1.2.5.1 Tình hình nghiên cứu probiotic trên thế giới
Có nhiều nghiên cứu về probiotic đã được công bố trong nhiều thập niên qua. Khởi đầu các nghiên cứu đầu thập niên 80 tập trung vào các nghiên cứu sử dụng probiotic cho đối tượng con giống và cá thương phẩm trong khi các nghiên cứu ứng dụng cho đối tượng ấu trùng bắt đầu trễ hơn vào khoảng thập niên 90. Tuy nhiên đa số các nghiên cứu ở giai đoạn này tập trung vào ảnh hưởng về mặt dinh dưỡng của probiotic lên vật chủ như các nghiên cứu của Brown và cs (1996), Ringø và cs (1995), Sakata (1990).
Các nhóm tác giả Gatesoupe (1994, 1997), Gildberg và cs (1997) đã chứng minh được ảnh hưởng của probiotic lên khả năng kháng bệnh của cá bột và cá giống. Austin (2006), Nikoskelainen và cs (2003), Sakai và cs (1995) chứng minh khả năng kích thích miễn dịch của probiotic. Các nghiên cứu của Gildberg và cs (1995), Kelly và cs (2007), Nikoskelainen (2006) đã chứng minh tăng cường khả năng bám dính và hình thành khuẩn lạc trong ruột.
1.2.5.2 Tình hình nghiên cứu probiotic ở Việt Nam
Trong những năm gần đây, để giảm thiểu những bất lợi do sử dụng hóa chất trong nuôi trồng thủy sản, việc nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm sinh học để phòng bệnh và cải thiện môi trường trong nuôi trồng thủy sản ở nước ta đang phát triển mạnh. Theo thống kê của Cục Bảo vệ nguồn lợi thủy sản, hiện có khoảng trên 400 thương hiệu chế phẩm sinh học và vitamin đang bán trên thị trường nước ta. Đa số các chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ nhiều nước: Mỹ, Ấn Độ, Trung Quốc…. được bán với giá cao. Trong những năm gần đây, các nhà khoa học Việt Nam bắt đầu nghiên cứu
“nội địa hóa” chế phẩm sinh học ứng dụng trong thủy sản nhằm hạ giá thành, giúp giảm chi phí sản xuất, nâng cao lợi nhuận cho người nông dân [2], [11]. Có thể kể đến các nghiên cứu sau:
- Võ Thị Hạnh và cs thuộc Viện Sinh học nhiệt đới Tp HCM nghiên cứu và tạo chế phẩm BIO II có tác dụng: phân hủy những thức ăn thừa và các khí thải ở đáy ao, ổn định pH và màu nước ao, kìm hãm sự tăng trưởng của các vi sinh vật gây bệnh cho tôm, cá như nhóm vi khuẩn Vibrio spp, tăng năng suất nuôi trồng.
- Chế phẩm EM (Effective microorganism) được giáo sư Teruo Higa-Nhật Bản phát minh năm 1980, được ứng dụng trong các lĩnh vực nông-ngư nghiệp trên thế giới. Tuy nhiên, chế phẩm EM ở dạng lỏng được nhân giống từ EM gốc của Nhật Bản với mật độ tế bào vi sinh vật có lợi cho nuôi trồng thủy sản thấp (< 107
cfu/ml) nên hiệu qủa sử dụng không cao. Để góp phần hoàn thiện và nâng cao hiệu quả chế phẩm EM, nhờ sự hỗ trợ kinh phí của Sở Khoa học và Công nghệ Tp.HCM, phòng Vi sinh ứng dụng - Viện Sinh học Nhiệt đới đã nghiên cứu sản xuất ra chế phẩm VEM sử dụng bổ sung với chế phẩm BioII. Chế phẩm VEM (Vietnamese effective microorganisms) gồm tập hợp các vi sinh vật hữu ích có trong chế phẩm EM. Ngoài ra, còn có thêm một số loài vi khuẩn Bacillus spp. được chọn lọc và vi khuẩn quang dưỡng, không chỉ có tác dụng cải thiện môi trường nước nuôi trồng thủy sản mà còn cạnh tranh và đối kháng với các loài vi khuẩn gây bệnh tôm-cá. Mật độ tế bào vi khuẩn Bacillus spp. và vi khuẩn quang dưỡng thêm vào tương ứng là 1010
và 107 CFU/ml [2].
- Các nhà khoa học thuộc Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên (Viện KH&CN Việt Nam) đã nghiên cứu thành công quy trình sản xuất chế phẩm sinh học đa năng Hudavil - HUD 5 với thành phần Bacillus subtilis, Nitrosomonas sp, Nitrobacter sp,
Thiobacter thioparus với mật độ 108
cfu/ml để xử lý môi trường ở các hồ nuôi thủy sản, đặc biệt là hồ nuôi tôm sú, cá tra [13].
- Võ Thị Thứ và cs với chế phẩm sinh học Biochie bao gồm một số chủng thuộc chi Bacillus (B.subtilis, B. megaterium, B.licheniformis) và Lactobacillus (L.
acidophilus). Chúng có chức năng phân hủy hợp chất hữu cơ thải ra từ thức ăn thừa và chất thải nhờ khả năng tổng hợp enzym phân hủy hữu cơ như protease, amylase. Chúng còn có khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn làm giảm số lượng vi sinh vật gây bệnh phát triển quá mức như Vibrio, Aeromonas…. do chất lượng nước nuôi bị giảm. Sử dụng chế phẩm sinh học Biochie để xử lý nước nuôi tôm cá có tác dụng làm giảm lượng bùn hữu cơ, giảm chu kỳ thay nước và cải thiện môi trường (tăng oxi hòa tan, giảm COD, BOD). Ngoài ra, còn có tác dụng giảm tỷ lệ chết, tỷ lệ còi cọc, tăng sản lượng [13].
- Ts. Nguyễn Hữu Phúc, Viện Sinh học Nhiệt đới Tp.HCM đã nghiên cứu chế tạo thành công hai chế phẩm sinh học để nuôi tôm. Hai chế phẩm này có tên là Probact dùng để trộn vào thức ăn của tôm, và Ecobact dùng để xử lý môi trường nước trong ao nuôi tôm. Hai chế phẩm sinh học này có tác dụng giảm thiểu vi sinh vật gây bệnh cho tôm, cải thiện chất lượng nước và bùn trong các ao nuôi tôm. Hai chế phẩm này đã được sử dụng thử nghiệm tại một số hộ nông dân ở huyện Cần Giờ, Nhà Bè, các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long, cho kết quả khá tốt. Tôm ít bị bệnh, tăng trưởng tốt, năng suất thu hoạch tăng từ 30-45% [13].
1.3 BẺ GÃY QUÁ TRÌNH QUORUM SENSING – CÁCH TIẾP CẬN MỚI TRONG VIỆC KIỂM SOÁT HỆ VI SINH TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 1.3.1 Định nghĩa quá trình quorum sensing
Vi khuẩn có thể giao tiếp với nhau sử dụng các phân tử tín hiệu hóa học. Chúng tiết ra, tiếp nhận và phản ứng đối với sự tích lũy của những phân tử tín hiệu này. Việc phát hiện các phân tử tín hiệu trong môi trường cho phép vi khuẩn phân biệt giữa các quần thể vi khuẩn mật độ thấp và mật độ cao, và kiểm soát việc biểu hiện gen đối với sự thay đổi về mật độ tế bào. Quá trình này được gọi là quorum sensing. Nhiều kiểu hình ở vi khuẩn được điều khiển bởi quorum sensing, bao gồm độc lực, sự sản xuất kháng sinh, sự tạo thành màng sinh học …. [94].
Trong thế giới vi sinh vật tồn tại cả hai loại ngôn ngữ quorum sensing, ngôn ngữ phổ biến và ngôn ngữ đặc hiệu, cho phép vi khuẩn giao tiếp trong cùng một loài và giữa các loài. Quá trình quorum sensing ở vi khuẩn Gram âm được điều khiển bởi phân tử tín hiệu N-acyl homoserine lactone (AHL). Ở vi khuẩn Gram dương, quá trình quorum sensing được điều khiển bởi các phân tử oligopeptide có chiều dài 5 đến 17 amino acid [46], [72].
Quá trình giao tiếp thông qua hệ thống tín hiệu LuxI/LuxR được xem như là cơ chế chuẩn được các vi khuẩn Gram âm sử dụng để thông tin liên lạc với nhau. Hệ thống quorum sensing kiểu này được sử dụng để kiểm soát việc biểu hiện gen ở trên 25 loài vi khuẩn Gram âm [22], [73]. Trong mọi trường hợp, AHL là một loại phân tử tín hiệu mà việc tổng hợp phụ thuộc vào protein kiểu LuxI. Một protein khác (protein kiểu LuxR) chịu trách nhiệm việc nhận biết phân tử tín hiệu AHL và sau đó là quá trình hoạt hóa việc phiên mã của một số gen đích. Phân tử tín hiệu AHL đã được chứng minh là có liên quan đến quá trình quorum sensing ở nhiều tác nhâ n gây bệnh ở người và thực vật, như Pseudomonas aeruginosa [91], Erwinia carotovora, Agrobacterium tumefaciens [111], cũng như ở Vibrio harveyi [70] và những loài vi khuẩn gây bệnh khác trong nuôi trồng thủy sản [25].
1.3.2 Bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh – phương pháp tiếp cận mới trong việc kiểm soát bệnh tiếp cận mới trong việc kiểm soát bệnh
Có hai chiến lược chủ yếu trong việc kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn, hoặc giết chết vi khuẩn gây bệnh, hoặc làm suy giảm độc lực của nó để sau đó mầm bệnh không thể thích nghi với môi trường bên trong vật chủ hoặc dễ dàng bị đào thải bởi hệ miễn dịch tự nhiên của vật chủ. Việc phát hiện ra hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn, có chức năng gắn liền với việc sản xuất ra các hợp chất trao đổi chất thứ cấp và những yếu tố liên quan đến độc lực, là tiền đề cho cách tiếp cận thứ hai [44].
Việc bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh đã được đề nghị như là cách tiếp cận mới trong việc kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn. Một số phương pháp bẻ gãy hệ thống quorum sensing đã được nghiên cứu, bao gồm (Hình 1.5):
(1) Ức chế quá trình sinh tổng hợp phân tử tín hiệu quorum sensing; (2) Ứng dụng các hợp chất đối kháng quorum sensing;
(3) Ức chế bằng hóa học đối với phân tử tín hiệu quorum sensing; (4) Phân hủy sinh học bằng các enzyme của vi khuẩn.
Một số báo cáo liên quan đến việc bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở các vi khuẩn gây bệnh trong môi trường nước, cùng với những kết quả đạt được đối với vi khuẩn gây bệnh ở người và thực vật, chỉ ra rằng phương pháp tiếp cận mới này có nhiều tiềm năng trong việc kiểm soát bệnh trong nuôi trồng thủy sản[35].
Hình 1.5: Sơ đồ các phương pháp bẻ gãy quá trình quorum sensing ở vi khuẩn [35]
1.2.3 Sự phân hủy sinh học quá trình quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh
Khả năng phân hủy phân tử AHL phân bố rộng rãi trong giới vi khuẩn. Những enzyme có thể ức chế phân tử AHL đã được khám phá ở các loài vi khuẩn thuộc nhóm
Phân tử tín hiệu
Đáp ứng điều hòa
Gen mục tiêu Gen mục tiêu Độc tố
ß-Proteobacteria [114], α-Proteobacteria và γ -Proteobacteria [101] cũng như ở một số loài thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương [25], [39]. Những loài vi khuẩn này có thể khóa hệ thống quorum sensing của những loài vi khuẩn cạnh tranh để đạt được ưu thế chọn lọc. Quá trình bẻ gãy các phân tử tín hiệu AHL có thể được xúc tác bởi hai l oại enzyme: AHL-acylase và AHL-lactonase.
Enzyme AHL-acylase có khả năng bẻ gãy mạch cacbon của phân hủy AHL thành acid béo và homoserine lactone, tuy nhiên không làm thay đổi nhiều đến cấu trúc của phân tử AHL [38], [65], [106]. Trong khi đó enzyme AHL-lactonase, điều khiển bởi gen aiiA, có khả năng phân hủy phân tử AHL bằng cách xúc tác phản ứng mở vòng lactone. Điều này dẫn đến sự thay đổi về cấu trúc hình thể tương đối của phân tử AHL, gây trở ngại cho việc gắn kết của phân tử AHL với protein điều tiết việc phiên mã LuxR, vì vậy một số kiểu hình (trong đó có yếu tố độc lực ở vi khuẩn gây bệnh) không thể được biểu hiện. Gen aiiA đầu tiên được tìm thấy ở chủng vi khuẩn Bacillus sp 240B1 [37]. Các dạng tương đồng của gen aiiA sau đó được tìm thấy ở nhiều loài
Bacillus khác, bao gồm Bacillus thuringiensis, B. cereus, B. anthracis, B. mycoides và
B. subtilis [39], [65], [86], [100], [106]. Các gen này có độ tương đồng cao (89 – 96%) so với gen aiiA của chủng 240B1. Gần đây, Yin và cs (2010) đã phát hiện được sự có mặt gen của gen aiiA từ Bacillus amyloliquefaciens, một loài tương đồng với B.
Hình 1.6: Sự phân hủy phân tử AHL bằng enzyme[35].
subtilis. Gen này có độ tương đồng 87- 99,3% so vớ i các dạng tương đồng ở các loài
Bacillus khác, trong khi trình tự acid amin của AHL-lactonase có độ tương đồng 89,6 – 99,6%.
1.4 TỔNG QUAN VI KHUẨN Bacillus
1.4.1 Đặc điểm chung của chi Bacillus
Theo khóa phân loại của Bergey , chi Bacillusđược phân loại như sau: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus
Chi Bacillus là một chi lớn (51 loài đã được xác định chính xác và nhiều loài chưa được phân loại rõ ràng), và đa dạng, thuộc họ Bacillaecea. Họ này chia làm 5 chi gồm: Bacillus, Sporolactobacillus, Clostridium, Sporosarcina, Desulfotomaculum; đặc trưng của họ này là sự hình thành nội bào tử.
Đặc điểm của chi Bacilllus được mô tả như sau:
Tế bào hình gậy, hoặc thẳng, kích thước 0,5-2,5 x 1,2-10 μm, các tế bào thường xếp thành cặp hoặc chuỗi, đầu tròn hoặc hơi vuông. Là vi khuẩn gram dương, di động nhờ roi. Một tế bào chỉ có duy nhất một nội bào tử, nội bào tử có hình oval hoặc hình trụ, chịu được điều kiện bất lợi như nhiệt độ, acid, sự hình thành bào tử không bị ngăn cản bởi sự tiếp xúc không khí. Là vi khuẩn g ram dương hoặc chỉ cho gram dương ở giai đoạn đầu của sự phát triển, con đường biến dưỡng bằng lên men hoặc hô hấp, hầu hết có catalase dương tính. Là vi khuẩn hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi, có phổ chịu đựng pH, nhiệt độ, muối rộng, tồn tại được trong điều kiện bất lợi một thời gian dài nên đa số chúng rất phổ biến và có thể phân lập được từ nhiều nguồn khác nhau. Một số loài gây bệnh cho người như B.anthracis, B.cereus… [58].
Việc phân loại Bacillus trước đây dựa vào hai đặc tính: sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí và khả năng hình thành nội bào tử, kết quả đã phân loại nhiều vi khuẩn có đặc tính sinh lý và đặc điểm sinh học khác nhau. Tuy nhiên do sự không đồng nhất về đặc điểm sinh lý, sinh thái và di truyền học dẫn đến khó khăn cho việc phân loại chi
Bacillus. Việc ứng dụng sinh học phân tử trong phân loại cho thấy chi Bacillus có thành phần G-C khoảng 32-69%. Khi tiến hành lập cây phát sinh loài bằng trình tự 16S RNA cho thấy chi Bacillus có quan hệ gần với một số nhó m loài không sinh bào tử: như có quan hệ với Enterococcus, Lactobacillus, và Streptococcus ở mức bộ và
Listeria và Staphylococcus ở mức họ. Mặc khác, một số thành viên trước đây thuộc chi
Bacillus đã được phân loại lại và thuộc những họ mới bao gồm:
Acyclobacillaceae, Paenibacillaceae và Planococcaceae[58].
1.4.2 Dinh dưỡng và sinh trưởng
Hầu hết các loài thuộc chi Bacillus là những sinh vật hoá dị dưỡng có khả năng hô hấp khi sử dụng một số hợp chất hữu cơ đơn giản như đường, amino acid, acid hữu cơ. Trong một số trường hợp , chúng có khả năng lên men hỗn hợp cacbonhydrat tạo glycerol và butandiol. Hầu hết các loài thuộc chi Bacillus (ngoại trừ B.megaterium và một số loài khác) yêu cầu amino acid, vitamin B hoặc cả hai hợp chất trên cho sự tăng trưởng. Phần lớn, chúng là vi khuẩn ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 30- 45o
C, một số là vi khuẩn chịu nhiệt với nhiệt độ sinh trưởng tối ưu lên tới 65o C, còn lại là những vi khuẩn ưa lạnh, có thể sinh trưởng và tạo bào tử ở 0o
C. Các loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus sinh trưởng trong khoảng pH rộng từ 2-11. Trong phòng thí nghiệm, dưới điều kiện sinh trưởng tối ưu Bacillus có thời gian thế hệ khoảng 25 phút
[58], [124].
1.4.3 Quá trình tạo bào tử của Bacillus
Nội bào tử được mô tả đầu tiên bởi Cohn (1872) khi nghiên cứu về B.subtilis và sau đó đượ c Koch (1875) mô tả khi nghiên cứu về B.anthracis. Cohn đã chứng minh khả năng chịu nhiệt của bào tử B.subtilis trong khi Koch cũng đã mô tả được sự hình
thành bào tử trong B.anthracis. Do đặc điểm cấu tạo và đặc tính sinh lý nên bào tử được cho là dạng tồn tại bền vững nhất được tìm thấy trong tự nhiên của tế bào, chúng có khả năng sống sót trong điều kiện khắc nghiệt một thời gian dài, có thể hàng triệu năm.
Ở trạng thái không nhuộm màu, nội bào tử có màu đen ở mép, rất sáng và chiết quang. Cấu trúc của một bào tử gồm:
- Nang bào tử - Áo bào tử - Vỏ bào tử
- Lõi bào tử: gồm thành bào tử, màng bào tử, bào tử chất, vùng nhân
Hình 1.7: Mặt cắt ngang của bào tử Bacillus[124].
Bào tử không được hình thành trong suốt hoạt động tăng trưởng và phân chia tế bào. Nội bào tử chỉ hình thành khi tế bào bắt đầu đi vào pha ổn định và trong điều kiện môi trường bất lợi thường thiếu dinh dưỡng hoặc sinh ra các sản phẩm trao đổi chất có hại. Thông thường mỗi tế bào chỉ hình thành một bào tử và sau khi trưởng thành bào tử được phóng thích ra khỏi tế bào. Ở bào tử trưởng thành không diễn ra quá trình trao đổi chất (được xem như ở trạng thái ngủ), có khả năng chịu đựng điều kiện môi trường khắc nghiệt như nhiệt độ (có thể sống sót sau khi đun sôi vài giờ), phóng xạ, acid, chất tẩy….Vì vậy sự hình thành nội bào tử là cơ chế đảm bảo cho sự sống còn của vi khuẩn