Thử nghiệm khả năng chịu muối của vi khuẩn
Mục đích của chủng này là xác định khoảng chịu muối của các chủng vi khuẩn để áp dụng trong nuôi trồng thủy sản [6], [16], [51].
Cách thực hiện:
- Môi trường LB bổ sung NaCl với các nồng độ: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6% - Hoạt hóa các chủng vi khuẩn thử nghiệm ở 30o
- Điều chỉnh thể tích canh khuẩn cho vào các ống nghiệm chứa LB sao cho mật độ vi khuẩn sau cùng đạt 106
cfu/ml - Nuôi cấy lắc ở 30o
C, đo OD600 để xác định mật độ vi khuẩn sau 24giờ.
Thử nghiệm khả năng chịu pH
Mục đích nhằm xác định khoảng pH mà chủng vi khuẩn tuyển chọn có khả năng chịu đựng trong môi trường nuôi trồng thủy sản [6], [16], [51].
Cách thực hiện:
- Môi trường BHI được điều chỉnh theo các giá trị pH: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Giá trị pH được điều chỉnh bằng dung dịch HCl 0,5M và NaOH 1M
- Hoạt hóa các chủng vi khuẩn thử nghiệm ở 30o
C/ 24giờ
- Điều chỉnh thể tích canh khuẩn cho vào môi các ống nghiệm BHI sao cho mật độ vi khuẩn sau cùng đạt 106
cfu/ml
- Nuôi cấy lắc ở 30oC, đo OD600 để xác định mật độ vi khuẩn sau 24giờ.
Thử nghiệm nhiệt độ
Nhằm xác định khoảng nhiệt độ thích hợp cho các chủng tuyển chọn tồn tại và phát triển [16].
Cách thực hiện:
- Môi trường BHI được hấp tiệt trùng
- Hoạt hóa các chủng vi khuẩn thử nghiệm ở 30o
C/ 24giờ
- Điều chỉnh thể tích vi khuẩn cho vào môi các ống nghiệm BHI sao cho mật độ vi khuẩn sau cùng đạt 106
cfu/ml. - Ủ ở các nhiệt độ 25, 30, 35, 40o
C, đo OD600 để xác định mật độ vi khuẩn sau 24 giờ
2.3.7.2 Thử khả năng chịu đựng pH dạ dày và muối mật
Khả năng sống sót trong điều kiện acid thấp trong dạ dày và muối mật trong đường ruột để từ đó hình thành khuẩn lạc, tăng khả năng kết dính trong đường ruột. Đây là tiêu chí quan trọng của chủng vi sinh vật được sử dụng làm probiotic.
Vi khuẩn tạo bào tử sẽ có khả năng chịu đựng và tồn tại trong một thời gian dài ở điều kiện bất lợi. Do đó chủng vi khuẩn trước khi sử dụng được hoạt hóa trên môi trường DSM (Difco Sporulation Medium) vài ngày trước khi sử dụng.
Thử khả năng chịu đựng acid dạ dày
Cách tiến hành:
- Vi khuẩn khảo sát được cấy ria trên môi trường DSM ủ 3-5 ngày để tạo bào tử. - Thu lấy sinh khối, huyền phù trong dung dịch đệm PBS.
- Chuyển dịch huyền phù vào ống nghiệm có chứa 10 ml dung dịch BHI có pH lần lượt là 2 và 3 (giá trị pH được điều chỉnh bằng dung dịch HCl 0,5M) sao cho mật độ vi khuẩn cuối cùng đạt khoảng 106
cfu/ml.
- Tại các thời điểm 0h, 1h, 2h, 3h, 6h hút 1ml dịch vi khuẩn ly tâm 8000v/p trong 10 phút, thu cặn, rửa cặn bằng dung dịch đệm PBS.
- Pha loãng đến mật độ đếm được trong PBS.
- Hút 50 μl dịch ở 3 nồng độ liên tiếp cấy trải trên môi trường BHIA, mỗi độ pha loãng cấy 3 đĩa.
- Ủ 300
C/ 24 giờ. Đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch - % sống sót được tính: lgNi/lgNO x 100%
Ni: số khuẩn lạc sau thời điểm i (h) nuôi cấy
NO: số khuẩn lạc ở thời điểm 0 (h) [15], [33], [59], [71], [89].
Thử khả năng chịu đựng muối mật
Cách tiến hành:
- Vi khuẩn khảo sát được cấy ria trên môi trường DSM, ủ 3-5 ngày để tạo bào tử. - Thu lấy sinh khối, huyền phù trong dung dịch đệm PBS
- Chuyển dịch huyền phù vào ống nghiệm có chứa 10 ml dung dịch BHI có nồng độ muối mật 0,5; 1; 2%, sao cho mật độ vi khuẩn cuối cùng đạt khoảng 106 cfu/ml.
- Tại các thời điểm 0h, 1h, 2h, 3h, 6h hút 1ml dịch vi khuẩn ly tâm 8000v/p trong 10 phút, thu cặn rửa cặn bằng dung dịch đệm PBS.
- Pha loãng đến nồng độ đếm được trong PBS.
- Hút 50 μl dịch ở 3 độ pha loãng liên tiếp cấy trải trên môi trường BHIA, mỗi độ pha loãng cấy 3 đĩa.
- Ủ 300
C/ 24 giờ. Đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch - % sống sót được tính: lgNi/lgNO x 100%
Ni: số khuẩn lạc sau thời điểm i (h) nuôi cấy
NO: số khuẩn lạc ở thời điểm 0 h [15], [33], [59], [71], [89].