2.3.6.1 Khảo sát khả năng đối kháng với các chủng gây bệnh [28]
Khả năng đối kháng hoặc tiêu diệt chủng vi sinh vật gây bệnh cho vật chủ là một trong những tiêu chí quan trọng của chủng vi sinh được chọn làm probiotic. Hiện nay các loài vi sinh vật gây bệnh quan trọng trên đối tượng thủy sản bao gồm
V.paraheamolyticus, V.alginolyticus, và Aeromonas hydrophila. Do đó thử nghiệm khả năng đối kháng với các chủng này sẽ được thực hiện.
Phương pháp thực hiện: Sử dụng phương pháp vạch thẳng vuông góc (Cross- streak) và phương pháp thạch khuếch tán (agar well -diffusion method) và được điều chỉnh bởi TS. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, Viện Nghiên Cứu Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II.
Phương pháp vạch thẳng vuông góc (Cross-Streak)
- Cấy vi khuẩn khảo sát thành một đường thẳng trên môi trường BHIA. Ủ ở nhiệt độ 30o
C trong 24 giờ.
- Tiếp tục cấy vi khuẩn gây bệnh theo đường vuông góc và cách đường đã cấy 1- 2mm. Tiến hành đọc kết quả sau 24 giờ và 48 giờ.
Hình 2.4: Phương pháp cấy vạch thẳng vuông góc
Phương pháp thạch khuếch tán (agar well -diffusion method)
- Dùng 50 µl dịch vi khuẩn gây bệnh để tráng trên đĩa BHIA. Sau khi tráng đĩa, lật úp đĩa trong vòng 15 phút đợi đĩa khô. Sau đó dùng ống sắt hình trụ (tiệt trùng bằng cách nhúng cồn rồi hơ lên ngọn lửa thật kỹ) khoan 3 lỗ trên mỗi đĩa thạch, dùng nhíp đã tiệt trùng gắp bỏ các khối thạch để tạo thành các giếng.
- Cấy vi khuẩn khảo sát trên BHIA, ủ ở 30O
C trong 24 giờ. Dùng ống sắt hình trụ đã tiệt trùng khoan 3 lỗ trên mỗi đĩa thạch, dùng nhíp đã tiệt trùng gắp các khối thạch bỏ vào mỗi giếng bên đĩa đã tráng vi khuẩn gây bệnh.
Đường cấy vi khuẩn khảo sát
Đường cấy vi khuẩn gây bệnh
- Đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 30OC. Sau đó tiến hành đo đường kính vòng vô khuẩn (D) (Inhibition clear zone) sau 24 giờ và 48 giờ.
Đánh giá mức độ đối kháng theo 3 mức: D ≥ 20mm: Đối kháng mạnh (+++);
20 > D ≥10mm: Đối kháng trung bình (++); D < 10mm: Đối kháng yếu (+).
2.3.6.2 Khảo sát khả năng phân hủy phân tử quorum sensing
Khảo sát sự có mặt của gen aiiA mã hóa cho enzyme lactonase
Hoạt tính phân hủy phân tử quorum sensing ở mức độ phân tử được kiểm tra thông qua sự có mặt của gene aiiA (gen mã hóa AHL lactonase) bằng phương pháp PCR. Sử dụng cặp mồi : AiiAF (5’-ATGACAGTAAAGAAGCTTTA-3’), AiiAR (5′- TATATATTCAGGGAACACTT-3′). Quy trình khuếch đại gene aiiA ngắn gọn như sau: 2µl dịch ly trích DNA từ vi khuẩn Bacillussử dụng làm bản mẫu được thêm vào thành phần 50µl PCR master mix 1X (Promega, Mỹ) có chứa 30pmol mỗi mồi AIIAF và AIIAR. Quá trình khuếch đại được thực hiện theo chu trình luân nhiệt : 1 chu kỳ: 950
C trong 3phút ; 35 chu kỳ: 950
C trong 30 giây, 550C trong 45 giây, 720C trong 60 giây; 1 chu kỳ: 720
C trong 10 phút. Sản phẩm khuếch đại được ước lượng trên gel agarose 1,5%. Sản phẩm khuếch đại có chiều dài 750 bp [19].
Khảo sát khả năng phân hủy phân tử quorum sensing ở mức độ kiểu hình
Xây dựng đường chuẩn tương quan giữa nồng độ HHL và đường kính vòng tròn sắc tố violacein
- Chủng vi khuẩn Chromobacterium violaceum CV026 lưu giữ ở -80oC được cấy chuyền sang đĩa petri chứa môi trường LB agar có bổ sung 20 ppm kanamycin. Ủ ở 30oC trong 24 giờ để tạo giống cấp 1.
- Từ giống cấp 1, chọn một khuẩn lạc cấy chuyền sang erlen chứa 10ml môi trường LB có bổ sung 20ppm kanamycin. Sau đó ủ trong tủ ấm lắc ở 30o
C trong 24 giờ để tạo giống cấp 2 (được sử dụng trong thí nghiệm).
- Từ dung dịch stock N-hexanoyl-L-homoserine lactone (HHL) ở nồng độ 2,5 mg/ml pha thành các nồng độ 10ppm, 5ppm, 2,5ppm, và 1,25ppm trong môi trường LB.
- Sử dụng 4 đĩa petri chứa LB agar. Nhỏ 50µl canh khuẩn CV026 (tương ứng với nồng độ 109 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
cfu/ml) lên mỗi đĩa. D ùng que cấy tam giác trải đều dịch khuẩn trên đĩa và để khô.
- Ở mỗi nồng độ HHL, hút 10µl dung dịch HHL nhỏ vào 3 vị trí trên đĩa LB agar đã trang sẵn dịch khuẩn CV026. Để trong tủ cấy vô trùng cho đến khi khô, ủ trong 24 giờ ở nhiệt độ 30o
C.
- Sau khi ủ trong 24 giờ, trên đĩa xuất hiện 3 vòng tròn sắc tố violacein tương ứng tại 3 vị trí đã nhỏ dung dịch HHL. Tiến hành đo đường kính của các vòng tròn này, và xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa ln[HHL] và đường kính đường tròn sắc tố violacein (cm) (lấy giá trị trung bình của 3 giá trị đo được) [27].
Khảo sát khả năng phân hủy phân tử HHL
- Cấy giống vi khuẩn Chromobacterium violaceum CV026 trên môi trường LB bổ sung 20ppm kanamycin
- Các chủng vi khuẩn tuyển chọn được bảo quản ở – 80oC, được cấy chuyền sang đĩa LB agar và ủ ở 30o
C trong 48 giờ để tạo giống cấp 1.
- Chọn một khuẩn lạc trên đĩa LB agar (đối với mỗi chủng), cấy chuyền sang các erlen chứa 10ml dung dịch LB, ủ trong 24 giờ để tạo giống cấp 2.
- Từ các giống cấp 2 này, tiến hành pha loãng và đo mật độ quang ở bước sóng 600nm (OD600).
- Mật độ vi khuẩn Bacillus được xác định theo công thức: 5 x 108
x OD600 (cfu/ml) (công thức Mc Fahrland) [125].
- Từ mật độ vi khuẩn xác định được, tính toán thể tích cần thiết cấy vào các erlen chứa 10ml dung dịch LB để đạt mật độ 106
cfu/ml.
- Bổ sung vào mỗi erlen 5ppm dung dịch HHL. Sử dụng một erlen đối chứng, chỉ chứa HHL mà không bổ sung vi khuẩn. Tất cả erlen được đặt trong tủ ấm lắc ở tốc độ 120 vòng/phút trong 24 giờ.
- Tiến hành thu mẫu ở các thời điểm 9 giờ và 24 giờ.
- Tại mỗi thời điểm thu mẫu, hút 1ml dịch khuẩn cho vào các eppendorf vô trùng. Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 20 phút. Sau đó lấy 3 x 10µl dịch nổi nhỏ lên bề mặt đĩa LB agar đã tráng sẵn 50µl dịch vi khuẩn CV026 đã chuẩn bị trước đó 24giờ. Sau đó ủ ở 30o
C trong 24 giờ.
- Sau thời gian ủ, đo đường kính các vòng tròn violacein và dựa vào đường chuẩn đã thiết lập để tính toán tốc độ phân hủy và nồng độ HHL còn lại trong môi trường. Tốc độ phân hủy HHL theo thời gian được tính theo công thức:
Tốc độ phân hủy HHL ở thời điểm 9 giờ:
={([HHL]0h- [HHL]9h)-([HHL]ĐC 0h- [HHL]ĐC 9h)}/9 = ([HHL]ĐC 9h-[HHL] 9h)/9
Tương tự tốc độ phân hủy HHL lúc 24 giờ được tính theo công thức: = ([HHL]ĐC 24h- [HHL]24h)/24 [99].
2.3.7 Khảo sát các đặc tính sinh lý của các chủng tuyển chọn2.3.7.1 Khảo sát khả năng chịu pH, nhiệt độ và nồng độ muối