cấy.

 Âm tính: không có sự chuyển màu của môi trường

 Thử nghiệm ONPG

Nguyên tắc: Thử nghiệm này nhằm xác định sự hiện diện của hệ enzyme ß - galactosidase, enzyme này phân cắt cơ chất o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) thành o-nitrophenol có màu vàng.

Cách thực hiện:

- Chuẩn bị môi trường có chứa 0,6% ONPG trong dung dịch Na2HPO4 1mM - Lấy khuẩn lạc từ môi trường BHIA cho vào các ống nghiệm có chứa ONPG - Ủ 30O

C, 24 giờ. Đọc kết quả

 Dương tính: Màu vàng trong ống dịch nuôi cấy.

 Âm tính: không có sự chuyển màu của môi trường

2.3.5.2 Định danh các chủng đã chọn lọc bằng phương pháp sinh học phân tử

Gồm các bước sau:

 Tách chiết DNA các chủng vi khuẩn Bacillus [1]

- Hút 100 μl dịch khuẩn cho vào eppendorf c ho thêm 900μl Trizol + 200 μl chloroform, để 5 phút, vortex kỹ

- Ly tâm 13000v/p, 10 phút

- Thu dịch nổi, thêm một thể tích isopropanol lạnh, ủ -200

C trong 1 giờ - Ly tâm 13000v/p, 10 phút, loại bỏ dịch nổi

- Thêm vào 1ml etanol 70%

- Ly tâm 13000v/p, 5 phút, loại bỏ dịch nổi, để khô - Hòa tan cặn trong 20μl nước, giữ lạnh.

 Khuếch đại trình tự 16S rDNA [63]

Cặp mồi được sử dụng theo như Kim và cs (2010) có trình tự như sau: Mồi xuôi (27F): 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

Mồi ngược (1492R): 5’- GGCTACCTTGTTACGACTT-3’

Quy trình khuếch đại 16S rDNA ngắn gọn như sau: 2µl dịch ly trích DNA từ vi khuẩn Bacillussử dụng làm bản mẫu được thêm vào thành phần 50µl PCR master mix 1X (Promega, Mỹ) có chứa 30pmol mỗi mồi. Quá trình khuếch đại được thực hiện theo chu trình luân nhiệt : 1 chu kỳ: 950

C trong 3phút ; 35 chu kỳ: 950

C trong 30 giây, 550C trong 45 giây, 720C trong 60 giây; 1 chu kỳ: 720

C trong 10 phút.

 Giải trình tự 16S rDNA  Định danh chủng sàng lọc: Các mẫu trình tự sau khi khuếch đại được giải sẽ được tiến hành so sánh bởi chương trình NCBI Blast với các trình tự DNA sẵn có trên Genbank. Kết quả được chọn là kết quả có trị số E value thấp nhất và Max ident cao nhất.

2.3.6 Khảo sát các đặc tính probiotic khác

2.3.6.1 Khảo sát khả năng đối kháng với các chủng gây bệnh [28]

Khả năng đối kháng hoặc tiêu diệt chủng vi sinh vật gây bệnh cho vật chủ là một trong những tiêu chí quan trọng của chủng vi sinh được chọn làm probiotic. Hiện