Đang tải... (xem toàn văn)
1 MỞ ĐẦU Với xu hƣớng phát triển của ngành dƣợc, các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học từ cây cỏ, động vật, đặc biệt là từ nọc các động vật nhƣ rắn, bò cạp, ong… đã và đang đƣợc nghiên cứu dùng làm thuốc để chữa bệnh. Trên thế giới đã có các nghiên cứu các toxin từ nọc độc động vật nhƣ Crotamine - một polypeptide đƣợc phân lập từ loài rắn đuôi chuông Nam Mỹ Crotalus durissus terrificusas có tác dụng gây giảm đau cao hơn khoảng 500 lần so với morphine hoặc Hannalgesin - một neurotoxin chuỗi dài phân lập đƣợc từ loài rắn Ophiophagus hannah, độc tố thần kinh này có tác dụng tạo ra giảm đau trong phạm vi liều 16–32 ng/g mà không gây ra bất kỳ rối loạn thần kinh hoặc cơ [1]. Ngoài tác dụng gây giảm đau thì các toxin còn có khả năng gây độc tế bào khối u nhƣ hoạt tính gây độc tế bào của cytotoxin 1 (CTX1) - 6,7 kDa từ nọc rắn hổ mang Naja atra Cantor lên bốn dòng tế bào khối u theo thứ tự MCF-7> P388 ≈ K562> H22 ≈ 16HBE (dòng tế bào ngƣời bình thƣờng) đã phản ánh tính chọn lọc của hoạt tính từ toxin này [1]. Bên cạnh nọc rắn thì nọc bò cạp chứa nhiều các polypeptide toxin, có tác động lên các receptor và các kênh ion của màng tế bào, đã và đang đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu để điều chế ra các loại thuốc chữa bệnh nhƣ Parkinson, bệnh cao huyết áp, ung thƣ, Alzheimer [2 - 7]. Ngày nay, những vấn đề về đột quỵ, mất máu, chậm đông máu, thiếu máu não, hoặc bệnh ung thƣ đang là vấn đề đƣợc rất nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm, trong đó có cả Việt Nam. Việt Nam với nguồn nguyên liệu dồi dào về nọc bò cạp và nọc rắn, và cũng đã có những công trình nghiên cứu về nọc độc của hai loài này. Kết quả nghiên cứu từ nọc bò cạp Heterometrus laoticus cho thấy nọc thô và các phân đoạn có hoạt tính giảm đau, kháng viêm, độc tính với côn trùng. Từ phân đoạn 4 của nọc bò cạp Heterometrus laoticus ngƣời ta đã phân lập đƣợc toxin Hetlaxin có ái lực mạnh với kênh K v 1.3, còn từ phân đoạn 5 có độc tính với côn trùng của nọc bò cạp này ngƣời ta đã phân lập đƣợc một dipeptide đó là Leu-Trp [8]. Bên cạnh đó, ngƣời ta đã xác định các phân đoạn 2, 4 và 5 của nọc bò cạp H. laoticus còn có hoạt tính chống đông máu [9]. Bên cạnh các nghiên cứu nọc bò cạp, thì nọc rắn cạp nong Bungarus fasciatus cũng đã có những công trình nghiên cứu. Những kết quả đã công bố cho thấy nọc thô và các phân đoạn từ loài rắn này có hoạt tính giảm đau, kháng viêm, chống đông máu [10-11]. Để thừa kế và phát triển những nghiên cứu về nọc bò cạp H.laoticus và nọc rắn cạp nong B.fasciatus, tác giả của luận án này đã tiến hành đề tài: “ Phân lập toxin có hoạt tính chống đông máu từ nọc bò cạp Heterometrus laoticus và toxin có hoạt tính giảm đau, kháng tăng sinh tế bào ung thƣ từ nọc rắn Bungarus fasciatus”. Mục tiêu của luận án là phân lập một số toxin có các hoạt tính kể trên từ nọc bò cạp H.laoticus, nọc rắn B.fasciatus và xác định cấu trúc của chúng, nhằm tìm kiếm ứng dụng của chúng trong y dƣợc. Đề tài này có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao, hứa hẹn sẽ có nhiều đóng góp mới vào việc nghiên cứu thành phần toxin và hoạt tính sinh học của nọc độc động vật, một lĩnh vực mới và chƣa có nhiều công trình nghiên cứu ở Việt Nam.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - TRẦN VŨ THIÊN PHÂN LẬP TOXIN CĨ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐƠNG MÁU TỪ NỌC BỊ CẠP HETEROMETRUS LAOTICUS VÀ TOXIN CĨ HOẠT TÍNH GIẢM ĐAU, KHÁNG TĂNG SINH TẾ BÀO UNG THƢ TỪ NỌC RẮN BUNGARUS FASCIATUS LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC TP.Hồ Chí Minh – 2021 iii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan…………………………………………………………………… ……i Lời cảm ơn…………………………………………………………….………… … ii Mục lục……………………………………………………………………… … iii Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt………………………………………… viii Danh mục bảng……………………………………………………… …… … xi Danh mục hình vẽ, đồ thị………………………………………… ………… …xiii MỞ ĐẦU…………………………………………………………………… … CHƢƠNG TỔNG QUAN…………………………………………….……… … 1.1 Giới thiệu bò cạp……………………………………………….……… … 1.2 Giới thiệu chung rắn…………………………………………………… … 1.2.1 Giới thiệu rắn cạp nong……………………………………… …… … 1.2.2 Phân bố sinh thái……………………………………………………… … 1.3 Tình hình nghiên cứu nọc bị cạp…………………………… ……… … 1.3.1 Tình hình nghiên cứu nọc bị cạp giới…………………… … 1.3.2 Tình hình nghiên cứu bị cạp Việt Nam……………………………… ….11 1.4 Tình hình nghiên cứu nọc rắn………………………………….……… ….12 1.4.1 Tình hình nghiên cứu nọc rắn giới ………………………… ….12 1.4.2 Những nghiên cứu rắn cạp nong Việt Nam…… …… ………… ….24 CHƢƠNG PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM………… ….27 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu……………………………………………………… ….27 2.1.1 Khảo sát phân lập chất có hoạt tính chống đơng máu từ nọc bị cạp H laoticus………………… ………………………………… ….27 2.1.2 Khảo sát phân lập chất có hoạt tính giảm đau, kháng tăng sinh tế bào ung thƣ từ nọc rắn cạp nong B fasciatus……………… … ….27 2.2 Thiết bị nghiên cứu………………………………………………………… ….27 2.3 Phƣơng pháp phân lập xác định toxin từ nọc bò cạp H laoticus…… 28 iv 2.3.1 Sơ đồ tách, làm xác định toxin từ nọc bò cạp H laoticus…… ….28 2.3.2 Tách protein nọc bò cạp H laoticus sắc ký lọc gel cột với Sephadex G-50…………………………………………………… ….29 2.3.3 Phân tách phân đoạn nọc bò cạp H laoticus sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo (RP-HPLC)………………………………………… ….31 2.3.4 Khảo sát tác động phân đoạn thứ cấp phân đoạn nọc bị cạp H laoticus lên q trình đông – chảy máu………………………… ….32 2.3.5 Phƣơng pháp xác định cấu trúc hợp chất có hoạt tính chống đơng máu ….38 2.4 Phƣơng pháp phân lập xác định toxin từ nọc rắn cạp nong B fasciatus ….38 2.4.1 Sơ đồ tách, làm xác định toxin từ nọc rắn cạp nong B fasciatus ….38 2.4.2 Tách protein nọc rắn cạp nong B fasciatus sắc ký lọc gel gel Superdex HR75 .39 2.4.3 Khảo sát KLPT phân đoạn tách từ nọc rắn cạp nong B fasciatus phƣơng pháp điện di…………………………………… 2.4.4 Khảo sát tác dụng giảm đau…………………………………………… ….41 ….44 2.4.4.1 Khảo sát tác dụng giảm đau ngoại biên nọc rắn cạp nong B fasciatus toàn phần phân đoạn ……….………….…………… ….45 2.4.4.2 Khảo sát tác dụng giảm đau trung ƣơng nọc rắn cạp nong B fasciatus toàn phần phân đoạn ………………………………… …46 2.4.5 Tách phân đoạn thứ cấp phân đoạn BF4 nọc rắn cạp nong B fasciatus sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo (RP-HPLC)………… …48 2.4.6 Khảo sát hoạt tính giảm đau số phân đoạn thứ cấp tách từ phân đoạn BF4……………… ………………………………………… …49 2.4.7 Phân tích thống kê kết thử hoạt tính giảm đau…………………… …50 2.4.8 Phƣơng pháp xác định KLPT protein có hoạt tính giảm đau……… …50 2.4.9 Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ nọc thô phân đoạn rắn cạp nong B fasciatus theo phƣơng pháp MTT…………………… .…51 v 2.4.10 Phƣơng pháp xác định cấu trúc hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào …55 2.4.10.1 Xác định KLPT dựa MALDI TOF/TOF MS ……………… …55 2.4.10.2 Xác định trình tự amino acid dựa LC-MS/MS.………… … 55 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN…………… ….57 3.1 Kết bò cạp H laoticus……………………………………… ….57 3.1.1 Sắc ký lọc gel nọc bò cạp H laoticus………………….……….……… ….57 3.1.2 Tách phân đoạn nọc bò cạp H laoticus sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo (RP-HPLC) ……………………….…………………………… ….59 3.1.3 Tác động phân đoạn thứ cấp phân đoạn nọc bò cạp H laoticus lên q trình đơng - chảy máu……………………………… …… ….60 3.1.4 Làm hợp chất có hoạt tính chống đông máu từ phân đoạn 5.5 5.22……….………………………………………………………………… ….63 3.1.4.1 Làm phân đoạn 5.5 …………………………………………… .63 3.1.4.2 Làm phân đoạn 5.22 ……………………………… ………… ….64 3.1.5 Hoạt tính chống đông máu phân đoạn hợp chất sạch: 5.5.1, 5.22.3, 5.21.1 (dipeptide Leu – Trp)……………………………… … ….65 3.1.6 Xác định cấu trúc chất có hoạt tính chống đông máu (5.5.1 5.22.3) từ phân đoạn 5.5 5.22 MS NMR………… …………… 69 3.1.6.1 Cấu trúc toxin 5.5.1…………………………………………… 69 3.1.6.2 Cấu trúc toxin 5.22.3 ………………………………………… …72 3.2 Kết rắn cạp nong B fasciatus…………………………… … ….75 3.2.1 Sắc ký lọc gel nọc rắn cạp nong B fasciatus…………… … ….75 3.2.2 Xác định KLPT phân đoạn tách từ nọc rắn cạp nong B fasciatus phƣơng pháp điện di ….76 3.2.3 Tác dụng giảm đau ngoại biên nọc rắn cạp nong B fasciatus toàn phần phân đoạn………………… ………………………………… ….78 3.2.4 Tác dụng giảm đau trung ƣơng nọc rắn cạp nong B fasciatus toàn phần phân đoạn………………….…………… ……………….…… ….79 3.2.5 Phân tách phân đoạn BF4 từ nọc rắn cạp nong B fasciatus có hoạt vi tính giảm đau sắc ký lỏng hiệu cao (RP-HPLC)….……………… ….81 3.2.6 Hoạt tính giảm đau số phân đoạn thứ cấp phân đoạn BF4 ….81 3.2.6.1 Giảm đau ngoại biên………………………………… …………… ….81 3.2.6.2 Giảm đau trung ƣơng………………………………… ………… ….84 3.2.7 Xác định KLPT protein BF4.11 protein BF4.12 có hoạt tính giảm đau……… …………………………… …………….… ….86 3.2.8 Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ nọc rắn cạp nong B fasciatus………………………………………………………….…………… ….87 3.2.8.1 Khả gây độc tế bào ung thƣ vú MCF-7 nọc thô (BF) phân đoạn (BF1 – BF5) ……………………………………….……… ….87 3.2.8.2 Khả gây độc tế bào ung thƣ phổi A549 nọc thô (BF) phân đoạn (BF1 – BF5) ……………………….…………………… ….89 3.2.9 Phân lập phân đoạn BF3 sắc ký lỏng hiệu cao (RP-HPLC) ….91 3.2.10 Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ vú MCF-7 ung thƣ phổi A549 phân đoạn thứ cấp (BF3.1, BF3.2, BF3.3, BF3.4) từ phân đoạn BF3… ….92 3.2.10.1 Khả gây độc tế bào ung thƣ vú MCF-7 phân đoạn thứ cấp (BF3.1, BF3.2, BF3.3, BF3.4) …………………………………… ….92 3.2.10.2 Khả gây độc tế bào ung thƣ phổi A549 phân đoạn thứ cấp (BF3.1, BF3.2, BF3.3, BF3.4)…………………………………… ….94 3.2.11 Khả gây độc tế bào thƣờng HK2 ngƣời nọc thô (BF), phân đoạn (BF1 – BF5) phân đoạn thứ cấp (BF3.1, BF3.2, BF3.3, BF3.4)……………………………………………………………………… 96 3.2.12 Xác định cấu trúc bậc (trình tự amino acid) protein 3.3 có hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ vú MCF-7 ung thƣ phổi A549………… ….97 3.2.12.1 Xác định KLPT BF3.3 dựa MALDI TOF/TOF MS … ….97 3.2.12.2 Xác định trình tự amino acid protein 3.3 dựa LCMS/MS…………………………………………………………………… ….98 KẾT LUẬN ………………………………………………………… 101 vii KIẾN NGHỊ…………………………………………………………… ……… 103 DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ XUẤT BẢN………………………………… 104 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………….…………… .106 PHỤ LỤC………………………………………………………………………… .118 viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh 3FTx ADP Three – Finger Toxin Adenosine di phosphate aPTT Activated partial thromboplastin time Adenocarcinoma human alveolar basal A549 B fasciatus BF BF – CT BF – LAAO epithelial cells Bungarus fasciatus Bungarus fasciatus Bungarus fasciatus Cytotoxin oxidase Bungarus fasciatus Phospholipase A2 BFV Bungarus fasciatus venom BF1 - BF5 Fraction – Fraction BF3.1 - BF3.4 Fraction 3.1 – Fraction 3.4 cDMEM Rắn cạp nong Bungarus fasciatus – L - amino acid BFPA C Diễn giải Nọc rắn cạp nong tồn phần (thơ) Phân đoạn đến (sau chạy sắc ký lọc gel nọc rắn cạp nong) Phân đoạn thứ cấp 3.1 đến 3.4 phân đoạn (sau chạy sắc ký pha đảo nọc rắn cạp nong) Cell viability (% of control) Lƣợng tế bào sống (%) Concentration (µg/mL) Nồng độ (µg/mL) Control Chứng Complete Dulbecco's Modified Eagle Medium Da DMSO Daltons Dimethyl sulfoxide ĐC Standard drug Đối chứng ix EAC Ehrlich ascites carcinoma EC50 Half maximal effective concentration EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ESI-MS FBS FDA H laoticus HPLC IC50 Electrospray ionization mass spectrometry Fetal Bovine Serum Food and Drug Administration Heterometrus laoticus High Performance Liquid Chromatography The half maximal inhibitory concentration Nồng độ hiệu trung bình Bị cạp đen Nồng độ ức chế 50% IL Interleukin kDa KiloDalton KLPT Molecular mass Khối lƣợng phân tử, Da LD LD50 Lethal dose Mean lethal dose Liều tử vong Liều tử vong trung bình MALDI MCF-7 MS MTT Matrix-assisted laser desorption/ionization Michigan Cancer Foundation Mass spectroscopy 3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-teyrazolium bromide MW Molecular weight nAChRs Nicotinic Acetylcholine receptors NB NMR P PAGE PBS Peripheral Nuclear Magnetic Resonance Probability Polyacrylamide gel electrophoresis Photphat buffer saline PĐ Fraction Thuốc thử MTT Phân tử lƣợng trung bình, g/mol Ngoại biên Độ tin cậy Phân đoạn (sau chạy sắc ký) x PL Phụ lục PLA2 Phospholipase A2 PT Q-TOF Prothrombin time Quardrupole - Time of flight RPC SDS Sephadex G-50 Reversed phase chromatography Reversed phase - High Performance Liquid Chromatography Sodium dodecyl sulfate Sephadex G series number 50 Superdex HR75 Superdex High Resolution 75 TB TE TFA TNF TOF TT TW UV Cell Trypsin/EDTA Trifluoroacetic acid Tumor necrosis factor Time of flight Thrombin time Central Ultra Violet Tế bào Vinj X-Ray Volume Injections X-radiation Thể tích tiêm RP-HPLC Trung ƣơng Tia cực tím xi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Cấu trúc bậc chất ức chế ion quan trọng từ bò cạp……….… Bảng 1.2 Một số hợp chất/peptide có hoạt tính từ nọc bò cạp…………………………… 10 Bảng 1.3 Cấu trúc chuỗi amino acid thuốc chế tạo từ thành phần nọc độc rắn thị trường thử nghiệm lâm sàng……………………………………… ……13 Bảng 1.4 Thuốc từ nọc rắn thị trường thử nghiệm lâm sàng……………… ……15 Bảng 1.5 Một số toxin phân lập từ loài cạp nong – cạp nia……………………… 16 Bảng 1.6 Ứng dụng nọc thơ/toxin phân lập từ lồi cạp nong – cạp nia………….…17 Bảng 2.1 Thành phần gel……………………………………………………………….….42 Bảng 2.2 Thành phần dung dịch xử lý protein…………………………………………….….43 Bảng 2.3 Thành phần dung dịch đệm chạy điện di……………………………………….….43 Bảng 2.4 Thành phần dung dịch nhuộm Comassie Blue R-250……………………………43 Bảng 2.5 Thành phần dung dịch giải nhuộm………………………………………… …… 44 Bảng 3.1 Khối lượng phân đoạn nọc bò cạp H laoticus sau chạy lọc gel …….….57 Bảng 3.2 Thời gian chảy máu phân đoạn có tác động chống đơng máu từ nọc thơ bị cạp H laoticus … ………………………………………….………………………… 58 Bảng 3.3 Thời gian đơng máu phân đoạn có tác động chống đơng máu từ nọc thơ bị cạp H laoticus …………………………………………… ……………………… ….59 Bảng 3.4 Thời gian chảy máu phân đoạn thứ cấp có hoạt tính từ PĐ5 nọc bò cạp H laoticus ………………………………………………………….…………… ……… 61 Bảng 3.5 Thời gian đông máu phân đoạn thứ cấp có hoạt tính từ PĐ5 nọc bị cạp H laoticus ………………………………………………………………………………… 62 Bảng 3.6 Ảnh hưởng hợp chất khảo sát lên q trình đơng máu………… ……65 Bảng 3.7 Ảnh hưởng hợp chất khảo sát lên trình chảy máu……………… 66 Bảng 3.8 Ảnh hưởng 5.22.3 lên thời gian chảy máu………………………………… 67 Bảng 3.9 Ảnh hưởng 5.22.3 lên thời gian đông máu ………………………… ………68 Bảng 3.10 Số liệu phổ NMR hợp chất 5.5.1 hợp chất tham khảo……………… 70 Bảng 3.11 Số liệu phổ NMR hợp chất 5.22.3 hợp chất tham khảo…………… …74 Bảng 3.12 Khối lượng phân đoạn nọc rắn B fasciatus sau chạy sắc kí lọc gel .76 131 Phụ lục 9: Phổ 1H-NMR 13C-NMR Adenosine (Tham khảo BMRB) 132 Phụ lục 10: Phổ 1H-NMR 13C-NMR 5.22.3 Phổ 1H-NMR 5.22.3 133 134 135 Phổ 13C-NMR 5.22.3 136 137 Phụ lục 11: Phổ HR-ESI-MS/MS protein 4.11 138 Phụ lục 12: Phổ HR-ESI-MS/MS protein 4.12 139 Phụ lục 13: Kết khảo sát khả kháng tăng sinh tế bào nọc thô (BF) phân đoạn (BF1 – BF5) lên tế bào ung thƣ vú MCF-7 ung thƣ phổi A549 sau 24 h, 48 h 72 h (* р